方法論記事

LEPR

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DOI：

10.3791/52632

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2015年5月11日

 ,  , 
1School of Biomedical Sciences, The University of Queensland

この記事について

サマリー

ここでは、2型糖尿病のマウスモデルから膵島を分離するためのプロトコル、Leprdb、および2光子顕微鏡を利用した無傷の膵島からのインスリン分泌を測定するための生細胞アッセイの詳細を紹介します。

要約

2型糖尿病は、過去20年の間に、2型糖尿病におけるβ細胞機能不全の役割が明確に2を確立されている。2013年382万人に影響を与える慢性疾患であり、2035年15.92億に上昇すると予想されます。研究の進歩は、膵島の単離のための方法が必要でした。野生型および糖尿病LEPR デシベル （DB / DB）マウスの両方から分離された膵島の収量と品質を向上させるためにいくつかの変更を加えて、ここでは他のグループからのプロトコルと共有多くの共通の手順を提示膵島単離のプロトコル。生細胞2光子イメージング方法は、次いで、膵島内のインスリン分泌の制御を研究するために使用することができるが提示されます。

概要

疾患におけるβ細胞機能不全の役割が広く3,4認識されています。このようなMIN6及びINS-1などの細胞株は、β細胞の挙動の生物学を理解するための便利なツールです。しかし、インスリン分泌の生理学的制御は、ランゲルハンス島内で起こります。これらの島は密に詰まったβ細胞の数千、ならびに血管および他の内分泌細胞型を含みます。膵島内のこの環境は、インスリン分泌に影響を与え、糖尿病において重要である可能性があります。したがって、インスリン分泌の生理学的制御、および疾患の病態生理を理解するためには、無傷島を研究することが必須です。

膵島単離

ヒト膵島ライブ及び、特に、2型糖尿病患者からのヒト膵島を得ることが困難です。また、ヒト膵島は、実験分子操作のための限られた可能性があります。研究者はそのためである使用してきました動物や2型糖尿病の動物モデルからすることができます。そのような疾患モデルは、DB / dbマウスです。これは、モデルが密接にヒトの疾患5,6と平行した表現型の進行と2型糖尿病自然突然変異です。糖尿病のdb / dbマウスの膵島単離のためにここで紹介するプロトコルは、より良好な収率、精製および強化された膵島の生存のためのいくつかの改良と、他のグループと共通の多くのステップがあります。

2光子イメージング

生細胞2光子アッセイは、ここで説明した数を定量化し、糖尿病7の多くの細胞および野生型の島8,9から単一のインスリン含有顆粒の特性を評価するために研究者を可能にします。

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プロトコル

注：すべての本実験は（クイーンズランド大学、解剖学的バイオサイエンス倫理委員会によって承認された）クイーンズランド大学のロー​​カル動物倫理手順に従って実施しました。

