内部陽性対照との定量的リコンビナーゼポリメラーゼ増幅アッセイの開発

Summary

Provided は、サーマルサイクラーまたは顕微鏡とステージヒーターを使用して DNA サンプルの初期濃度を定量化するリアルタイムリコンビナーゼポリメラーゼ増幅アッセイを開発するためのプロトコルです。また、内部ポジティブコントロールの開発についても説明します。生のリアルタイム蛍光データを処理するためのスクリプトが用意されています。

Abstract

最近、病原体検出のための等温増幅プラットフォームであるリコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)が、標準曲線を使用してDNAサンプル濃度を定量化するために使用できることが実証されました。この原稿では、リアルタイムの定量的リコンビナーゼポリメラーゼ増幅アッセイ(qRPAアッセイ)を開発および実装するための詳細なプロトコルが提供されています。HIV-1 DNA定量を例にとり、リアルタイムのRPA反応のアセンブル、内部ポジティブコントロール(IPC)配列の設計、IPCと対象ターゲットの共増幅についてすべて説明します。複数の実験からのデータを使用して標準曲線を作成するための指示とデータ処理スクリプトが提供されており、未知サンプルの濃度を予測したり、アッセイの性能を評価したりするために使用できます。最後に、ポイントオブケアqRPAアッセイの開発に向けたステップとして、顕微鏡とステージヒーターを使用してリアルタイムの蛍光データを収集する代替方法について説明します。提供されたプロトコルおよびスクリプトは、目的の任意のDNAターゲットに対するqRPAアッセイの開発に使用することができます。

Introduction

定量的核酸増幅は、環境、食品媒介性および水媒介性病原体の検出のためだけでなく、臨床診断のための重要な技術である。リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）核酸の感度が高く、特異的かつ定量的検出のための金の標準的な方法で、 例えば、HIV-1ウイルス負荷試験、細菌性病原体の検出、および他の多くの生物の¹のスクリーニングのための^{- 3。}リアルタイム定量PCRの間に、プライマーは、サイクル中の病原体のDNAを増幅し、そして蛍光シグナルは各サイクルにおいて、サンプル中の増幅されたDNAの量に比例して生成される。病原体DNAの未知の濃度を含有する試料は、標準試料の初期DNA濃度と蛍光シグナルが特定の閾値（ すなわち、サイクル閾値、またはC _T）に達した時点に関する標準曲線を用いて定量することができる。

リアルタイムqPCRの結果を受信するために高価な熱サイクル装置と、数時間を必要とするので、このようなリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（RPA）などの代替の等温増幅技術は^、4開発され^ている。これらのプラットフォームは、一般に、より迅速な結果を提供し、より安価な、より簡単な装置を用いて達成され得るより低い、単一温度で核酸を増幅する。 、ポイントオブケア用途に特に魅力的である分でDNAを増幅するRPAは、低い増幅温度（37℃）を必要とし、不純....

Protocol

1.プログラムのリアルタイムQRPA反応のためのサーマルサイクラー

1. サーマルサイクラーソフトウェアの新しいプロトコルを作成します。
   1. 1分間39℃：プレインキュベーションステップを挿入します。
   2. プレートの読み取りに続いて20秒間39℃：第二ステップを追加します。
   3. 最後に、第2のステップ59を複数回繰り返し、「GO TO」を挿入します。
   4. プロトコルを保存します。
2. ソフトウェアの「プレートエディタ」タブで新しいプレートを作成します。 RPA反応の位置に対応するプレート上のウェルを選択し（ここでは、利用ウェルA1、A4、A8、B1、およびB4-B8）。
   注：データ解析は、カスタムスクリプトを使用して行われるように、ウェル（ 例えば、「標準」、「NTC」）のサンプルタイプが、指定されているかどうかは重要ではない。
   1. 唯一のHIV-1 DNAを含む実験のために、すべてのウェルのための「HEX」フォアを選択します。 HIV-1 DNAと内部陽性同時を含む実験用ntrol、「HEX」と全てのウェルのための「FAM」フルオロフォアの両方を選択。プレートを保存します。

2. HIV-1 QRPA実験の準備

1. qPCRのためのように、指定されたピペット、ピペットチップ、ボルテ....

Results

ターゲットとQRPA実験でIPCとして機能する配列を選択する前に（HIV-1）DNA、内部陽性対照（IPC）の候補が生成され、HIV-1 DNAの存在なしQRPA反応において増幅するそれらの能力についてスクリーニングした。 IPC候補は、アウト競合HIV-1アンプリコンの形成からIPC形成を防止するために、ターゲット（HIV-1）DNAよりも長い。 図2Aは 、2℃の生成に示すようにパルバム IPC候補はゲル電気泳動を用いて415と435 bpのバンドの存在によって確認した。 10 ⁴および10 ⁵コピーの合計（ 図2C）が存在したとき、より長い候補が一貫して増幅しながらQRPA反応では、より短いIPC候補は、ほとんどの増幅（ 図2B）を示した。したがって、より長い候補がHIV-1 QRPA実験のIPCに選ばれた。

リアルタイムQRPAは、単独で目的の標的を使用して、または使用して実行することができるタ.......

