細胞膜小屋微粒子（MPS）を単離し、それらの病態生理学的効果は、様々なモデルで研究することができるアクティブな生物学的な小胞である。ここでは、Tリンパ球（のLMP）由来のMPを生成する気道上皮細胞に対するアポトーシス促進効果を実証するための方法を記載する。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
方法論記事
気道上皮細胞上でのアポトーシス促進効果のリンパ球微粒子および検出の生成
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
細胞間コミュニケーションにおける細胞膜由来の小胞の生物学的役割への関心が近年増加している。微粒子（MPは）は0.1μm〜1μmの直径の範囲の、小胞のような一種類であり、そして典型的に活性化またはアポトーシスを起こして、真核細胞の細胞膜から脱落。ここでは、D.のLMPアクチノマイシンで刺激しアポトーシスCEM T細胞からTリンパ球由来の微粒子（のLMP）の生成が多段階分画遠心法によって単離し、フローサイトメトリーを使用して特徴づけられる記述する。このプロトコルはまた、マウス初代呼吸気管支組織外植片から派生気管支上皮細胞上のLMPのアポトーシス促進効果を実証するための、その場で細胞死検出法を提案する。本明細書に記載の方法は、in vitroでのアポトーシスリンパ球からのLMPの豊富な量を単離するための再現可能な手順を提供する。のLMPは、導出このように様々な疾患モデルの特性を評価するために使用され、薬理学および毒性試験のためにすることができる。気道上皮は、外部環境と下層組織との間に保護物理的および機能的なバリアを提供することを考慮すると、気管支組織外植片ではなく、不死化上皮細胞系の使用は、気道管組織を必要とする研究のための有効なモデルを提供する。
概要
微粒子(MP)は、細胞の活性化またはアポトーシス後に放出される生物学的に活性なサブミクロン膜小胞です。MPは、健康な細胞と損傷した細胞の両方に由来し、多くの生理学的および病理学的プロセスに関与しています。1 MPは、ヒト血漿だけでなく、炎症組織やアポトーシス組織でも検出されています。細胞膜由来MPの生物学的有用性は、細胞シグナル伝達モデルや薬理学的ツールなど、さまざまな環境で実証されています。2,3 私たちはこれまでに、アクチノマイシンD刺激(アポトーシスの誘導)後にTリンパ球に由来するLMPが血管新生を抑制し、内皮細胞の生存と増殖を阻害することを示しました。4,5 LMPの抗血管新生効果は、in vitroでTリンパ球を活性化するために使用される刺激によって大きく異なる可能性があります。6
気道上皮は、物理的および機能的な保護バリアとして機能します。気道内のTリンパ球の数が増えると、細胞の損傷や気道の炎症に寄与する可能性があります。7 私たちは、LMPがヒト気管支上皮細胞のアポトーシスを誘導することを示しました8、これはLMPがin vivoで気管支上皮のバリア機能を変化させる可能性があることを示しました。アポトーシス細胞は、in situ DNA断片化を検出するTUNEL法を用いて同定する....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
注：男性C57BL / 6マウス（5-7週齢）をチャールズ·リバー·ラボラトリーズインターナショナル社（セント·コンスタント、ケベック州、カナダ）からのものであり、CHUサントジャスティン動物実験委員会によって承認されたプロトコルに従って操作。マウス気管支組織外植片は、上皮細胞上のLMPのアポトーシス促進効果を調査するための主要な気管支上皮細胞の良い情報源を提供する。このプロトコルは、のLMP のインビトロ発生、ならびにLMPで処理した気管支組織外植片におけるアポトーシス上皮細胞を検出するための方法を記載する。このプロトコルは、3つのセクションで構成されています。
1.のLMP産生および特徴
注：汚染を防止するために、この実験で使用されるすべての材料は滅菌されているか、オートクレーブしていることを確認してください。特に断りのない限り、無菌状態の下で生物学的安全キャビネット内で室温ですべての手順を実行します。
1.1）刺激とMPのコレクション9
- 37℃の水浴1000万CEM T細胞のアリコートを解凍する。 10ミリリットルで希釈し、予め温めた無血清200 GX 5分で15ミリリットル滅菌チューブと遠心分離機で、例えばX-VIVOのような造血中。予め温め培地5mlの上清と再懸濁細胞を吸引除去する。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
のLMPは（FACS）分析およびMPの97％（≤1μm）をアネキシンV-Cy5での陽性（ 図1Aおよび1B）であった1μmのビーズを使用してゲート制御を蛍光活性化細胞ソーティングによって、アネキシンV染色10で特徴付けた。典型的には、のLMPの約2.5mgが、このプロトコルに従って得た。 C57BL / 6マウスからの気管支組織外植片は、車両とのLMP処理を行った。気管支セクションの組織病理学的分析は、気管支上皮の構造的完全性に対するのLMPの効果を明らかにした。対照外植では、気管支上皮は（ 図2A）、主に損傷を受けていないでした。しかし、のLMP処理した外植で、表在上皮細胞層が損傷や紛失、および上皮細胞の高さと密度（ 図2B）の大幅な減少があったした。 TUNEL陽性染色（アポトーシスのマーカー）（対照と比較してのLMP処理した気管支上皮でより顕著であった図3）。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
