原発腫瘍と肺転移を研究するためのMEF細胞の単離

サマリー

このプロトコルの目標は、乳房の腫瘍形成を研究することです。この技術では、マウスの乳腺腫瘍を切除し、腫瘍から初代細胞を調製します。肺転移を研究するための肺抽出プロトコルが含まれています。さらに、マウス胚からのマウス胚性線維芽細胞を分析するための別のプロトコルが含まれている。

要約

乳房腫瘍形成では、疾患の転移段階が罹患者にとって最大の脅威となります。遺伝子型が変更された正常な乳房細胞は、現在、他の組織に侵入して生存する能力を持っています。このプロトコルでは、マウス乳腺腫瘍を切除し、腫瘍から初代細胞を調製します。この手順から単離された細胞は、遺伝子プロファイリング実験に利用できます。 転移を成功させるには、これらの細胞が血管内投与、循環中の生存、離れた臓器への血管外への血管外投与、およびその新しい臓器系で生存できなければなりません。肺は乳がんの転移の典型的な標的です。肺への転移の選択性を媒介する一連の遺伝子が発見されました。ここでは、遺伝子改変マウスモデルから肺転移を研究する方法について説明します。さらに、マウス胚由来のマウス胚性線維芽細胞(MEFs)を分析するための別のプロトコルが含まれています。同じ動物種のMEF細胞は、非がん細胞の遺伝子発現の手がかりを提供します。これらの技術は、マウスの乳腺腫瘍形成、それに関連するシグナル伝達メカニズム、および胚の異常の経路を研究するのに役立ちます。

概要

転移は、乳がん¹の進行の最終段階です。これには、悪性細胞が原発腫瘍から放出され、他の臓器に播種する一連のステップが含まれます²。細胞は、血管内投与、循環中生存、遠方の臓器への血管外漏出、そしてその新しい^臓器系3で生存することができなければなりません。腫瘍形成の各ステップは、さまざまな遺伝的およびエピジェネティックな変化を通じて細胞によって厳密に制御されています⁴。乳がんの腫瘍形成のメカニズムを研究するために、マウスモデルシステムは、その短い寿命、小さなサイズ、および迅速な繁殖のために利用されてきました。がん研究でマウスモデルを使用する主な利点は、マウスモデルがヒトと共有する分子的および生理学的類似性です⁵。

確立されたマウスおよびヒトの細胞株は、乳がんの研究で広く使用されてきました。これらの細胞を使用して転移のステップに関する情報を得ることができますが、腫瘍抑制因子/がん遺伝子を持つ遺伝子操作動物モデルを使用すると、胚期から始まる腫瘍の発生と転移についてはるかに多くの情報が得られます。したがって、これらのマウスモデルを使用すると、腫瘍増殖の遺伝的および発生的制御を得ることができます。さらに、腫瘍微小環境も腫瘍細胞の遺伝子発現に重要な役割を果たしており、確立された細胞株を用いた研究で同じシナリオを模倣することは困難です。原発性ヒト乳腺腫瘍は、マウス乳腺腫瘍形成の研究にも使用できます。単離された乳房腫瘍を使用することの主な欠点は、この新しく移植された腫瘍がマウスの血管系とリンパ組織を持っていないことです。一方、乳腺腫瘍形成を研究するための遺伝的マウスモデルシステムにより、転移のステップを監視し、腫瘍微小環境を分析し、全身にアクセスすることができます⁵。

このプロトコルの全体的な目標は、マウスの乳房腫瘍形成を研究することです。乳がんは通常、脳、肺、骨に転移することが知られています。 このプロトコルにより、乳がんの肺への転移を研究するだけでなく、乳がんの原発性腫瘍細胞を単離することができます。さらに、マウス胚由来のマウス胚性線維芽細胞(MEFs)を分析するための別のプロトコルが含まれています。これらの技術は、マウスの乳腺腫瘍形成の研究に役立ちます。

