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Summary

Provided is a protocol for developing a real-time recombinase polymerase amplification assay to quantify initial concentration of DNA samples using either a thermal cycler or a microscope and stage heater. Also described is the development of an internal positive control. Scripts are provided for processing raw real-time fluorescence data.

Abstract

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to quantify DNA sample concentration using a standard curve. In this manuscript, a detailed protocol for developing and implementing a real-time quantitative recombinase polymerase amplification assay (qRPA assay) is provided. Using HIV-1 DNA quantification as an example, the assembly of real-time RPA reactions, the design of an internal positive control (IPC) sequence, and co-amplification of the IPC and target of interest are all described. Instructions and data processing scripts for the construction of a standard curve using data from multiple experiments are provided, which may be used to predict the concentration of unknown samples or assess the performance of the assay. Finally, an alternative method for collecting real-time fluorescence data with a microscope and a stage heater as a step towards developing a point-of-care qRPA assay is described. The protocol and scripts provided may be used for the development of a qRPA assay for any DNA target of interest.

Introduction

定量的核酸増幅は、環境、食品媒介性および水媒介性病原体の検出のためだけでなく、臨床診断のための重要な技術である。リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）核酸の感度が高く、特異的かつ定量的検出のための金の標準的な方法で、 例えば、HIV-1ウイルス負荷試験、細菌性病原体の検出、および他の多くの生物の¹のスクリーニングのための^{– 3。}リアルタイム定量PCRの間に、プライマーは、サイクル中の病原体のDNAを増幅し、そして蛍光シグナルは各サイクルにおいて、サンプル中の増幅されたDNAの量に比例して生成される。病原体DNAの未知の濃度を含有する試料は、標準試料の初期DNA濃度と蛍光シグナルが特定の閾値（ すなわち、サイクル閾値、またはC _T）に達した時点に関する標準曲線を用いて定量することができる。

<p class=「jove_content ">リアルタイムqPCRの結果を受信するために高価な熱サイクル装置と、数時間を必要とするので、このようなリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（RPA）などの代替の等温増幅技術は^、4開発され^ている。これらのプラットフォームは、一般に、より迅速な結果を提供し、より安価な、より簡単な装置を用いて達成され得るより低い、単一温度で核酸を増幅する。 、ポイントオブケア用途に特に魅力的である分でDNAを増幅するRPAは、低い増幅温度（37℃）を必要とし、不純物^5,6の存在下で活性なままである。 ^{12 –} RPAアッセイbiothreat剤⁷の食品分析、病原体検出、癌の薬物スクリーニング、および検出を含む、広範囲の用途のために開発されている。しかし、核酸の定量化のためのRPAの使用が制限されてきた^13,14。

前作では、翔だったwnは、リアルタイム定量的RPA（QRPA） ^を15可能である。ここで、より詳細なプロトコルは、標準曲線、定量PCRを用いて定量化に類似する方法を用いて未知のサンプルを定量するためにリアルタイム定量RPAを使用するために提供される。このプロトコルは、同様に、システムが適切に機能していることを確認するために内部陽性対照（IPC）を開発する方法のように、概念実証としてHIV-1 DNAを検出するために、サーマルサイクラーにRPA反応を実行する方法について説明します。トレーニングデータを使用して標準曲線を構築するためのサーマルサイクラーや顕微鏡とデータ解析を使用して、データ収集にも詳述されている。最後に、カスタムスクリプトを使用して標準曲線を使用して、未知のサンプルを定量するための方法が示されている。このQRPA技術は、未知の濃度のサンプルの定量を可能にし、伝統的なリアルタイム定量PCRに比べて多くの利点を有する。

Protocol

1.プログラムのリアルタイムQRPA反応のためのサーマルサイクラー

1. サーマルサイクラーソフトウェアの新しいプロトコルを作成します。
   1. 1分間39℃：プレインキュベーションステップを挿入します。
   2. プレートの読み取りに続いて20秒間39℃：第二ステップを追加します。
   3. 最後に、第2のステップ59を複数回繰り返し、「GO TO」を挿入します。
   4. プロトコルを保存します。
2. ソフトウェアの「プレートエディタ」タブで新しいプレートを作成します。 RPA反応の位置に対応するプレート上のウェルを選択し（ここでは、利用ウェルA1、A4、A8、B1、およびB4-B8）。
   注：データ解析は、カスタムスクリプトを使用して行われるように、ウェル（ 例えば、「標準」、「NTC」）のサンプルタイプが、指定されているかどうかは重要ではない。
   1. 唯一のHIV-1 DNAを含む実験のために、すべてのウェルのための「HEX」フォアを選択します。 HIV-1 DNAと内部陽性同時を含む実験用ntrol、「HEX」と全てのウェルのための「FAM」フルオロフォアの両方を選択。プレートを保存します。

