バイオフィルムと生息地異質の共同開発を特徴付けるための方法

サマリー

バイオフィルムは、周囲の環境と複雑な相互作用を持っています。バイオフィルムと環境の相互作用を包括的に研究するために、バイオフィルム開発のための不均一な化学環境を作り出すための一連の方法、局所的な流速の定量化、およびバイオフィルムコロニー内および周囲の物質輸送を分析するための一連の方法を紹介します。

要約

バイオフィルムは、複雑な構造を持ち、重要な空間的不均一性を生成する表面結合微生物群集である。バイオフィルムの開発が強く、周囲の流れおよび栄養環境によって調節される。バイオフィルムの成長はまた、複雑な流れ場と溶質輸送パターンを生成することによって、局所微小環境の不均一性を増大させる。バイオフィルムとそのローカルマイクロ生息地間のバイオフィルムとの相互作用における異質の開発を調査するために、我々は緑膿菌とP.のデュアル種のバイオフィルムのモノ種のバイオフィルムを成長したマイクロ流体フローセル中の栄養勾配下緑膿菌、大腸菌 。我々は、フローセル内の栄養勾配を作成するために成長し、これらの条件下で、バイオフィルム発生を可視化するための詳細なプロトコルを提供する。また私たちは現在、バイオフィルム構造で空間パターンを定量化するための光学的方法の一連のためのプロトコル、フローdistriバイオフィルム上butions、および大量輸送の周りや生物膜コロニー内。これらのメソッドは、バイオフィルムと生息地の異質の共同開発の総合的な調査をサポートしています。

概要

細胞外ポリマーマトリックス¹で囲まれた細胞凝集物-微生物は、表面およびフォームバイオフィルムに付着する。バイオフィルムは、内部溶質移動の制限と細胞代謝^2,3における空間的変化の組み合わせから得られる劇的な空間的不均一性を持っているので、バイオフィルムは、非常に異なる個別の微生物細胞から振る舞う。酸素と栄養素濃度が大幅にバイオフィルムと流体と、さらにバイオフィルム²における内枯渇取得周囲の間の界面に減少する。バイオフィルム呼吸およびタンパク質合成の空間変動もローカライズ酸素および栄養素利用²に対する応答として生じ得る。

水生および土壌環境では、ほとんどの細菌はバイオフィルムに住む。ナチュラルバイオフィルムは、炭素と窒素を循環し、金属^4,5の削減などの重要な生物地球化学的処理を行う。臨床的には、バイオフィルム形成はRESPONSです長期の肺と尿感染症の⁶のためible。バイオフィルム中の細胞はそれらのプランクトン様の対応物⁶と比較して、抗菌剤に対して極めて高い耐性を有するので、バイオフィルム関連感染症は非常に問題である。バイオフィルムは、多様な設定において重要であるため、研究のかなりの量は、バイオフィルム活性とバイオフィルム中の空間的不均一性と、周囲の微小環境を制御する環境要因を理解することに焦点を当ててきた。

以前の研究では、バイオフィルムの開発が強く環境要因の数によって調節されることを見出した：バイオフィルムは、種々の流動条件下で、異なる形態を開発する。酸素と栄養素の可用性に影響を与えるバイオフィルム形態。と流体力学的せん断応力が表面に浮遊性細胞の付着とバイオフィルム^7-9からの細胞の脱離に影響を与えます。また、外部フロー条件は、基板のintの配信に影響を与えるO及びバイオフィルム¹⁰内。バイオフィルムの成長はまた、物理的および化学的条件を囲む変える。例えば、バイオフィルムの成長は、酸素と栄養²のローカル枯渇をもたらす。バイオフィルムは、周囲の環境¹¹からの無機および有機化合物を蓄積。とバイオクラスターは流れをそらすと表面摩擦^12,13を増やす。バイオフィルムは、非常に複雑な方法でその周囲の環境と相互作用するので、同時にバイオフィルムの特性および環境条件についての情報を得ることが重要であり、学際的なアプローチが包括的にバイオフィルム環境の相互作用を特徴付けるために使用される必要がある。

