生きている人間の目で圧力上昇を小柱網の対応

サマリー

シュレム管の空間内に、小柱網（TM）の移行は、眼底血圧計により、急性の圧力上昇によって誘導され、そしてスペクトル領域光コヒーレンス断層撮影法により観察することができます。この方法の目的は、 その場で生体組織における急性の圧力上昇に住ん流出路の形態学的応答を定量化することです。

要約

小柱網（TM）の機械的特性は、流出抵抗及び眼圧（IOP）の調節にリンクされています。この手法の理論的根拠は、急性IOP上昇へのTMの機械的応答の直接観察です。スキャンの前に、IOPはベースライン時とIOP上昇の間に測定されます。輪部は、ベースラインにおけるスペクトルドメイン光コヒーレンストモグラフィーによってスキャンされ、IOP上昇中（眼底血圧計（ODM）30gの力で適用されます）。スキャンは、ImageJのを使用して、房水の流出経路の可視化を強化するために処理されます。血管のランドマークは、ベースライン及びIOP上昇スキャンボリュームにおける対応する位置を識別するために使用されます。シュレム管（SC）断面積（SC-CSA）とその長軸に沿って後方より前方からSCの長さは、SCの1ミリメートルのセグメント内の10箇所に手動で測定されます。平均外壁距離（短軸長）には、その内部で割っSCの面積として計算されます。長軸の長さ。効果IOP上昇に隣接する組織の寄与を調べるために、測定は、トロピカミド点眼と平滑筋の弛緩なしとで繰り返されています。 SCへのTMの移行は、TM剛性によって抵抗されていますが、毛様体内の隣接する平滑筋への取り付けのサポートによって強化されています。この技術は、人間の眼内での生理的条件下で、in situでの圧力上昇に生きているヒトTM応答を測定する最初のものです。

概要

緑内障は、不可逆的な失明¹の世界第二の主要な原因です。上昇した眼内圧（IOP）は緑内障^2-7の存在および進行の主要な原因となる危険因子です。   IOPは、房水⁸の形成と流出とのバランスによって調節されます。最大の流出抵抗の位置はjuxtacanicular組織とシュレム管（SC）の内壁、SCと小柱網^（TM）9-11との間のインタフェースです。 TM剛性はIOPの上昇に直面してSCの崩壊の防止に寄与することができるが、Overby ら ^12は、最近でIOPの上昇につながる、細孔の形成を阻害、増加SC内皮硬化をもたらす、緑内障における遺伝子発現が変化することを実証しました緑内障の眼^13。 TMの形態および剛性はTを強調し、流出施設^14,15と相関します彼は、その生体力学的特性を測定する必要があります。

TMの原子間力顕微鏡の測定は、緑内障（4.0キロパスカル^）16のないドナーからの目と比較して、緑内障患者（81キロパスカル）から寄贈された目に上昇した剛性を示しているが、これらの測定は、解剖ex vivoでの組織で行われました。後部TMは、外側lamellatedとcribiform TM ¹⁷に挿入縦筋細胞の前方腱を介して毛様体筋に固定されています。毛様体筋（CM）活性が上昇したTM剛性^17を模倣する、TMの張りを増大させることができます。平滑筋の摂動により誘導されるSCの崩壊に抵抗の変化を観察する能力は、動物モデル¹⁸に示されています。我々は、非侵襲的に画像化する能力に遠位人間の目に住み、スペクトルドメイン光コヒーレンストモグラフィー（OCT）を使用して、SCを含むの主房水流出システムを実証しています ^{19-21。この技術を用いて、我々は、急性IOP上昇22 TMおよびSCの形態学的応答を定量化する能力を実証しました。}

本明細書に記載される方法の全体的な目標は、in situで生体組織における急性IOP上昇に住ん流出路の形態学的応答を定量化することでした。この技術は、解剖組織において行わ公開測定と比較して、TM剛性のTM及びCM内の両方収縮繊維活性の寄与を含む、生理学的条件下でTMを検査するという利点を有します。機械TM応答の観察にこの技術を適用することの理論的根拠は、それは我々が今流出抵抗とIOP規制¹³に直接リンクすることがわかっているTMの機械的挙動にそうでなければ利用できない洞察を提供してくれていることです。全体の剛性、小さなギンザケに対する収縮組織の寄与を識別するために、被験者のRTはなく、かつトロピカミドの投与による平滑筋活動の抑制とを調べました。