2. HIV-1 QRPA実験の準備

1. qPCRのためのように、指定されたピペット、ピペットチップ、ボルテックス、およびミニ遠心機を含む指定されたプレ増幅ワークスペースでRPA反応を組み立てます。 RPAのように、（データは示していない）の大きさだけ10として桁DNAの単一コピーを増幅処理し、指定された増幅後の領域にポスト増幅DNA産物を含むチューブを処分することができる。
   1. 前のすべての増幅試薬およびポスト増幅産物との接触を防止する。すべての実験の前と後の50％の漂白剤とのプレ増幅ワークスペースと設備をスプレーします。過剰漂白剤を拭き取るためにペーパータオルを使用してください。
2. 購入フォワードプライマー配列5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3 '及びプライマー配列5'-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTを逆転市販のDNA合成機からT GTT TTT G-3 '。プローブ配列5'-TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC購入[SIMA / HEX] GC [THF] C [DT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3 '商業的供給源から。使用前に、10μMの濃度でアリコートで4℃で全てのプライマーおよびプローブを保管してください。
   注：QRPAアッセイは、ユニークなHIV-1配列を増幅する。この概念実証アッセイのために、サットンらによって記載されたプラスミドpHIV-IRES-eYFPΔEnvΔVifΔVprを使用しています。標的配列^16を含む。 QRPA実験のために、プラスミドは、pH8.0で10mMのTris、0.1mMのEDTAを含む緩衝液中で1μl当たり1、10、10 ^{2、10 3、10 4}コピーを含有するアリコートを4℃で保存し、たは1ng / μlのヒトゲノムキャリアDNA（360486）。このキャリアDNA濃度は、HIV-1の診断¹⁷のために使用される市販の血清DNA抽出キットから得られたDNAの濃度と等価である。これらのHIV-1希釈は、標準曲線を構築するためにQRPA反応において鋳型として使用した。

3. HIV-1 QRPA標準曲線を組み立てる

1. ステップ2.1.1で説明したようにQRPA反応を組み立てる前に、プレ増幅ワークスペースを準備する。 4℃での貯蔵で96ウェル冷たいブロックを配置します。
2. 12の反応のための試薬を準備します。
   1. 酢酸マグネシウム、再水和バッファ、および増幅前のワークスペースに12 RPA反応ペレットを移動します。
   2. 酢酸マグネシウム、室温で再水和バッファーを解凍する。
   3. マイクロ遠心チューブに一定分量酢酸マグネシウムの32.5μL（反応あたり2.5μl）を。
   4. 13Xマスターミックスを調製する。マスターミックスに別々のマイクロ遠心チューブに再水和バッファーの383.5μL（反応あたり29.5μl）を追加します。マスターミックスにヌクレアーゼを含まない水の41.6μL（反応あたり3.2μl）を追加します。マスターミックスをボルテックス。
   5. マグネシウムacetaを返す-20℃での保存にTEと再水和バッファー。
   6. 光退色を最小限にするために、過度の光曝露を避け、前増幅領域に冷蔵庫からプライマーおよびプローブのアリコートを移動する。
   7. フォワード10μMの各μlの27.3を追加し、マスターミックスにプライマー（反応当たりプライマーあたり2.1μl）を逆転。
   8. マスターミックスに10μMのHEX標識HIV-1 DNAプローブの7.8μL（反応あたり0.6μl）を追加します。
   9. プライマーを返し、ストレージにプローブ。
3. 1.2節で説明したプレートレイアウトマッチング、2低層8ウェルPCRチューブストリップの5右端管のそれぞれにおける左端管のそれぞれと1酵素ペレットに1酵素ペレットを配置。
4. 慎重に各チューブのために新しいピペットチップを用いて、ペレットが完全に溶解するまで静かに先端をマスターミックス、ペレットを攪拌し、酵素ペレットを含む各チューブにマスターミックスの37.5μlを添加する。バブルを防ぐために、静かにかき混ぜformati上の、そして反応容量の損失を防ぐために慎重に先端を削除します。
5. すべての酵素ペレットは、マスターミックスで再水和された後、4℃のストレージから96ウェル冷たいブロックを取り出す。マスターミックスを冷却する低温のブロックにPCRチューブストリップを置きます。
6. マスターミックスを冷却している間、第1節で説明したプロトコルとプレートとサーマルサイクラーソフトウェアをロード。
7. PCRチューブよりも少し広くなるように透明なプラスチック製のマイクロシール接着剤の2ストリップをカットして、2フラットPCRチューブストリップの蓋を取り出す。
8. ストレージから6鋳型のアリコートを取り出し（マイクロリットル当たりHIV-1プラスミドの0、1、10 ^{1、10 2、10 3、10 4}コピーを含む）。
9. そのテンプレート濃度のために指定のチューブに各テンプレートの10μlのを追加。優しくマスターミックスとテンプレートを混合するために先端で溶液を撹拌し、各チューブのための新しいピペットチップを使用してください。 mの正しい場所にテンプレートを追加してください1.2節で説明したプレートレイアウトをATCH。
10. マイクロ遠心のためのPCRチューブストリップアダプタが所定の位置にあることを確認してください。
11. QRPA反応を含むチューブに配置されます各チューブのふたに酢酸マグネシウムの2.5μLを分注する。
12. 穏やかにそれらが完全に密封されておらず、除去され得るように、PCRチューブの上部に蓋を置く。酢酸マグネシウムは、蓋に付着し、上からはっきりと見えるようになります。
13. PCRチューブホルダのそれぞれの側に蓋を各PCRチューブストリップを挿入する。 RPA反応を開始、蓋の外とRPA反応に酢酸マグネシウムをスピンさminifugeの蓋を閉じます。すべての気泡が除去され、すべての液体が各チューブ（約10秒）の底部に集められるまで遠心分離する。
14. すぐにPCRチューブストリップを削除し、QRPA反応を停止させる冷たいブロックに戻す。
15. 慎重にエアロゾル形成を防止するために、蓋を除去し、切断して、各PCRチューブストリップをシール明確なマイクロシールフィルムの断片。
16. すぐにサーマルサイクラーに歩き、プレートレイアウト（ウェルA1-B8）を合わせる場所でのサーマルサイクラーに2 PCRチューブストリップをロードします。サーマルサイクラーの蓋を閉め、 "スタートファイル名を指定して実行」をクリックして、実験用のファイル名を指定する。
    注：製造業者は、インキュベーションの5分後にサンプルを攪拌推奨しているが、このステップは、この特定のアッセイのために必要ではなく、省略してもよい。
17. 実行が完了すると、生の蛍光データを表示するには「設定」、「ベースライン設定、 ""いいえベースライン減算」を選択します。 Excelにすべてのデータシートのエクスポート」「エクスポート」を選択して、スプレッドシートプログラムにデータをエクスポートする。定量増幅結果」補遺のファイル」は、「生のリアルタイムの蛍光データを含む作成されます。