ここでは、課せられた栄養勾配の下でのモノ種とデュアル種のバイオフィルム内の微生物の増殖に空間パターンを特徴づけるために統合された一連の方法を提示し、局所的な化学的および流体微小環境の結果の変更を観察する。我々モミstは明確な化学勾配下バイオフィルムの成長を観察するための最近開発されたダブルインレットマイクロ流体フローセルの使用を記載している。次に、栄養条件の範囲の下でバイオフィルム中の細菌は、 緑膿菌、大腸菌 、2種の成長を観察するために、このマイクロ流体フローセルの使用を示す。我々は、バイオフィルムコロニーへの蛍光トレーサーの伝播のインサイチュ可視化定量的バイオフィルムにおける溶質輸送のパターンを評価するために使用できる方法を示す。最後に、共焦点顕微鏡下で行う、どのマイクロ粒子追跡速度測定を示し、成長したバイオフィルムの周りに局所的な流れ場を得るために使用することができる。

プロトコル

1.フローセルセットアップおよび接種

注：Song らに記載されてダブルインレットマイクロ流体フローセルを使用し、2014年¹⁴バイオフィルムを成長させる。。このフローセルは、明確に定義された滑らかな化学的勾配を作成することができる。フローセルの設計は、 図1に示されており、電池の製造は、以前Song らに記載されて流れている。、2014 ^14。P.を使用してここで詳細に我々の方法を緑膿菌とE.大腸菌は、バイオフィルムを形成するが、他の種にも適切であり得る。我々はPを使用構成的バイオフィルム発生のためのモデル生物として、緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現する緑膿菌 PAO1- のgfp。さらに、当社は、Eを使用大腸菌DH5αP.と混合種のバイオフィルムを形成するために緑膿菌。P.緑膿菌とE.大腸菌株はLB寒天プレート上で増殖させた。

1. a側にポリジメチルシロキサン（PDMS）を使用して、結合したフローセルを準備¹⁴に記載されているように、酸素プラズマ処理を介してカバーガラス。フローセルチャンバーの寸法は、0.24ミリメートル（奥行き×幅×長さ）×13ミリメートル×23ミリメートルである。
2. 修正されたFAB成長培地^15を準備します。 、フローセル内の栄養勾配の下でのバイオフィルムの成長を観察する一つの入口で0.6μMグルコースを培地に変更FAB ^15を紹介し、他の入口から任意の炭素源なしFAB培地を導入する。フィルター滅菌し（孔径=0.2μm）でのグルコースストック溶液（60 mM）のFAB培地に​​添加する前に。使用前に、また、サイクル1（121℃、17 psiの液体、15分）を有するFAB培地をオートクレーブ。
3. フローシステムを滅菌する。接種の前に、流路全体（培地ボトル、チューブ、バブルトラップ、フローセル）フローセルの上流​​に位置する（使い捨て滅菌済み）プラスチック三方弁を除いて、サイクル1を用いてオートクレーブ。 （スリーウェイバルブはセルcを注入するために使用されulture、蛍光トレーサー及びマイクロビーズ。）オートクレーブする前に、アルミ箔またはオートクレーブ袋ですべてのチューブおよびコネクタの開口部をカバーし、組み立て中に汚染を避けるために。
4. フローシステムを接続します。注意深くフローセルシステムの構成要素を組み立てる（フローシステムアセンブリのためのビデオを参照）、正確に流量を制御する蠕動ポンプを介してフローセルに増殖培地を提供。
5. P.のコロニーを転送することによって接種のための細胞培養を準備緑膿菌またはE. LBプレートからLBブロスの3ミリリットルに大腸菌および225rpmで、37℃で培養するO / Nを振ること。接種物として最終OD ₆₀₀ = 0.01に水を滅菌1ミリリットル中にO / N細胞培養物を希釈する。 （培養および汚染を避けるために、層流フード中の細菌を希釈する。）
6. 各細菌のための同等のOD ₆₀₀ = 0.01と1ミリリットル中に1：混在種のバイオフィルムを用いた実験では、1の比に2細菌培養を希釈。
7. フローセルを接種する。三方弁からフローセル入口に接種物1mlを注入する。注射後、細菌細胞をカバーガラスに付着させ、1時間の流れを一時停止。 （フローセルが懸濁された細胞は、カバースリップ上に沈降させるためにカバースリップ側を下に置かれていることを確認します。）
8. 1時間後、フローを再開し、3日間、各入口0.03 ml /分の一定速度でフローセルに成長培地をポンピングする。