1.膵島単離

  1. 試薬調製
    1. 酵素の混合物
      1. 膵臓消化のために、リベラーゼおよびコラゲナーゼIV型の混合物を使用しています。リベラーゼTL DMEMの26ミリリットルとの5mg（低サーモリシン）1バイアル（ダルベッコ改変イーグル培地）を希釈します。
      2. 5mMのHEPES、0.5mMのCaCl 2を、は0.1mg / mlのDNA分解酵素とは​​1mg / mlウシ血清アルブミンを補充した0.5mgの/ mlであり、濃度のハンクス緩衝液中のコラゲナーゼIV型を準備します。
      3. すなわち 、（体積で）1 4ミリリットルのLiberase TL + 1ミリリットルのコラゲナーゼ：4の割合でリベラーゼTLとコラゲナーゼ溶液を混合。 -20℃でそれぞれ店舗を2.5ミリリットルする酵素の混合物を分取。
        注：組織のインキュベーション時間は、V酵素のバッチ間のビット（30秒〜1分差）ARY。したがって、バッチ試験が必要とされ得ます。
    2. RPMIアイソレーションメディア
      1. 室温で水1LにRPMI 1640粉末の1つのバイアルを溶解し、2グラムのNaHCO 3、4.02グラムのHEPESで補います。
      2. 、マグネチックスターラーで混ぜ、大きな三角フラスコにRPMI分離媒体を組み合わせてNaOHでpHを7.4に調整し、フィルターを滅菌し、4℃で保存。
    3. RPMI培養培地
    4. 10％ウシ胎児血清および1％抗生物質（ 例えば 、ペニシリン100 U / mlのストレプトマイシンを100μg/ ml）を、RPMI培地を使用します。
  2. 膵島単離および培養
    1. 動物のいけにえ
      1. 地元の機関の倫理手順に従って、頸椎脱臼またはCO 2窒息によりマウスを生け贄に捧げます。 70％エタノールで徹底的にマウス本体スプレー。
    2. 膵臓灌流
      1. UV字状のフラップを作るために腹部の皮膚と腹膜を通って横方向に2長いカットをSE。 、全体の腹腔を明らか腸を脇に置くと、総胆管（ 図1および図2）を明らかにする折り畳まれたティッシュペーパーによって所定の位置に肝臓を維持するために皮膚のフラップを引き上げます。その結果、外科医に向かって頭と尾離れ外科医から動物を置きます。
      2. 十二指腸（ 図1）に入るから注入された酵素をブロックするために十二指腸壁に膨大部で血管クランプを適用します。
        注：それは注入された酵素が膵管に入ると（クランプ以上）注射部位に膵臓や逆流を灌流または十二指腸に入るかどうかを決定し、これは（クランプの下）重要なステップです。
      3. 共通の肝管と胆嚢管（ 図1）の接合部付近31 G針で総胆管にカニューレを挿入し、二回目の注射のための余地を残す番目の場合Eの膵臓は初めてを灌流することができません。ゆっくりと（〜10秒以上）マウス総胆管に冷たい酵素混合物の約2mlを注入。
        注：クランプが正しい位置にある場合に膵臓が急速に灌流されます。
      4. 針が総胆管の内部にあるが、膵臓を灌流することができない場合（ すなわち 。クランプを超える場合は肝臓から少し離れてクランプを移動したり、クランプの下であれば肝臓に少しそれを下に移動）クランプ位置を調整します。
        注：針が時々周囲のカプセルではなく、ダクトの内腔に入ります。注入する際、針が総胆管の内側にあるかどうかを確認するのに便利な記号は、ダクトの拡張です。膵臓が灌流するために失敗した場合、代替は、酵素混合物が予想より低い収率で膵臓の複数の部位に注入することができたです。膵臓（脾臓ローブ）の左サイトの灌流は、膵島収量の最大化のために重要です。
      5. 膵臓は、pした後erfused、すぐに、膵臓を除去バイアル（〜20ミリリットル、ガラス）に入れ、37℃の水浴中で〜19分間インキュベートします。
        注：インキュベーション時間は、マウス株と年齢に応じてビットを変化させることができます。
      6. インキュベーション時間の後、〜冷分離培地を20mlを添加することによって、消化プロセスを停止します。膵臓を破壊し、滅菌50mlチューブに、通常の茶ふるい（1mmの孔径）を介して、それを注ぐ穏やかにバイアルを振ります。ブレーキをオフにして、4℃で1分間、400×gで分離培地と遠心でチューブをトップ。
      7. 再び分離培地でペレットを溶解した後、ブレーキをオフにして、4℃で1分間、400×gで遠心分離し、2 15ミリリットルチューブに移します。吸引上清後、ボルテックスまたはピペッティングによりチューブあたり密度勾配細胞分離媒体の6ミリリットル（ヒスト1077溶液）とよく2ペレットを混合します。そしてそっとの上にチューブの側面に分離培地の〜6ミリリットルを追加ブレーキをオフにして、4℃で15分間100×gでの密度勾配分離媒体および遠心分離機。
      8. 上部（分離媒体）に上清を収集し、3つの別々の皿の中央と下部（密度勾配細胞分離媒体）の層。解剖顕微鏡下でピペットを用いて、これら3つの皿で膵島を自分に都合の良いように選びます。
        注：中間層は、島のほとんどが含まれています。膵島のサイズは約50〜500μmのコンパクトな構造（ 図3）として認識されています。我々は、WTマウスにおける〜200の島とされたdb / dbマウスにおける300- <100膵島を得ます。
    3. 膵島培養
      1. 島はライブ前に2日間酵素消化、5％/ 95％CO 2 / O 2、37℃、で6ミリリットルRPMI培地（10mMのグルコース）と25センチメートルシャーレで40島の文化·グループからの回復を支援するために、 2光子イメージングを-cell。毎日の培地を変更します。

