Provided is a protocol for developing a real-time recombinase polymerase amplification assay to quantify initial concentration of DNA samples using either a thermal cycler or a microscope and stage heater. Also described is the development of an internal positive control. Scripts are provided for processing raw real-time fluorescence data.
It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to quantify DNA sample concentration using a standard curve. In this manuscript, a detailed protocol for developing and implementing a real-time quantitative recombinase polymerase amplification assay (qRPA assay) is provided. Using HIV-1 DNA quantification as an example, the assembly of real-time RPA reactions, the design of an internal positive control (IPC) sequence, and co-amplification of the IPC and target of interest are all described. Instructions and data processing scripts for the construction of a standard curve using data from multiple experiments are provided, which may be used to predict the concentration of unknown samples or assess the performance of the assay. Finally, an alternative method for collecting real-time fluorescence data with a microscope and a stage heater as a step towards developing a point-of-care qRPA assay is described. The protocol and scripts provided may be used for the development of a qRPA assay for any DNA target of interest.
定量的核酸増幅は、環境、食品媒介性および水媒介性病原体の検出のためだけでなく、臨床診断のための重要な技術である。リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)核酸の感度が高く、特異的かつ定量的検出のための金の標準的な方法で、 例えば、HIV-1ウイルス負荷試験、細菌性病原体の検出、および他の多くの生物の1のスクリーニングのための– 3。リアルタイム定量PCRの間に、プライマーは、サイクル中の病原体のDNAを増幅し、そして蛍光シグナルは各サイクルにおいて、サンプル中の増幅されたDNAの量に比例して生成される。病原体DNAの未知の濃度を含有する試料は、標準試料の初期DNA濃度と蛍光シグナルが特定の閾値( すなわち、サイクル閾値、またはC T)に達した時点に関する標準曲線を用いて定量することができる。
<p class=「jove_content ">リアルタイムqPCRの結果を受信するために高価な熱サイクル装置と、数時間を必要とするので、このようなリコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)などの代替の等温増幅技術は、4開発されている。これらのプラットフォームは、一般に、より迅速な結果を提供し、より安価な、より簡単な装置を用いて達成され得るより低い、単一温度で核酸を増幅する。 、ポイントオブケア用途に特に魅力的である分でDNAを増幅するRPAは、低い増幅温度(37℃)を必要とし、不純物5,6の存在下で活性なままである。 12 – RPAアッセイbiothreat剤7の食品分析、病原体検出、癌の薬物スクリーニング、および検出を含む、広範囲の用途のために開発されている。しかし、核酸の定量化のためのRPAの使用が制限されてきた13,14。前作では、翔だったwnは、リアルタイム定量的RPA(QRPA) を15可能である。ここで、より詳細なプロトコルは、標準曲線、定量PCRを用いて定量化に類似する方法を用いて未知のサンプルを定量するためにリアルタイム定量RPAを使用するために提供される。このプロトコルは、同様に、システムが適切に機能していることを確認するために内部陽性対照(IPC)を開発する方法のように、概念実証としてHIV-1 DNAを検出するために、サーマルサイクラーにRPA反応を実行する方法について説明します。トレーニングデータを使用して標準曲線を構築するためのサーマルサイクラーや顕微鏡とデータ解析を使用して、データ収集にも詳述されている。最後に、カスタムスクリプトを使用して標準曲線を使用して、未知のサンプルを定量するための方法が示されている。このQRPA技術は、未知の濃度のサンプルの定量を可能にし、伝統的なリアルタイム定量PCRに比べて多くの利点を有する。
1.プログラムのリアルタイムQRPA反応のためのサーマルサイクラー
2. HIV-1 QRPA実験の準備
3. HIV-1 QRPA標準曲線を組み立てる
4.内部陽性対照を開発
5.複数の実験から標準曲線を構築
6.アッセイの検証と使用未知試料の定量標準曲線
蛍光顕微鏡と温水チップを使用したデータ収集のための7の準備
8.データ収集とANALY蛍光顕微鏡を用いてSIS