2.共焦点顕微鏡を用いて栄養グラデーションに応じて、バイオフィルムの開発の特徴付け

注：P.緑膿菌は、構成的に発現したGFPが、Eで画像化することができる混合種のバイオフィルム中の大腸菌は、対比によって画像化されなければならない。

1. 共焦点顕微鏡を用いて3日間のバイオフィルムを観察します。代表的な結果を得るには、63Xの目的とした共焦点顕微鏡を使用してバイオフィルムを観察する。イメージング、マークの前にカバーガラス側のグリッドダブルインレットフローセル。 （このグリッドの目的は、実験者がフローセルチャンバ内の撮像領域を見つけることを可能にすることである。）
2. 、対比などSTYO 62などの緑色蛍光核酸染色などの細胞透過赤色蛍光核酸染色、10μlのを希釈、原液（1 mM）を990μlの滅菌水にしてから、ゆっくりとシリンジを用いて希釈染みを注入するために、上流側の三方弁からフローセルチャンバー。停滞フローセルを維持し、30分間、暗所で、その後15分間、結合していない汚れを洗い流すためにフローを再開。
3. 共焦点イメージングを行います。励起のための488nmアルゴンレーザーとGFP（500から535ナノメートル）と（緑色蛍光核酸染色のため、650〜750 nm）の核酸染色のためのチャネルを収集放出をアクティブにします。明るく清潔なイメージを持っているように、両方のチャネルのためのゲインおよびオフセットを調整します。 XYZと同時撮像モードを選択します。 IDENするZ-コントロールノブを使用して、フィールド内のバイオフィルムの底部と頂部をtify。 3次元画像スタックを取得するための0.5μmからのz段階を設定する。 （画像取得のための4つのラインの平均を使用して、高画質を確保するために）。
4. 三つにおける空間フローセル内のバイオフィルムの発達のパターン、画像、バイオフィルムをマッピングする複数の長手方向（x）のフローセル入口に沿って距離が、 図1に示すように、3つの横方向（y）に、課された栄養勾配に対する相対位置。

保守党蛍光トレーサーの注射によって3の特徴付け内部溶質輸送

注：そのようなCy5のような保守的な蛍光トレーサー、バイオフィルム内の溶質移動パターンを特徴付けるために使用することができる。

1. ストック溶液としてミリリットルの10mg /の最終濃度まで水でのCy5（モノ反応性NHSエステル）に溶解する。 -20℃の冷凍庫でCy5の原液を保管してください。
   注：Cy5標識が光sensitであるためIVEは、ストアは、希釈し、暗所にCy5のソリューションを注入する。
2. 蛍光トレーサーの注射の前に、（63X対物レンズを使用）共焦点顕微鏡を用いて3日間のバイオフィルムの3次元画像スタックを取る。 （バイオフィルムコロニーの広い領域は、色素の輸送での時系列の観測に最適です。）（ 図5（a）に示すように）また、イメージングのための十分に分離したコロニーを有するz平面を選択します。
3. 各Cy5の注入実験のために、20μg/ mlのCy5標識の濃度を有する注射溶液を得、滅菌水998μlの中のCy5ストック溶液2μlを希釈する。
4. 流れを一時停止し、3方弁を介して注射器を用いて、フローセルの上流​​にCy5の溶液を注入するポンプを停止する。 （これは、注入しながら流路に入るの気泡を防止することが重要である。バブルトラップが戻って注入中に開いたままにすべきである。）
5. Cy5の溶液を注入した後、バブルトラップを閉じる三方弁を調整し、再起動するフローセルに注入Cy5のソリューションを提供するポンプ。
6. XYTする共焦点撮像モードを切り替えます。同時撮像モードの下でのCy5とGFPのチャンネルをアクティブにします。定量化のために重要である、信号の飽和を避けるために、（レーザー強度、ゲイン、オフセット）Cy5の強度に共焦点設定を調整します。 （高時間分解能は、染料浸透を可視化することが好ましい。ただし、高速走査は、画像品質を低下させる。）、撮像の時間分解能および画質のバランスをとるために、適切な走査速度とライン平均値を選択する。このプロトコルの4のライン平均0.15 60Hzのフレームレートを使用。
7. （静止0.03ミリリットル/分の流速で）フローセルにCy5標識を提供するためのフローを再開。同時に時系列共焦点イメージングを開始する。
8. 放射状に2-Dの円形のバイオフィルムコロニー内のCy5強度を平均化することによりCy5の浸透を定量化する。最初のバイオクラスターのエッジを識別する、平均化するために、クラスタの2-D区間の距離マップを生成する、最後にCy5の強度の平均半径方向のパターンが浸透曲線（ 図6参照）を生成する。
   1. 計算上3.8ステップ実現するために、Biospa社（バイオフィルム空間パターン解析）ソフトウェアパッケージ（リクエストに応じて利用可能未発表、ソフトウェアパッケージとマニュアル）、または他の画像解析プログラムを使用しています。
   2. Biospa社を使用するには、まずBiospa社に設定した画像をインポートします。その後、バイナリイメージを作るために、GFPおよびCy5チャンネルのための適切なしきい値を選択します。分析/計算メニューで、高度な分析と、その後拡散分析を選択します。クラスタのエッジを定義し、関心領域（ROI）のような1つのクラスタを選択するために、多角形ツールを使用してGFPチャネルを使用。
   3. 二重拡散分析を実行するために選択されたバイオフィルムのクラスタをクリックします。拡散分析結果を保存し、検量線を用いてCy5の濃度にCy5の強度を較正する。
      1. のCy5 conceにわたってCy5の強度を測定し、Cy5の濃度の較正曲線を生成する共焦点顕微鏡下ntration勾配。 （Cy5の強度と濃度は線形の関係を有する。）