プロトコル

すべてのマウスの実験は医学のLSU学校の制度的動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されたプロトコルに従って行われました。すべての機器は、切開の前にオートクレーブ処理されなければなりません。

マウス乳腫瘍からの一次細胞の作製

1. 遺伝的に、以前に^6に記載されているように自然に腫瘍を発症マウス乳癌ウイルスポリオーマミドルT抗原（MMTV-PyMTトランスジェニックマウス）を用いて操作したマウスモデルを使用してください。
2. イソフルラン（99.9％）でマウスを屠殺し、無菌環境（ 図1A）を確保するために75％エタノールをスプレー。
3. はさみで首に尿道口の領域から肌を開きます。臓器（ 図1B）への容易なアクセスを可能にするために、皮膚を突き止めます。
4. 乳腺乳房腫瘍を分離し、冷滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）（pH7.4）で（ 図1C）で洗浄しました。
5. に腫瘍を転送滅菌10センチメートル組織培養プレートと約1mm ³個に滅菌カミソリの刃やはさみでそれを切ります。その後の工程は、無菌層流フード内で行われるべきです。
6. 37℃で2時間、ロッカー上に1mg / mlの最終濃度で、無血清DMEM培地に溶解したコラゲナーゼで細断腫瘍組織をインキュベートします。遠心200×gで3分間、腫瘍組織懸濁液。
   注：コラゲナーゼインキュベーションは、組織の酵素的解離のために必須です。
7. 上清を捨て、200×gで3分間遠心分離することによってPBS（pH7.4）で沈殿物を3回洗浄します。最終洗浄後、上清をデカント。
8. 章動しながら37℃で5分間トリプシンEDTA 2mlで組織を再懸濁します。 200×gで3分間、懸濁液を遠心および洗浄を繰り返します。
9. 10センチメートルプレート上に通常の増殖培地（DMEM、10％FBS、2Xペニシリン/ストレプトマイシン）中で組織ペレットを再懸濁します。変更メディア次の3日間毎日。所望の細胞数になるまで培養細胞が得られます。
   注：約1×10 ^7個の細胞は、この手順から単離されます。 MMTV-PyMTと比較した場合、このようなMMTV-ノイのような他のマウス乳腺腫瘍形成モデルは、細胞のより低い収率を与えます。低い収量を生成モデルを使用する場合には、より長く、より大きな腫瘍および培養細胞で始めることが有益です。

2.マウスの肺抽出は肺転移を可視化します

1. 肺抽出の前に、肝臓とダイヤフラムを取り外します。肺に影響を与えずにリブを取り除きます。
2. はさみの罰金ペアで、頸静脈に近い気管の上部を開きます。
3. カテーテルを用いて、肺（ 図2A）を満たすために、気管を介して、このようなZ-修正や墨汁の1ミリリットルのような薬剤を注入します。パラフィンにZ-修正肺を埋め込みます。
4. Feketeの溶液に墨汁を注入した肺を脱染色（100ミリリットルの70％アルコールを10％緩衝ホルマリン10mlを、氷酢酸5ml）で5分間。直径≥0.5ミリメートルとセカンダリサイトで腫瘍結節を定義し、転移として結節を決定します。
   注：これにより腫瘍による気管支および細気管支閉塞に、腫瘍結節は15％、インドのインクを吸収できず、正常な肺組織は黒になり、腫瘍結節を白色⁷になります。これは、個々の腫瘍結節（ 図2B）の可視化を可能にします。