プロトコル

倫理声明：対象の募集が開始される前に承認が医学のピッツバーグ大学の学校の治験審査委員会から入手しました。すべての被験者は研究への参加の前に書面によるインフォームドコンセントを提供しました。

1.データ集録

1. 圧力標高
   1. 眼に0.5％のプロパラカインを一滴点眼することにより、ベースライン測定値（IOPとOCTの測定値）を取ります。有効性のために3分を待ちます。
   2. ゆっくり眼底血圧計、コホート1で30グラム、および5で、時間強膜に圧力を適用し、次のようにコホート2の10グラムは、その後、所望の（IOPおよび10月）の測定値を取ります
      1. IOP測定
         1. ベースラインIOPを測定します。 1.1節で説明したように圧力を上昇させます。
         2. コホート1では、0.5％のプロパラカインを一滴を植え付ける効果について3分を可能にし、強膜に圧力の30グラムを適用します。圧力が印加されている間、次のmanufa眼圧計を用いてIOPを測定しますcturerの指示。
         3. コホート2においては、0.5％のプロパラカインを一滴を植え付ける効果について3分を許可し、眼底血圧計を使用して強膜圧力の5グラムを適用します。製造者の指示に従って眼圧計を使用して、圧力上昇時にIOPを測定します。
            1. 5gの測定後5分待ってください。
            2. 眼底血圧計によって強膜圧力の10グラムを適用し、製造者の指示に従って眼圧計を使用して、圧力上昇時にIOPを測定します。研究レコードにIOP、条件（ すなわち、ベースラインまたは10グラム）を記録。
      2. 10月スキャン
         1. 10月スキャナの被写体を固定します。新しい主題のために患者の人口統計学的データを入力するか、または以前にスキャン対象のため10月データベースから人口統計データをリコール。
         2. 前部512×128スキャンプロトコルを選択します。映像ウィンドウに目を中央に配置します。スキャナとの間の距離を減少させます眼角膜断面画像は、スキャンウィンドウに表示されるまで、
         3. 口頭のコマンドを使用すると、鼻の方向に患者視線を向けることによって、スキャンウィンドウの中心に時間的な輪部を配置します
         4. ベースラインスキャンを取得し、品質のスキャンを確認します。許容可能な場合は、保存して、許容できない場合は、この手順を繰り返します。
            1. そこには点滅していない、との角度は、画像のエッジから離れて漂流または上部に反転することなく、ボリューム全体で可視化されている場合はスキャンを受け入れます。
         5. 、0.5％のプロパラカインを一滴を植え付ける有効性について3分を可能にし、1.3.5まで手順1.3.2を繰り返します。
         6. コホート1は、眼底血圧計により強膜圧力を30gを適用し、圧力を印加している間にスキャンを取得します。圧力を除去し、高品質のスキャンを確認します。許容可能な場合は、保存して、許容できない場合は、この手順を繰り返します。
         7. コホート2では、ophthalmodynamomにより強膜圧力を5g適用圧力が印加されている間計、及びスキャンを取得します。圧力を除去し、高品質のスキャンを確認します。許容可能な場合は、保存して、許容できない場合は、この手順を繰り返します。
         8. 目が5グラム圧力摂動から回復することができ、5分待ってください。
         9. コホート2では、眼底血圧計により強膜圧力10gを適用し、圧力を印加している間にスキャンを取得します。圧力を除去し、高品質のスキャンを確認します。許容可能な場合は、保存して、許容できない場合は、この手順を繰り返します。
         10. 研究レコードにスキャン時間、条件（ すなわち、ベースラインまたは10グラム）と場所を記録します。