4.追跡蛍光粒子によって周囲の流れ場の特徴付け

注：蛍光ビーズのような蛍光粒子は、バイオフィルムの周りの流れ場を特徴付けるために使用することができる。バイオフィルムの周りの流れ場は、粒子追跡速度測定ソフトウェアを使用して、パーティクルの位置の時系列観測値から算出することができる。ここに示す結果はストリーム2.02ソフトウェアパッケージ^16（ソフトウェアのダウンロードとで利用できるユーザーガイドを用いて得られたhttp://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml ）。

1. 0.2％の最終固形分濃度が0.5 mlの最終容積に滅菌水で蛍光マイクロビーズ（直径約1ミクロン）で希釈する。渦は、マイクロビーズがいることを確認するよく分散されている。
2. ステップ3.3から3.5から手順以下のフローセルに希釈された蛍光マイクロビーズを注入してお届けします。粒子経路の正確なトラッキングを可能にするために、比較的低流量（0.01ミリリットル/本論文では、粒子追跡結果のための時間）を使用します。
3. 1のzスライスにおける粒子の動きを追跡し、時系列画像を撮影するモードをXYT共焦点設定を切り替える。 （1ヘルツのフレームレートは、この論文に示されている代表的な結果を得るために使用した。）を繰り返して、粒子噴射し、画像を別のzの位置における3次元流れ場を生成する。
4. 前工程の時系列（上利用可能なソフトウェアのダウンロードとマニュアルのImageJを使用してバックグラウンドの蛍光シグナル（画像セットの最初の取得画像内の信号）を減算することによって共焦点画像http://imagej.nih.gov/ij/を ）または他のプログラム。
5. ImageJのでは、画像セットの最初の画像を開き、画像セットをインポートします。プロセスの下で/画像のCalculator、画像セットから最初の画像を差し引く。前処理された画像セットを保存します。
6. ストリーム2.02においてフローベクトル、インポート時系列の共焦点画像を算出する。 「オープン·プロセスビュー」の下で、「粒子の識別」を選択し、実行します。粒子を識別するために、適切なしきい値を使用してください。 1ミクロンの粒子の最小値と最大直径のしきい値として0.5と5μmのを使用してください。
7. その後、「オープンプロセスビュー」の下に、粒子のパスを生成するために、「PTV解析パイプライン」を選択して実行。彼らは、粒子の動きを表現するかどうかを確認するために、粒子のパスを確認してください。最後に、選択して、フローベクトルマップを生成する「速度場の作成」を実行します。

結果

ダブルインレットマイクロ流体フローセルは、フローチャンバー内の2つの溶液を混合することにより形成された、明確に定義された化学勾配下でのバイオフィルムの成長の観察を可能にする。得られた化学勾配が以前の染料注入により観察し、Song ら ¹⁴により詳細に特徴付けた。 図1に示すように、滑らかな濃度勾配は、横方向に形成された。濃度プロファイルは、入口付近急であり、拡散による（ 図1）の下流に緩和た。栄養勾配下でのバイオフィルムの発達を観察するために、我々は、唯一の炭素源として1つの入口に添加グルコースで定義された最少増殖培地（FAB培地）を用いた。他のすべての栄養素が均一に分布しながら、フローセルチャンバー中のグルコース濃度勾配を得た。 P.の成長緑膿菌 PAO1バイオフィルムが強くグルコースのローカル配信（ 図2）に相関していた。横グルコース濃度勾配は、入口の近くに急であったように、バイオフィルムのバイオマスは、低グルコース領域に高いグルコース領域からの劇的な減少を...