プロンプトが表示されたら、MATLABアルゴリズムを使用して、意味のある定量データを得るためには、ユーザは、適切な入力値を選択しなければならない。セクション5および6の各スクリプトを開始した後、すべての入力変数は自動的にコマンドウィンドウに要請され、出力は自動的に生成される。 5.7節では、ユーザーは勾配閾値を選択するよう求めている。勾配閾値の値は、適合の相関係数(rは2)の2乗に影響を与える。サーマルサイクラーからエクスポートされた未加工の蛍光データを使用する場合、2.0と5.0の間の値が高いrは2係数を生成する傾向がある。第5.8節では、ユーザは、正の閾値を設定するためのバックグラウンドを超える標準偏差の数を指定する必要があります。正または負などのサンプルを獲得するために、スクリプトが自動的にTHERMAからエクスポート生の蛍光データを使用して、各サンプルの最大値と最小蛍光との差Δ サンプルを決定Lサイクラー。これは、すべての無ターゲット対照サンプルの平均差Δの背景と標準偏差σの背景を計算します。 Δ サンプルは Δのバックグラウンドを超える σ 背景 ×Z以上であればサンプルが陽性であると考えている。 5.10節では、ユーザーはデフォルトのしきい値を使用するか、新しいしきい値を設定するかどうかを決定します。ユーザが新しいしきい値を設定したい場合には、実験的に、任意のHIV-1 DNAの存在なしに3つの実験をそれぞれ含む12 RPA反応を行うことにより、新たな閾値を決定する。これらの実験プラス3標準偏差からの蛍光強度の平均増加でしきい値を設定します。第6節を完了した後、スクリプトJoVE_qRPA_validation_and_quantification.mは自動的に(log10コピーで)各QRPA反応のための推定DNA濃度を返します。スクリプトにはHIV-1 DNAが試料中に存在しないと判断した場合には、推定濃度はどちら」数Neと表示されている内部陽性対照用の蛍光信号が閾値(σ 背景 +Δの背景 ×z)を超えたかどうかに応じて、HIVのためgative」または「無効」。ユーザーが既知のサンプル濃度の標準曲線を検証している場合、スクリプトはまた、表1と同様の追加のテーブルを返します。
正確な定量化を提供し、リアルタイムRPAアッセイを開発するために、実験的な一貫性が重要である。例えば、同一のプライマーを使用し、標準曲線と検証実験の両方のアリコートをプローブ。プライマーを格納することにより凍結融解サイクルをも回避し、℃での実験ではなく、-20〜4℃でアリコートをプローブ。標準曲線および検証実験に使用したテンプレートのアリコートを、同様に格納される。同一ロットからのRPA酵素ペレットおよび試薬は、製造業者の推奨に従って使用される。最後に、beca使用RPAは、ユーザの手順の標準化が必要不可欠であり、正確に増幅率を制御するために、真の「サイクル」を欠いている。反応を組み立てる際に、ユーザーは常に、各ステップでおよそ同じ時間を費やして、同じ順序で同じ手順に従う必要があります。反応は、常に新しいピペットチップで穏やかに混合されなければならない、と気泡が常に除去されなければならない。増幅の前に、反応は、一貫性のある温度に保持されなければならない、とサーマルサイクラーや顕微鏡ソフトウェアが常に定量化に影響を与える可能性が次善の温度での任意の増幅を回避するために、反応をロードする前に準備する必要があります。初期反応条件の任意の変化が、実験の結果の矛盾をもたらす可能性がある。
データを収集するために顕微鏡を使用する場合、追加の変数は、蛍光強度の変化を最小限にするために制御されなければならない。すべての反応は暖かいステージ上で同じ領域に配置され、かつmicroscoされなければならないPEは、すべてのサンプルについて、ウェルの同じ領域に集中する必要があります。これらの慣行に従っている場合であっても、顕微鏡で収集さ蛍光データにより自然に励起光への反復曝露に起因RPA反応は、反応チャンバー内の気泡形成、または光退色の間に形成ローカル輝点に変動を示すことができる。これらの変数の影響は、ベースラインの変動、ピーク、および谷を実証顕微鏡( 図4Aおよび4B)に集光された蛍光データで明らかである。これらの機能は、サーマルサイクラー( 図3Aおよび図3B)に集光された蛍光データは存在しない。最終的に、顕微鏡でのデータ収集は、証明の原理を目的としており、最終的なアッセイは、これらの変数を最小化するより正確な幾何学的形状およびソフトウェア制御によるフィールド操作可能な蛍光リーダー上で実施される。
もう一つの重要なQRPAアッセイ開発プロセスの側面は、データ処理の一貫性である。方法の項に記述されたプロトコルは、サーマルサイクラーまたは顕微鏡から収集(スプレッドシートファイルに格納されている)生の蛍光データを処理するスクリプトを使用する。標準曲線を構築するために使用される全ての実験は、同じようにフォーマットする必要があります。データを収集するために、サーマルサイクラーを使用する場合は、同じプレートレイアウトを使用する必要があり、かつRPA反応を含まないウェルからのデータはエクスポートしてはいけません。データを収集するために顕微鏡を使用する場合は、データの形式は自動的にサーマルサイクラーからエクスポートしたデータの形式と一致する必要があります。 D61、E2:細胞においてD2でなければならないテンプレートの濃度を増加させるためのC61、及びデータ:例えば、無ターゲット対照データがセルC2内にある必要があり、実験中の各濃度の複数の複製がある場合E61 等 第 2希釈系列が最高濃度にノーとターゲットコントロール(NTC)左から右に注文する必要があります複製し、1 番目のすぐ右に列に 保存されては希釈系列を複製。例えば、2と1.2節で使用されるプレートレイアウトで希釈系列の各サンプルの第一の反復のために蛍光データをセルC2に保存する必要があり、各サンプルに対して複製する:H61および蛍光データを各サンプルの第二の反復でのためにN61:希釈系列をセルI2に保存する必要があります。スプレッドシートにサーマルサイクラーソフトウェアからデータをエクスポートする際に、セクション1.2で使用されるプレートレイアウトの場合、これはデフォルトのフォーマットです。
HIV-1 QRPA実験から提供されている代表的なデータは、RPAは、未知の試料中の核酸濃度を定量化するために使用することができる概念実証のサポートを実証する。臨床的に有用なHIV-1ウイルス負荷試験は、大きさの少なくとも4桁の臨床範囲、0.5 log10コピーの精度、及び少なくとも200コピー19,20の限界を検出している。記載HIV-1 DNAアッセイは、これらのcrのに適合しているiteria、表1に示すように、低濃度で最も正確であるため、逆転写ステップを含めることで、これらの結果は、HIV-1 RT-RPAアッセイでHIV-1ウイルス負荷を測定する可能性を有し得ることを示唆している臨床サンプル。アルゴリズムのパラメータを調整する、QRPAアッセイを開発する際に調整する臨床的必要に応じて、感度および線形ダイナミックレンジをもよい。6(陽性サンプルのための閾値を決定するパラメータ)は、zを調整する低および高に感度および精度に影響を与えることができることを示してい標的濃度。また、それによって、増幅の速度を減少させる、より低い温度で反応をインキュベート以下酢酸マグネシウムを使用して定量化の分解能および精度を向上することが可能である。
コンセプトQRPAアッセイのこの証拠は、HIV-1 DNAを含有する試料の濃度を定量することができる。このMAに記載されてQRPAアッセイnuscriptは、リアルタイムRPA反応を組み立て開発し、IPCをスクリーニングして、未知のサンプルを定量するために用いることができる標準曲線を構築するための未加工の蛍光データを処理する方法の詳細な手順を含む。詳細な手順が含まれて、このプロトコルは、サンプルの多種多様なDNA濃度を定量するように適合され得る。
The authors have nothing to disclose.
qRPA Assay | |||
HIV-1 forward primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3’ |