2。ライブセル2光子イメージング

  1. 試薬の調製
    1. 外バッファ
      1. 140のNaCl、5mMのKCl、2.5mMのCaCl 2を、1mMのMgCl 2、5mMのNaHCO 3および10mMのHEPESと2光子アッセイのためのナトリウムの豊富な細胞外のバッファを準備します。
    2. 外色素
      1. 2光子アッセイのために、細胞外のバッファの株式SRB 8ミリメートル、-20℃での小さなチューブやストアにアリコートを準備します。 0.8mmの作業濃度を得るために、新鮮な外のバッファにストックSRB 1:10に希釈します。
  2. 光子撮像
    1. まず、30分間3 mMのグルコースの細胞外緩衝液中で2日間培養した膵島を前インキュベートします。
      注：私たちは、文化の中で2〜5日の間の島を使用しています。
    2. その後、顕微鏡ステージ上に搭載サーモ制御室にスライドガラスを配置します。液の漏れを防止するために、グリースを使用します。
    3. extracellの500μlのチャンバーをカバー異なるグルコース濃度0.8 mMのSRB（3ミリモル、6ミリモル、15ミリモル、20 mMグルコース）を含有する緩衝液ウラル。
    4. 次に、チャンバーの中央にプレインキュベート膵島を配置し、げっ歯類の小島で、インスリンについて免疫染色すると、ほとんどの細胞は、β細胞であることを示し、島に3-4細胞層に焦点を当てています。
      注：SRBはすぐに島のすべての細胞膜を概説し、膵島は、画像への準備ができています。
    5. （ 例えば 、11のscanimage）60X油浸対物レンズ（NA 1.42）およびイメージングソフトウェアで2光子顕微鏡を使用して4は、典型的な顕微鏡の構成を示す図 。蛍光を有する膜880 nmのフェムト秒レーザーパルスによって励起された非透過性蛍光細胞外マーカーとしてSRBを使用して画像エキソサイトーシスのイベントは、550〜650 nmで検出しました。刺激に対する膵島の応答を記録します。
    6. 小さな蛍光スポットの突然の出現によって、単一の細胞外のイベントを識別（解像度10ピクセル/1; m）および関心領域（〜0.78μmの2）の上に、蛍光信号の高速立ち上がり段階で確定してください。

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結果

膵島収量および精製

正常な野生型マウスの場合、約200膵島が期待されます。健康な島は、明るく見える丸い形と滑らかな境界線を持っています。アンダー消化バッチが少ない膵島と腺房細胞取り付け膵島（ 図3）を有し、一方の上に消化分離バッチは通常小さく、ファジー島を持っています。より良い血糖マウスは100の下半透明の外観（と小さい島を持っているより悪い血糖マウスと比較して、より大きなより明るく膵島（最大300島を）持っていると糖尿病のdb / dbマウスは、膵島収量および外観は、疾患の進行に依存します膵島）

2光子アッセイ

2光子イメージングは​​、単一インスリン顆粒の融合のレベルでのインスリン分泌を測定するための間接的アッセイです。例えばグルコースまたは高カリウムなどの刺激に応答して、インスリン顆粒は、原形質膜と融合し、細胞外色素SRBは番目に入ります直径の急激な蛍光スポット〜400nmの外観をもたらす電子顆粒（ 図5）。

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ディスカッション

膵島単離の中で最も重要な要因は、膵臓の初期灌流です。かなり低い膵島収量の灌流膵臓結果の下に。他の要因も、このような消化時間と部分的に灌流のレベルを補うことができる振とうのレベルとして分離の質に影響を与えます。例えば、完全に灌流膵臓を静かに振盪しながら下には、膵臓が困難に振盪しながら〜20分の消化を必要とする可能性が消化対照的に、18分30秒〜37℃でインキュベートする必要があります。私たちの手に2つの消化酵素の混合物は、いずれか単独よりも優れ膵島単離を提供します。コラゲナーゼ唯一の方法は、消化時間は決定的に膵島収量とわずか30秒の時間差劇的に品質に影響を与える可能性に影響を与えます。歩留まりが許容可能であるが、下の消化が時々起こるリベラーゼの場合のみ、我々は、コラゲナーゼの添加がより良い結合組織を消化するのに役立つと考えています。

我々は、DB / dbマウスにも兄弟の中で、多様な糖尿病の表現型を持って発見しました。その結果、犠牲にする前に、各動物の耐糖能試験を日常的に実行されます。これは、注入されたグルコースに応答して、曲線下のグルコースレベルと面積を安静...

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開示事項

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

この作業は、オーストラリア研究評議会助成金DP110100642(PTへ)およびNational Health and Medical Research Council助成金APP1002520およびAPP1059426(PTおよびHYGへ)によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
リベラーゼ TL 5 mgRoche-5401020001
Collagenas Type IV-1gGibco-Life Technologies17104-019
Histopaque 1077 500 mlSigma Aldrich10771
RPMI 1640 Medium (10x) 1LSigma AldrichR1383to prepare isolation media
RPMI 1640 (1x) 500 mlGibco-Life Technologies21870-076培養培地を調製するには
ペニシリン-ストレプトマイシン 100 mlGibco-Life Technologies15140-122培養培地を調製する 
ウシ胎児血清 500 mlGibco-Life Technologies10099-141培養培地
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)Gibco-Life Technologies11966-025を希釈してリベラーゼ
Metamorph プログラムMolecular Devices, USA2 光子画像を分析

参考文献

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