Discussion

プロンプトが表示されたら、MATLABアルゴリズムを使用して、意味のある定量データを得るためには、ユーザは、適切な入力値を選択しなければならない。セクション5および6の各スクリプトを開始した後、すべての入力変数は自動的にコマンドウィンドウに要請され、出力は自動的に生成される。 5.7節では、ユーザーは勾配閾値を選択するよう求めている。勾配閾値の値は、適合の相関係数（rは^2）の2乗に影響を与える。サーマルサイクラーからエクスポートされた未加工の蛍光データを使用する場合、2.0と5.0の間の値が高いrは²係数を生成する傾向がある。第5.8節では、ユーザは、正の閾値を設定するためのバックグラウンドを超える標準偏差の数を指定する必要があります。正または負などのサンプルを獲得するために、スクリプトが自動的にTHERMAからエクスポート生の蛍光データを使用して、各サンプルの最大値と最小蛍光との差Δ _{サンプルを}決定Lサイクラー。これは、すべての無ターゲット対照サンプルの平均差Δの_背景と標準偏差σの_背景を計算します。 Δ _{サンプルは<.......}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
qRPAアッセイ
HIV-1フォワードプライマー	統合DNAテクノロジー	カスタムDNAオリゴ	5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3'
HIV-1 リバースプライマー	Integrated DNA Technologies	カスタム DNA オリゴ	5'-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3'
HIV-1プローブ	BioSearch Technologies	カスタムDNAオリゴ	5'- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3'
IPCプローブ	BioSearch Technologies	カスタムDNAオリゴ	5'-AGG TAG TGA CAA GAA ATA, ACA ATA, CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT, TTT, GTA, ATT, GGA A -3'
RPA exo試薬(ペレット、再水和バッファー、酢酸マグネシウム	TwistDx	、TwistAmp exo
PCRチューブストリップ、	BioRad	TLS0801
、PCRフラットキャップチューブストリップ、	BioRad	TCS0803
、マイクロシール接着剤	、BioRad	558/MJ
HIV-1ターゲット(pHIV-IRES-eYFPΔ環境&デルタ;VifΔVpr)			カスタムプラスミド、参照:Segall、H. I.、Yoo、E. &Sutton, R. E. Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range.(宿主範囲が変更された人工複製コンピテントレンチウイルスの特性評価と検出)。分子療法8、118–129, doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003).
人間の男性のゲノムDNA	はBiosystemsを応用
96の井戸の冷たいブロック	Cole Parmer	EW-36700-48
熱サイクラーBioRad		CFX96
MiniFuge	VWR	93000-196
Vortex	VWR	58816-121
Tris緩衝液1.0 M、pH 8.0	EMDミリポア	648314
EDTA 0.5 M、pH 8.0	Promega	V4321
ヌクレアーゼフリー水	Ambion	AM9937
IPC 開発
クリプトスポリジウム・パルバム IPCテンプレート	ウォーターボーン・インク	P102C	C.パルバム(BSL-2感染性病原体)を使用する準備ができていない場合、IDTに二本鎖合成ターゲットを注文することも可能です。C. parvumのPCRおよびRPAプライマーは、GenBankアクセッション番号AF115377.1
PCRロングフォワードプライマー	Integrated DNA Technologies	、カスタムDNAオリゴ、	5'-TGG、CAG、TAT、TCA、TTC、ACA、ATT、TTA、AAA、GAA、AAG、G、ATC、TAA、GGA、AGG、CAG、CAG、GC-3'
PCRロングリバースプライマー	インテグレーテッドDNAテクノロジー	ズ カスタムDNAオリゴ	5'- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G/ TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3'
Phusion High-Fidelty DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530S
Qiaquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
TAE 10X buffer	EMD Millipore	574797
	Agarose Sigma Aldrich	A9539
Microscope Experiments
Upright 蛍光顕微鏡	Zeiss	ツァイスイメージャー.J1
ステージヒーター	バイオサイエンスツール	TC-GSH
1チャンネル精密 高安定性温度コントローラー	バイオサイエンスツール	TC-1100S
FAM/GFP フィルターキューブ	ツァイス	フィルターセット 38 (000000-1031-346)	励起 BP 470/40 nm、発光 BP 520/50 nm
HEX フィルターキューブ	クロマ	49014	励起 BP 530/30 nm、エミッション BP 575/40 nm
レーザーカッター	彫刻家のネットワーク	VLS3.60
1/8" 黒色アクリル	マクマスターカー	8505K113
1.5 mm 透明アクリル	マクマスターカー	PD-72268940
瞬間接着剤	オフィスデポ	デュロ 瞬間接着剤
PCRグレードの鉱物油	Sigma Aldrich	M8662-5VL
データ分析
Microsoft Excel	Microsoft
MATLAB	MATLAB
MATLAB スクリプト: "JoVE_qRPA_standard_curve.m"	SI
MATLAB スクリプトに含まれるもの: "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m"	SI
MATLAB スクリプトに含まれるもの: "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m"	SI
Adobe Illustrator	Adobe
JoVE_qRPA_well.ai	SI
JoVE_qRPA_base.ai	SI
に収録 AxioVisionソフトウェア	Zeiss
JoVE_AxioVision_Script.ziscript	に収録