4.内部陽性対照を開発

1. 標的試料中に見出されにくい種からのDNA配列を選択する。配列は、標的配列の生成が促進されるように、標的アンプリコンよりも長くする必要がある。
   注：この生物が血液中に発見され、別のプロジェクトからの研究室で利用可能であったことはほとんどありませんので、このアッセイでは、 クリプトスポリジウムは 、腸の寄生虫は、IPCのシーケンスを生成するためのテンプレートとして機能するように選ばれました。 IPCシーケンスを生成するために、抽出およびCから DNAを精製するパルバムオーシスト他の場所で¹⁸説明したように。
2. フォワード購入（5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G / ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3 '）及びリバース（5'CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G / TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3 '）商業的供給源からのプライマー。このアッセイで使用IPC PCRプライマーは、図1に示されており、IPCテンプレートDに相補的である領域を含有しているNA（ 例えば、 図1の紫色のC. parvumの 、）標的生物に無料で、1領域（ 例えば、HIV-1、 図1の青）。
3. プライマーとIPCの鋳型DNAを用いたPCRを行います。
   1. ポリメラーゼを除く、製造業者の説明書に従ってのPhusion高忠実度DNAポリメラーゼキット試薬​​を用いて、50μlのPCR反応を組み立てる。 DNAテンプレートとのPhusionバッファーHFの2μLを使用してください。
   2. 98°C、62°Cで30秒間、および72℃で30秒間で15秒間の40サイクル、続いて98℃で60秒間、続いて98℃でのホットスタート、後に各反応物にはPhusionポリメラーゼを追加5分間の72℃での最終伸長とC。熱サイクルの後、4℃でサンプルを保持する。
   3. に含まれ、2％TAEアガロースゲル上のゲル電気泳動によってサンプルを分析し、次に微小遠心プロトコールに従ってQIAquickゲル抽出キットを用いてDNAを抽出し、精製するキット。
4. QRPAを使用して増幅する能力についてIPC候補をスクリーニングする。
   1. 第3節で説明したように、HIV-1のプライマー、IPC（5'-AGGタグTGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [DT-BHQ1に固有のFAM標識プローブを使用して、QRPA反応を準備します重複してすべての濃度をテスト] GGT TTT GTA ATT GGA A -3 '）、および0の合計、10、10 ^{2、10 3、10 4、}または反応当たり各IPC候補の10 ⁵コピー、。
   2. 最も一貫して増幅し、最低制限-の検出を持つIPC候補を選択してください。
5. IPC DNAの最適濃度を決定するために、HIV-1及びIPCを共増幅する。
   1. 再水和バッファーの29.5μL、フォワードプライマー[10μM]のRPAの2.1μL、RPAの2.1μlのプライマー[10μm]を逆転、HIV-1 HEXの0.6μlの：第3節と同様に、各50μlの反応で、次の組み合わせ標識プローブ[10μM]、10μlのHIV-1の様々な濃度でのDNA、酢酸マグネシウム2.5μlの、および1酵素ペレット。代わりに、IPC FAM標識プローブ[10μM]の0.6μL、およびIPC DNAの2.6μlを添加、ステップ3.2.4で行われたようヌクレアーゼを含まない水の3.2μLを加えた。 QRPA単独IPC DNA蛍光シグナルの発生量がでサンプルによって生成された蛍光によって生成されたものよりも大きい最小濃度として定義される（LODを行う場合限界の検出であるIPC濃度（LOD）を使用ターゲット·DNAなし）。
   2. セクション1.1に記載されているプロトコルを使用して、サンプルをインキュベートする。
   3. IPCは、すべてのサンプルでは増幅しない場合は、高い大きさのIPC濃度1順序で実験を繰り返して検討する。 HIV-1アッセイのためのIPC DNAの最適濃度は10,000コピー/μLである。サンプルが有効と考えられるがIPCまたはHIV-1 DNA増幅のいずれかがある場合には、理想的には、IPCのための検出可能な増幅を示すすべての反応。