2.データ処理

1. OCTに大容量のUSBストレージデバイスを接続します。 OCTの[レコード]メニューから「 エクスポート 」 を選択します。 USBドライブ上のファイルをエクスポートするためのファイルの場所を指定します。 「.zipファイル」オプションの選択を解除します。 SCのために患者名を入力してくださいエクスポートするANS、およびエクスポートするスキャンを選択します。エクスポートを開始します。
2. エクスポートが完了すると、USBドライブをアンマウントし、OCTから削除します。画像処理ワークステーションにエクスポート画像を含む大容量のUSBドライブを接続します。
3. この場合のImageJで画像処理プログラムを起動します。
4. 生の画像データをインポートします。ファイルメニューから" - - > [インポート]> [RAWファイル 」 を選択します。 「_cube_raw.img」で終わるUSBドライブから処理するとファイルを選択します。
5. 元の画像データが変更されずに保存されるように、新しい名前を使用してインポートファイルを保存します（http://www.ori.dhhs.gov/education/products/RIandImages）。
6. 次のようにインポートパラメータを入力し、画像の種類：8ビット、幅：512、高さ：1024、オフセット：0;イメージの数：128。
7. プラグインメニューから"> STACKREG - - >のR egistrationプラグイン 」を選択します。とし、 " リジッドボディを選択"オプション。整列スタックを保存するには、次に" - - >名前を付けて保存]> [TIFFファイル 」 を選択します。
8. " - >フィルタ- >平均3Dプロセス 」プロセスメニューからを選択します。フィルタオプションとしてパラメータX = 1、Y = 1、Z = 1を入力します。二回、この手順を繰り返します。
9. 平均スタックを保存する" - - >名前を付けて保存]> [TIFFファイル 」 を選択します。アクティブなスタックのフレーム1に移動し、マウスホイールを回転。
10. 「 プロセス- >ローカルコントラスト（CLAHE）強化」を選択Processingメニューからを。 31、ヒストグラムのビン：256、最大勾配：5、マスク：パラメーター·ブロック·サイズを使用しなし、および「高速」オプションをチェックします。次のフレームに進めるために、右矢印キーを使用します。
11. 局所コントラスト（CLAHE）を高める>アクティブなスタックのフレーム2に移動し、PROCESS-を繰り返します。すべてのフレームが造影を持っていたまで繰り返します。
12. " - >名前を付けて保存] - > [TIFFファイル 」 を選択します;造影スタックを保存します。イメージメニューから次に">サイズ- - >イメージ調整 」 を選択します。 「 アスペクト比を固定 」オプションの選択を解除し、その後、幅を入力します。2048、高さ：1024の値を。
13. イメージメニューから" - - >変形>垂直フリップ画像 」 を選択します。次に、「 分析- >セットスケール 」を選択し分析メニューから。 2048、既知の距離：距離をピクセル単位で入力し4,000、およびピクセル縦横比：1、し、[OK]をクリックします。 1のアスペクト比スタック：校正さ1を保存する" - - >名前を付けて保存]> [TIFFファイル 」 を選択します。
14. 視覚的にスキャン内の基準点として機能する独特の血管交差を識別するためにスキャンを検討するために、ゆっくりと、マウスホイールを回転。分析スプレッドシートの画像番号と参照フレーム番号を記録します。
15. 第1の測定フレームに移動するには、左矢印キーを15回押します。 「フリーハンドSelectionsRを選択21;ツールバーからツール。
16. SCの中央にマウスを置き、上矢印キーを押します。 SCは、画面をいっぱいになるまで、この手順を繰り返します。
17. マウスで境界線を周回して、手動でセグメントSC。現在の画像フレームのためのコントロール（CTRL）キーを押しながらDを保持します。 Ctrlキーを押しながら、Enterキーを押しM.は、解析スプレッドシートにSC断面積と測定フレーム数の測定を転写。概説エリアの選択を解除します。 3回右矢印キーを押してください。 SCは10フレームで測定されるまで、この手順を繰り返します。
18. 第1の測定フレームに戻るには左矢印をキー30回押します。
19. ツールバーから直線セグメントツールを選択します。
20. SC上の最前方に後方-ほとんどの場所から直線を引きます。現在のフレームのみの制御キーを押しながらDを保持します。分析のスプレッドシートへのコントロールキーを押しM.議事録SC長とフレーム番号を保持します。概説エリアの選択を解除します。右矢印キーを押します3回。 SC長がSC断面積と同じ10フレームで測定されるまで、この手順を繰り返します。
21. 長さの測定により面積測定を分割して外壁の距離（SC-IOWD）までの平均SC内壁を計算するために、分析のスプレッドシートに式SC-IOWD = SC-CSA /軸方向の長さを挿入します。
22. 第1の測定フレームに戻るには左矢印をキー30回押します。
23. ツールバーから直線セグメントツールを選択します。
24. 最前方小柱網及び前房の国境にSC上から直線を引きます。ラインが​​境界に垂直であることを確認してください。 M.その後、Ctrlキーを押しDを保持します
25. SCの後方最も場所とTMの境界線と前房からの線を引きます。国境に垂直なその行を確認してください。制御した後、[D]を押して、Mを保持します
26. SCおよびTMの境界と前室の中心から線を引きます。 LINていることを確認してください国境に垂直な電子。現在のフレームのみの制御キーを押しながらDを保持します。
27. 分析スプレッドシートに3 TM厚さ測定およびフレーム番号を転写します。このプレスを3回右矢印キーの操作を行います。 TMの厚さはSC断面積と同じ10フレームで測定されるまで、この手順を繰り返します。