HIV-1 reverse primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3’ |
HIV-1 probe | BioSearch Technologies | custom DNA oligos | 5’- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3’ |
IPC probe | BioSearch Technologies | custom DNA oligos | 5’-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3’ |
RPA exo reagents (pellets, rehydration buffer, magnesium acetate | TwistDx | TwistAmp exo | |
PCR tube strips | BioRad | TLS0801 | |
PCR flat cap tube strips | BioRad | TCS0803 | |
Micro-seal adhesive | BioRad | 558/MJ | |
HIV-1 target (pHIV-IRES- eYFPΔEnvΔVifΔVpr) | custom plasmid, see: Segall, H. I., Yoo, E. & Sutton, R. E. Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range. Molecular Therapy 8, 118–129, doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003). | ||
Human male genomic DNA | Applied Biosystems | 360486 | |
96 well cold-block | Cole Parmer | EW-36700-48 | |
Thermal cycler | BioRad | CFX96 | |
MiniFuge | VWR | 93000-196 | |
Vortex | VWR | 58816-121 | |
Tris buffer 1.0 M, pH 8.0 | EMD Millipore | 648314 | |
EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Promega | V4321 | |
Nuclease free water | Ambion | AM9937 | |
IPC Development | |||
Cryptosporidium parvum IPC template | Waterborne Inc | P102C | It is also possible to order a double stranded synthetic target from IDT if the user is unequipped to work with C. parvum (a BSL-2 infectious agent). PCR and RPA primers for C. parvum were designed using GenBank accession number AF115377.1 |
PCR long forward primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G/ ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3’ |
PCR long reverse primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G/ TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3’ |
Phusion High-Fidelty DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
TAE 10X buffer | EMD Millipore | 574797 | |
Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
Microscope Experiments | |||
Upright fluorescence microscope | Zeiss | Zeiss Imager.J1 | |
Stage heater | Bioscience Tools | TC-GSH | |
1-Channel Precision High Stability Temperature Controller | Bioscience Tools | TC-1100S | |
FAM/GFP filter cube | Zeiss | filter set 38 (000000-1031-346) | excitation BP 470/40 nm, emission BP 520/50 nm |
HEX filter cube | Chroma | 49014 | excitation BP 530/30 nm, emission BP 575/40 nm |
Laser cutter | Engraver's Network | VLS3.60 | |
1/8" black acrylic | McMaster Carr | 8505K113 | |
1.5 mm clear acrylic | McMaster Carr | PD-72268940 | |
Super glue | Office Depot | Duro super glue | |
PCR grade mineral oil | Sigma Aldrich | M8662-5VL | |
Data Analysis | |||
Microsoft Excel | Microsoft | ||
MATLAB | MATLAB | ||
MATLAB script: "JoVE_qRPA_standard_curve.m” | Included in SI | ||
MATLAB script: "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m” | Included in SI | ||
MATLAB script: "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m” | Included in SI | ||
Adobe Illustrator | Adobe | ||
JoVE_qRPA_well.ai | Included in SI | ||
JoVE_qRPA_base.ai | Included in SI | ||
AxioVision software | Zeiss | ||
JoVE_AxioVision_Script.ziscript | Included in SI |