5.複数の実験から標準曲線を構築

1. 3.13節で説明したように各実験のデータは表計算プログラムに輸出されていることを確認します。
2. オープンとスクリプト「JoVE_qRPA_standard_curve.m "を実行。すべての入力には、自動的にコマンドウィンドウにプロンプ​​トが表示されます。スクリプトが開始された後、ユーザは、自動的に標準曲線を構築するために使用される「データファイル数」を指定するように促される。
3. コマンドウィンドウでは、標準曲線を構築し、enterキーを押しするために使用されるフ​​ァイルの数を入力します。
4. コマンドウィンドウに入力したサンプルの数と、各トレーニングファイルで複製の数（各エントリにしてEnterキーを押します）。
   注： セクション1.2に記載のプレートレイアウトでは、異なる濃度の6サンプルおよび各サンプルの2回の反復）があった。
5. コマンドウィンドウ最低のDNを入力（log10コピーで）標準曲線を構築し、Enterキーを押して入力するために使用される濃度は、（1.2節で説明したプレートレイアウトのために、最低のテンプレート濃度が '1' log10コピーです）。
6. コマンドウィンドウに入力します（log10コピーで）各標準の濃度差、enterキーを押します（1.2節で説明プレートレイアウトのため、濃度間隔は '1' log10コピーです）。
7. プロンプトが表示された後、コマンドウィンドウで「勾配閾値」を入力し、Enterキーを押します。
8. コマンドウィンドウでは、「正の閾値の背景の上の数字（z）の標準偏差を、「入力し、Enterキーを押します。 1~5 z範囲の典型的な値。
9. '、2' '、1'番号を入力してデータをサーマルサイクラー（ '1'）、* .TIFF顕微鏡像（ '2'）、または* .JPG顕微鏡像（ '3'）を使用して収集されたかどうかを指定しますまたは '3'およびpressingを入力してください。
10. 新しいIPCしきい値を設定するか、プロンプトが表示されたとき、それぞれ '、N'または 'Y'を入力してしきい値のデフォルト値を使用するかを選択します。
11. 次に、標準曲線を構築するために使用されるスプレッドシートファイルのそれぞれを選択します。
    注：スクリプトは、自動的にHEXとFAMの蛍光データをインポートします。各反応は、（蛍光信号はHEXまたはFAMチャンネルのしきい値を超えたかどうか、すなわち ）有効であったかどうかを判断する。指数関数、線形ためのrは²の係数を決定し、二次多項式フィット。プロット標準曲線を構築するために使用されるすべての試料についての「サイクル閾値対log10コピー ";そして再び入力パラメータのすべてを再入力するユーザーを必要とせずに検証実験のための標準曲線を再構築するために不可欠な変数を含むスプレッドシートファイルを作成します。