ディスカッション

バイオフィルムの化学勾配に応じて、周囲の流れの微小環境上のバイオフィルムの成長、および内部輸送の制限に起因するバイオフィルムの不均一性の影響：私たちは三つの重要なバイオフィルムと環境の相互作用を特徴づけるための方法のスイートを実証した。

まず、バイオフィルム発生のために明確に定義された化学勾配を課すことは、新規なマイクロ流体フローセルの使用を示した。フローセル内で明確に定義された化学勾配を生成するために、両方の入口に同じ流量を維持することが重要である。蠕動ポンプはよく同じ速度で成長媒体を提供するために両方の流路のために調整されていることを確認してください。また、バイオフィルムの成長の間の流路内に目詰まりがないことを確認してください。化学勾配が大幅にバイオフィルム内のバイオフィルムの成長と種間の相互作用に影響を与えたのは、このフローセルショーでデュアル種のバイオフィルムの成長の観察。化学勾配に一般的である輸送の制限、化学結合および反応、および微生物の取り込みおよび代謝^18-20の組み合わせによるバイオフィルムが成長する環境。このマイクロ流体フローセルは、単一のデ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
蠕動ポンプ	Gilson	Miniplus 3	フローセルのセットアップと接種
ポンプチューブ 0.50 mm OVC、オレンジ/イエロー	ギルソン	F117934	フローセルのセットアップと接種
三方向ストップコック スイベル オス ルアーロック付き スイベル オス ルアーロック	スミスメディカル	MX9311L	フローセルのセットアップと接種
シルガード184ソーラーパネルを作るための太陽電池カプセル化	MLソーラーLLC		フローセルのセットアップと接種
パイレックスミディアムボトル、1 L, GL45	VWR	16157-191	フローセルのセットアップと接種
C-FLEX チューブ	コールパーマー	06422-02	フローセルのセットアップと接種
1 ml TB シリンジ	BD	309659	フローセルのセットアップと接種
ポリマーチューブ	IDEX	1520G	フローセルのセットアップと接種
滅菌済み Intramedic ルアースタブアダプター	クレイ・アダムス	427564	フローセルのセットアップと接種
PrecisionGlide ニードル	BD	305195	フローセルのセットアップと接種
分光光度計	HACH		フローセルのセットアップと接種
シリンジフィルター - 滅菌済み (0.2 μm)	フィッシャーブランド	09-719A	フローセルのセットアップと接種
MAXQ シェーカー	サーモサイエンティフィック		フローセルのセットアップと接種
硫酸アンモニウム	Sigma Aldrich	A4418	成長培地
リン酸二塩基	Sigma Aldrich	RES20908-A7	増殖培地
リン酸一塩基性カリウム	Sigma Aldrich	P5655	成長培地
塩化ナトリウム	Sigma Aldrich	S7653	成長培地
塩化マグニシウム	Sigma Aldrich	M8266	成長培地
塩化カルシウム		C5670	成長培地
硫酸カルシウム二水和物	Sigma Aldrich	C3771	成長培地
硫酸鉄(II)七水和物	Sigma Aldrich	215422	成長培地
マンガン(II)硫酸塩一水和物	Sigma Aldrich	M7634	成長培地
銅(II) 硫酸塩	Sigma Aldrich	451657	成長培地
硫酸亜鉛七水和物	Sigma Aldrich	Z0251	成長培地
コバルト(II)硫酸塩七水和物	Sigma Aldrich	C6768	成長培地
モリブデン酸ナトリウム	Sigma Aldrich	243655	成長培地
	Sigma Aldrich	B6768	成長培地
デキストロース Sigma	Aldrich	D9434	成長培地
ルリア ベルタニ ブロス	Sigma Aldrich	L3022	成長培地
TCS SP2 共焦点顕微鏡	ライカ		蛍光イメージング
SYTO 62	ライフサイエンス	S11344	蛍光イメージング
Cy5	GE ヘルスケア ライフサイエンス	PA15100	蛍光イメージング
赤色蛍光 (580/605) FluoSphere	ライフサイエンス	F-8801	蛍光イメージング
BioSPA	パックマンラボ		画像処理
ImageJ	NIH		画像処理
Volocity	PerkinElmer		画像処理
ストリーム 2.02	カンテベリー		画像処理