マウス胚からマウス胚線維芽細胞（MEFのを）準備3。

1. イソフルラン（99.9％）で妊娠マウスを犠牲にし、無菌環境を確保するために75％エタノールを噴霧。
2. はさみで首に尿道口の領域から皮膚を開き、子宮から胚を単離します。
3. 肌を開くときに、胚を乱さないように注意してください。
4. 子宮角を除去し、冷STEでそれらをすすぎますPBS（pH7.4）で波立たせます。
5. 非常に慎重にその胎盤から胚を分離し、氷冷PBS（pHは7.4）を含む10センチメートルプレート内の場所の胚。
6. 胚から頭部、肝臓や腸を削除し、PBS（pHは7.4）を含む12ウェル組織培養プレートに残りの部分を配置します。
7. トリプシンEDTAを含む別の12ウェルプレートに胚体を移し、滅菌カミソリの刃やはさみを使用して小片（〜1ミリメートル^3）にカット。 37℃で5分間トリプシンEDTA 5mLで細断物質をインキュベートします。
8. チョップ胚に1ミリリットルウシ胎児血清（FBS）を添加することによってトリプシンを不活性化します。遠心分離機10分間200×gでの速度で懸濁液、慎重に、上清を除去し、暖かいDMEM培地1mlでペレットを再懸濁し、20％FBSおよび2Xペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEMの10ミリリットルを（含む10 cmディッシュにすべての内容を転送）。
9. 二日間、毎日培地を変更します。文化所望の細胞までの細胞数が達成されます。

結果

動物を犠牲にするで腫瘍の進行段階は、特定の研究とIACUCガイドラインに依存します。 図1（a）、マウス乳癌ウイルスポリオーマミドルT抗原（MMTV-PyMT）と100日齢のC57BL / 6マウスでは3ヶ月で屠殺しました。皮膚ははさみで首に尿道口の領域から開放し、皮膚は、図1（b）に示すような器官への容易なアクセスを可能にするために釘付けにしました。これは、 図1（c）で得られた腫瘍への容易なアクセスを可能にしました。腫瘍から得られた一次細胞は、図1Dに可視化されます。多くの遺伝子が肺¹に乳癌転移を媒介するので、我々は、転移のプロセスを研究するために、肺（ 図2A）で抽出しました。肺は、Z-修正で膨張し、腫瘍結節を視覚化するために墨汁（ 図2B）で染色した。 図3は、マウス胚性fibrを示しています FVB系統マウス胚から単離されたoblasts。

ディスカッション

このプロトコルは、新鮮なマウス腫瘍からの一次細胞を単離するためのものです。この方法から調製された溶解物は、タンパク質、DNA及びRNA分析のために有用です。原発性乳房腫瘍由来の癌細胞は、多くの場合、脳、肺および骨¹に転移します。転移の検出のために肺を抽出する技術が含まれます。 図2Bに見られるようにインクの染みと肺を染色は腫瘍結節の可視化を可能にします。 Z定着液で肺を固定することは、私たちが肺のセクションを作成し、転移性のメカニズムを研究するのに適切な抗体で染色することができます。また、マウス胚線維芽細胞を単離するためのプロトコルも含まれています。これは、同じ動物のタイプの胚線維芽細胞に一次腫瘍細胞の遺伝子発現を比較するために有用です。

初代細胞とMEFのの製造において、最も重要なステップは、材料のミンチです。適切な内訳は、なしLOW細胞数が達成されます。低細胞数が達成されている場合は、プロトコルがまだ続くことができるが、細胞はより長い期間のために培養する必要があります..肺抽出、適切な染色および脱色に腫瘍結節の可視化を可能...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEM	HyClone	SH30243.01	4°Cで保存;C
0.05% トリプシン-EDTA	寿命  技術	25300-062	– 20 >C
コラゲナーゼ IV型	Sigma-Aldrich	C5138	– 20 °C
ヒアルロニダーゼ	Sigma-Aldrich	H3506	で保存 – 20 °C
ペン連鎖球菌	寿命	テクノロジー15140-12244444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444	C
ウシ胎児血清 (FBS)	ジェミニバイオプロダクツ	100-106	– 80 >C
Z-fix	ANATECH	#174	RTイン
ディアインク	安友		店 RT
AERRANE (イソフルラン)	Baxter	NDC 10019-773-60	RTエ
タノール		EMD AX0441-3	RT店

感染症の