6.アッセイの検証と使用未知試料の定量標準曲線

1. 既知濃度のサンプルを使用してアッセイの精度と正確さを推定したり、未知の濃度のサンプルを定量化するためにそれを使用するスクリプト「JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m "を使用。
   注：以前に発表された研究では、指数フィットは最高のR二乗係数^18をもたらしたことを示したので、このスクリプトは、標準曲線のために指数関数フィットを利用しています。フィットの異なるタイプが所望される場合、スクリプトはそれに応じて変更してもよい。
   1. オープンとスクリプト「JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m "を実行。スクリプトが開始された後、ユーザーは自動的にコマンドウィンドウにすべての入力を入力するように要求されている。
   2. '1'を既知の試料濃度を標準曲線を用いてアッセイを検証したり入力する入力して「2」未知の試料を定量する。
   3. プロンプトが表示されたら、いずれかの保存された標準曲線を選択するか、目を入力して、新しいものを構築自動的にコマンドウィンドウで募集されている電子情報（第5節から「JoVE_qRPA_standard_curve.m "スクリプトのために必要とされる情報と同じ）。
   4. 検証/定量化のために、分析するための実験（ すなわち、表計算ファイル）の数を入力します。

蛍光顕微鏡と温水チップを使用したデータ収集のための7の準備

1. 蛍光顕微鏡が所定の位置にステージヒータと1チャネル高精度高安定温度コントローラを持っていることを確認します。
2. 蛍光顕微鏡を確保することは励起し、各フルオロフォアからの蛍光を収集するフィルターキューブを有する。 GFPフィルター（励起BP 40分の470 nmの、放射BP 50分の520 nmの）を介してIPC DNA増幅中に生成されたFAMの蛍光を励起して集める。 HEXフィルター（励起BP 530/30 nmの、放射BP 40分の575 nmの）を介してHIV-1のDNA増幅中に生成されたHEXの蛍光を励起して集める。
3. サーマルサイクラー上のデータ収集を複製するために自動化されたアルゴリズムを作成するために顕微鏡スクリプト編集ソフトウェアを使用してください。
   1. 第1シャッターを閉じて、「設定」のステップを挿入します。次の60秒に露出を設定するには、「露出」ステップを追加。 1分間のプレインキュベーション時間を実装して60秒の遅延を、実行するために「スナップ」を挿入します。 GFPフィルターにワーキンググループを変更するには、「設定」をステップを追加します。 200ミリへの露出を調整するための別の「露出」ステップを挿入します。 GFPまたはHEXのフィルターキューブを使用するすべてのエクスポージャーは200ミリ秒に設定されます。
   2. 「露出」ステップの後、「スナップ」を追加し、画像が撮影されるカメラを指定します。ユーザー定義の一時フォルダに画像を保存するには、シャッターと「名前を付けて保存画像 "ステップを閉じるには、別の「設定」をステップを使用してください。
   3. 別の「設定する」ステップと目を使用してHEXフィルタキューブに次のスイッチENが200ミリ秒、「スナップ」、および「名前を付けて保存画像 "ステップ"露出 "を追加。
   4. 20秒の代わりに60（クローズシャッターの初期遅延でこのプロセスを59回繰り返し、20秒待ってから、GFPフィルターキューブへの切り替え、200ミリ秒への露出を設定し、スナップ、クローズシャッター、保存、HEXフィルタキューブに切り替えて、露出を設定する200ミリ秒、スナップ）へ。
4. QRPA反応を保持するチップを作成します。
   1. 顕微鏡を用いた実験では、パワー100％に設定し、レーザーカッターを用いて1/8 "厚の黒色アクリル、10％の速度のシートから40×15mmの長方形のベースを切断するために、ファイルJoVE_qRPA_base.aiを使用。
   2. よく厚さ1.5mmの透明なアクリルのシートから直径5mmの円形の穴のカットで10×10ミリメートル四方からなる反応をカットするファイルJoVE_qRPA_well.aiを使用してください。
   3. 瞬間接着剤ゲルを使用して単一のベースに3つのウェルまで取り付けます。
   4. ドライ一夜。