結果

これらのデータ収集及び画像解析技術を用いて、そのようなSC断面積と流出路にIOPにおける大小の変化の影響を形態学的パラメータが得られる（ 図1）。我々は、断面積の大きな減少によって表されるようにIOP上昇の高レベルは、SCの観察可能な崩壊を作り出すことがわかります。眼は、SC-CSA（ 図1）の変化の欠如によって証明されるように、IOPの小さな増加に対応することができるように思われます。これらの結果は、技術は、急性IOPチャレンジに対する流出路の形態学的応答を定量化することが可能であることを示しています。技術や技法の他の家族は、流出路の生体力学に関する視覚的かつ定量的な情報を提供していません。

研究を通して、TM厚の有意な変化は観察されませんでした。 23 mmHgのIOPの上昇に応答して、外壁の内側の距離SCは5.03ミクロンに減少しました。 Withoutと平滑筋活性の抑制には、IOPの6 mmHgの上昇は、外壁の距離に内部SCはそれぞれ0.18ミクロンと2.34ミクロン減少していました。また、ベースラインSC...

ディスカッション

本技術は、SCの崩壊を定量化するため、軟組織の機械的応答の非侵襲的観察を利用しています。ヒト死体の目を使用して、今後の作業は、解剖後の組織のたわみを、実際の組織の剛性を校正するために必要とされます。しかし、このような研究は、以前の流出モデルの同様の制限を受けます。具体的には、組織の緊張に住んでいる筋肉の寄与が存在しないこと。生きている哺乳動物の眼のモデルのさらなる較正は、イメージング及びTMの剛性の直接測定の較正を可能にすることができます。

技術には、いくつかの制限があります。これは、他のOCTプラットフォーム上で実証されていません。文献は、同じ構造が他のOCT装置で可視化することができることを示唆している、しかし、それらのデバイス上の急性IOP上昇に関連した変化に対する感度は、人間の目には実証されていません。追加の光学部品はありませんように、本装置は、利便性の外に使用されました前眼部走査に要します。この作品への最大の課題は、スキャン中のSCの同定です。これは間違いなく、単一のスライス内のSCを特定することは不可能です。ボリュームの尋問は、最初にSCを含む組織の領域を見つけるために...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
スペクトル領域 OCT	ツァイス	シーラス
イメージングワークステーション	アップル	iMac
眼鏡計	Baillairt Matalene 眼鏡計 Surgical instruments CO., Inc.ニューヨーク州
画像処理プログラム	rsb.info.nih.gov/ij	ImageJ, FIJI