8.データ収集とANALY蛍光顕微鏡を用いてSIS

1. 自動データ収集スクリプトJoVE_AxioVision_Script.ziscriptをロードすることにより、データ収集のための顕微鏡を準備します。
   1. 48°Cまでステージヒータを設定し、約20分間、ステージヒータに反応チップを予熱する。 48°Cの温度設定は、反応ウェル中で39℃の温度を維持した（データは示さず）。
   2. 10X、NA 0.45の対物レンズを用いて、反応ウェルとの代わりにGFPフィルターの内縁の上に焦点を当てる。アクリルのエッジは、レーザ切断後に自家蛍光されているので、容易に可視化することができる。すべてのデータが収集されるまで焦点を当てた後、顕微鏡ステージの高さを調整しないでください。
2. ステップ4.5.1で説明したように指定されたプレ増幅ワークスペース内QRPAマスターミックスを組み立てます。各試料に対して、微量遠心管中の酵素ペレット、マスターミックス、およびHIV-1 DNA鋳型を混合する。最初の反作用に酢酸マグネシウムの2.5μLを追加Nと簡潔に渦。
3. すぐに蛍光顕微鏡にQRPA試料を含むマイクロ遠心チューブを輸送する。
   1. 慎重に泡を作成せずにうまく反応にRPA反応の30μlのピペット。蒸発を防ぐためにRPA反応オーバーPCRグレードの鉱物油の滴を置き。
   2. ウェルの中央だけでなく、自動蛍光アクリルエッジの任意の画像に注意しながら、顕微鏡の対物レンズの下にも直接配置します。ウェルが配置された後、スクリプトはHEXフィルタキューブごとに20秒を使用して、FAMフィルターキューブつのJPEG画像を用いたものJPEG画像を生成する自動化スクリプトを実行7。
4. スクリプトが完了した後、追加のサンプルを実行する前に一時保存フォルダから、これらの画像を転送する。
   1. 各蛍光団のための1（ すなわち、「HEX」と「FAM '）：2のフォルダを作成します。同じ親フォルダ内の両方のフォルダに保管してください。各蛍光団でフォルダには、試料（ 例えば、0、10、など ）に存在するDNAのコピー数で標識されたフォルダを作成します。
   2. 「HEX」フォルダ内の対応するサブフォルダに接頭辞「HEX」を持つすべてのファイルを転送します。 「FAM」フォルダ内の対応するサブフォルダに接頭辞「GFP」を持つすべてのファイルを転送します。
5. 0、10、10 ^{2、10 4、10 3、}および10 ⁵ HIV-1 DNAのコピーを有するQRPA反応を繰り返しセクション8.2から8.4。
6. 実験ですべてQRPAサンプルについてのデータを収集した後、スクリプトによってプロンプトが表示されたら、「。JoVE_real_time_intensity_to_excel.m "スクリプトをロードする順番にサブフォルダ内の各濃度について画像を含む2フォアフォルダを含む親フォルダを選択します。
   注：このスクリプトは自動的にHEX蛍光データシートナムに保存されている親ディレクトリ内のスプレッドシートファイルを生成しますED「HEX」、およびFAM蛍光データは、「FAM」という名前のシートに保存されます。各シートには、サイクル数は、列Bに記載されており、テンプレートの濃度を増加させるためのリアルタイムの蛍光データは、列など C、D、に記載されている。各リアルタイム蛍光基準は、その時点で撮像された画像の平均蛍光強度である。
7. セルB2をプロットするためにスプレッドシートプログラムにデフォルトの散布図機能を使用する：「HEX」と「FAM」シートのH61リアルタイム蛍光を可視化し、 図2A、2B、3A、および図3Bと同様のプロットを生成する。
   注：ステップ8.6で生成されたスプレッドシートには、スクリプト「JoVE_qRPA_standard_curve.m」と「JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m」で使用することができる。

Representative Results

Discussion

プロンプトが表示されたら、MATLABアルゴリズムを使用して、意味のある定量データを得るためには、ユーザは、適切な入力値を選択しなければならない。セクション5および6の各スクリプトを開始した後、すべての入力変数は自動的にコマンドウィンドウに要請され、出力は自動的に生成される。 5.7節では、ユーザーは勾配閾値を選択するよう求めている。勾配閾値の値は、適合の相関係数（rは^2）の2乗に影響を与える。サーマルサイクラーからエクスポートされた未加工の蛍光データを使用する場合、2.0と5.0の間の値が高いrは²係数を生成する傾向がある。第5.8節では、ユーザは、正の閾値を設定するためのバックグラウンドを超える標準偏差の数を指定する必要があります。正または負などのサンプルを獲得するために、スクリプトが自動的にTHERMAからエクスポート生の蛍光データを使用して、各サンプルの最大値と最小蛍光との差Δ _{サンプルを}決定Lサイクラー。これは、すべての無ターゲット対照サンプルの平均差Δの_背景と標準偏差σの_背景を計算します。 Δ _{サンプルは} Δの_{バックグラウンドを超える} σ _背景 ×Z以上であればサンプルが陽性であると考えている。 5.10節では、ユーザーはデフォルトのしきい値を使用するか、新しいしきい値を設定するかどうかを決定します。ユーザが新しいしきい値を設定したい場合には、実験的に、任意のHIV-1 DNAの存在なしに3つの実験をそれぞれ含む12 RPA反応を行うことにより、新たな閾値を決定する。これらの実験プラス3標準偏差からの蛍光強度の平均増加でしきい値を設定します。第6節を完了した後、スクリプトJoVE_qRPA_validation_and_quantification.mは自動的に（log10コピーで）各QRPA反応のための推定DNA濃度を返します。スクリプトにはHIV-1 DNAが試料中に存在しないと判断した場合には、推定濃度はどちら」数Neと表示されている内部陽性対照用の蛍光信号が閾値（σ _背景 +Δの_背景 ×z）を超えたかどうかに応じて、HIVのためgative」または「無効」。ユーザーが既知のサンプル濃度の標準曲線を検証している場合、スクリプトはまた、表1と同様の追加のテーブルを返します。

正確な定量化を提供し、リアルタイムRPAアッセイを開発するために、実験的な一貫性が重要である。例えば、同一のプライマーを使用し、標準曲線と検証実験の両方のアリコートをプローブ。プライマーを格納することにより凍結融解サイクルをも回避し、℃での実験ではなく、-20〜4℃でアリコートをプローブ。標準曲線および検証実験に使用したテンプレートのアリコートを、同様に格納される。同一ロットからのRPA酵素ペレットおよび試薬は、製造業者の推奨に従って使用される。最後に、beca使用RPAは、ユーザの手順の標準化が必要不可欠であり、正確に増幅率を制御するために、真の「サイクル」を欠いている。反応を組み立てる際に、ユーザーは常に、各ステップでおよそ同じ時間を費やして、同じ順序で同じ手順に従う必要があります。反応は、常に新しいピペットチップで穏やかに混合されなければならない、と気泡が常に除去されなければならない。増幅の前に、反応は、一貫性のある温度に保持されなければならない、とサーマルサイクラーや顕微鏡ソフトウェアが常に定量化に影響を与える可能性が次善の温度での任意の増幅を回避するために、反応をロードする前に準備する必要があります。初期反応条件の任意の変化が、実験の結果の矛盾をもたらす可能性がある。

データを収集するために顕微鏡を使用する場合、追加の変数は、蛍光強度の変化を最小限にするために制御されなければならない。すべての反応は暖かいステージ上で同じ領域に配置され、かつmicroscoされなければならないPEは、すべてのサンプルについて、ウェルの同じ領域に集中する必要があります。これらの慣行に従っている場合であっても、顕微鏡で収集さ蛍光データにより自然に励起光への反復曝露に起因RPA反応は、反応チャンバー内の気泡形成、または光退色の間に形成ローカル輝点に変動を示すことができる。これらの変数の影響は、ベースラインの変動、ピーク、および谷を実証顕微鏡（ 図4Aおよび4B）に集光された蛍光データで明らかである。これらの機能は、サーマルサイクラー（ 図3Aおよび図3B）に集光された蛍光データは存在しない。最終的に、顕微鏡でのデータ収集は、証明の原理を目的としており、最終的なアッセイは、これらの変数を最小化するより正確な幾何学的形状およびソフトウェア制御によるフィールド操作可能な蛍光リーダー上で実施される。

もう一つの重要なQRPAアッセイ開発プロセスの側面は、データ処理の一貫性である。方法の項に記述されたプロトコルは、サーマルサイクラーまたは顕微鏡から収集（スプレッドシートファイルに格納されている）生の蛍光データを処理するスクリプトを使用する。標準曲線を構築するために使用される全ての実験は、同じようにフォーマットする必要があります。データを収集するために、サーマルサイクラーを使用する場合は、同じプレートレイアウトを使用する必要があり、かつRPA反応を含まないウェルからのデータはエクスポートしてはいけません。データを収集するために顕微鏡を使用する場合は、データの形式は自動的にサーマルサイクラーからエクスポートしたデータの形式と一致する必要があります。 D61、E2：細胞においてD2でなければならないテンプレートの濃度を増加させるためのC61、及びデータ：例えば、無ターゲット対照データがセルC2内にある必要があり、実験中の各濃度の複数の複製がある場合E61 等 ^第 2希釈系列が最高濃度にノーとターゲットコントロール（NTC）左から右に注文する必要があります複製し、1 ^番目のすぐ右に列に ​​保存されては希釈系列を複製。例えば、2と1.2節で使用されるプレートレイアウトで希釈系列の各サンプルの第一の反復のために蛍光データをセルC2に保存する必要があり、各サンプルに対して複製する：H61および蛍光データを各サンプルの第二の反復でのためにN61：希釈系列をセルI2に保存する必要があります。スプレッドシートにサーマルサイクラーソフトウェアからデータをエクスポートする際に、セクション1.2で使用されるプレートレイアウトの場合、これはデフォルトのフォーマットです。

HIV-1 QRPA実験から提供されている代表的なデータは、RPAは、未知の試料中の核酸濃度を定量化するために使用することができる概念実証のサポートを実証する。臨床的に有用なHIV-1ウイルス負荷試験は、大きさの少なくとも4桁の臨床範囲、0.5 log10コピーの精度、及び少なくとも200コピー^19,20の限界を検出している。記載HIV-1 DNAアッセイは、これらのcrのに適合しているiteria、表1に示すように、低濃度で最も正確であるため、逆転写ステップを含めることで、これらの結果は、HIV-1 RT-RPAアッセイでHIV-1ウイルス負荷を測定する可能性を有し得ることを示唆している臨床サンプル。アルゴリズムのパラメータを調整する、QRPAアッセイを開発する際に調整する臨床的必要に応じて、感度および線形ダイナミックレンジをもよい。6（陽性サンプルのための閾値を決定するパラメータ）は、zを調整する低および高に感度および精度に影響を与えることができることを示してい標的濃度。また、それによって、増幅の速度を減少させる、より低い温度で反応をインキュベート以下酢酸マグネシウムを使用して定量化の分解能および精度を向上することが可能である。

コンセプトQRPAアッセイのこの証拠は、HIV-1 DNAを含有する試料の濃度を定量することができる。このMAに記載されてQRPAアッセイnuscriptは、リアルタイムRPA反応を組み立て開発し、IPCをスクリーニングして、未知のサンプルを定量するために用いることができる標準曲線を構築するための未加工の蛍光データを処理する方法の詳細な手順を含む。詳細な手順が含まれて、このプロトコルは、サンプルの多種多様なDNA濃度を定量するように適合され得る。

Materials

qRPA Assay
HIV-1 forward primer	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos	5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3’ 
HIV-1 reverse primer	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos	5’-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3’ 
HIV-1 probe	BioSearch Technologies 	custom DNA oligos	5’- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3’ 
IPC probe	BioSearch Technologies 	custom DNA oligos	5’-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3’
RPA exo reagents (pellets, rehydration buffer, magnesium acetate	TwistDx	TwistAmp exo
PCR tube strips	BioRad	TLS0801
PCR flat cap tube strips	BioRad	TCS0803
Micro-seal adhesive	BioRad	558/MJ 
HIV-1 target (pHIV-IRES- eYFPΔEnvΔVifΔVpr)			custom plasmid, see: Segall, H. I., Yoo, E. & Sutton, R. E. Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range. Molecular Therapy 8, 118–129, doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003).
Human male genomic DNA	Applied Biosystems	360486
96 well cold-block	Cole Parmer	EW-36700-48
Thermal cycler	BioRad	CFX96
MiniFuge	VWR	93000-196
Vortex	VWR	58816-121
Tris buffer 1.0 M, pH 8.0	EMD Millipore	648314
EDTA 0.5 M, pH 8.0	Promega	V4321
Nuclease free water	Ambion	AM9937
IPC Development
Cryptosporidium parvum IPC template	Waterborne Inc	P102C	It is also possible to order a double stranded synthetic target from IDT if the user is unequipped to work with C. parvum (a BSL-2 infectious agent). PCR and RPA primers for C. parvum were designed using GenBank accession number AF115377.1
PCR long forward primer	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos	5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G/ ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3’
PCR long reverse primer	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos	5’- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G/ TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3’
Phusion High-Fidelty DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530S
Qiaquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
TAE 10X buffer	EMD Millipore	574797
Agarose	Sigma Aldrich	A9539
Microscope Experiments
Upright fluorescence microscope	Zeiss	Zeiss Imager.J1
Stage heater	Bioscience Tools	TC-GSH
1-Channel Precision High Stability Temperature Controller	Bioscience Tools	TC-1100S
FAM/GFP filter cube	Zeiss	filter set 38 (000000-1031-346)	excitation BP 470/40 nm, emission BP 520/50 nm
HEX filter cube	Chroma	49014	excitation BP 530/30 nm, emission BP 575/40 nm
Laser cutter	Engraver's Network	VLS3.60
1/8" black acrylic	McMaster Carr	8505K113
1.5 mm clear acrylic	McMaster Carr	PD-72268940 
Super glue	Office Depot	Duro super glue 
PCR grade mineral oil	Sigma Aldrich	M8662-5VL
Data Analysis
Microsoft Excel	Microsoft
MATLAB	MATLAB
MATLAB script: "JoVE_qRPA_standard_curve.m”	Included in SI
MATLAB script: "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m”	Included in SI
MATLAB script: "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m”	Included in SI
Adobe Illustrator	Adobe
JoVE_qRPA_well.ai	Included in SI
JoVE_qRPA_base.ai	Included in SI
AxioVision software	Zeiss
JoVE_AxioVision_Script.ziscript	Included in SI