MPは、細胞間のクロストークのアクティブなメディエーターであり、それらの研究は、科学の多くの分野において有望である。11本研究は、アポトーシスT細胞株由来のLMP のインビトロでの大規模生成のための詳細なプロトコルを提示した。これらのMPは、リンパ球分子の大きなレパートリーを発現し、生物学的細胞および組織の恒常性の調節に関与している。しかし、異なる供給源に由来のLMPは、生物学的に異なっていてもよい。4,9,12,13
のLMPは、in vitroでそれらを生成するために使用される刺激は、それらが由来する細胞によって異なる特性を示す。このように、 生体内で生成されたのLMPからのデータの不死化細胞株由来のLMPを使用して、in vitroで得られたデータの外 挿は、慎重に行われるべきである。
このプロトコルは、国会議員の単離のために必要ないくつかの遠心分離工程を説明する。したがって、Careful操作は、こ.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者らは、開示することは何もない。
謝辞
ビジョン保健研究ネットワーク - この作品は、ヘルスリサーチ（178918）、フォン·ド·RECHERCHEエンサンテケベックのカナダの研究所からの助成金によってサポートされています。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| LMPの産生と特性評価 | |||
| CEM T細胞 | ATCC | CCL-119 | |
| X-VIVO 15 ミディアム | Cambrex, Walkersville | 04-744Q | |
| Flask T75 | Sarstedt | 83.1813.502 | |
| Flask T175 | Sarstedt | 83.1812.502 | |
| Actinomycin D | シグマケミカル(株) | A9415-2mg | |
| PBS | Lifetechnologies | 14190-144 | |
| 0.22 & マイクロ;mフィルター | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Annexin-VCy5 | BD Pharmagen | ||
| FACSフロー溶液 | BDバイオサイエンス342003 | ||
| 蛍光マイクロビーズ(1µm) | 分子プローブ | T8880 | |
| ポリステレン計数ビーズ (7 & micro;m) | 前髪研究所 | PS06N/6994 | |
| ポリプロピレン FACS チューブ | ファルコン | 352058 | |
| 1 ml ピペット | フィッシャー | 13-678-11B | |
| 5 ml ピペット | ファルコン | 357543 | |
| 25 ml ピペット | アルティデント | DL-357551 | |
| 1.5 ml 円錐形ポリプロピレン マイクロ チューブ | Sarstedt | 72.690 | |
| 15 ml コニカルポリプロピレンチューブ | Sarstedt | 62.554.205 | |
| 50 ml コニカルポリプロピレンチューブ | Sarstedt | 62.547.205 | |
| 50 ml 高速ポリプロピレン共重合体チューブ | Nalgene | 3119-0050 | |
| 250 ml 高速ポリプロピレンボトル | ベックマン | 356011 | |
| プロテインアッセイ (Bradford アッセイ) | Bio-Rad Laboratories | 500-0006 | |
| タンパク質アッセイ標準 II | バイオ・ラッド・ラボラトリーズ | 500-0007 | |
| 試験管 16 x 100 | VWR | 47729-576 | |
| 試験管 12 x 75 | Ultident | 170-14100005B | |
| セルインキュベーター | マンデル | ヘラセル150 | |
| 遠心分離機 | IEC | Centra8R | |
| 高速遠心分離機 | ベックマン | アバンティJ8250ml | |
| ボトル用高速ローター | ベックマン | ||
| BD Bio-sciences | FACS Calibur | ||
| 分光光度計 | ベックマン | シリーズ 600 | |
| 気管支組織外植片および切片 | |||
| C57BL/6マウス(5-7週齢) | Charles River Laboratories, Inc. | ||
| マウスエアウェイプリマセル&トレード;システム: | CHI Scientific, Inc. | 2-82001 | |
| リブバック炭素鋼メスブレードベ | クトンディキンソンAcuteCare | 371310 | #10 |
| ハンドル | Fine Science Tools Inc. | 10003-12 | #7 |
| 位相差倒立顕微鏡 | オリンパス光学(株) | CK2 | |
| 高O2ガス混合物 | バイタエア・カナダ社 | ||
| モジュール式培養器チャンバー | Billups-Rothenberg Inc. | MIC-101 | |
| MaxQ 4000インキュベーションオービタルシェーカー | バーンステッドラボライン | SHKA4000-7 | |
| 12ウェル組織培養プレート | ベクトン・ディッキンソン・アンド・カンパニー | 353043 | |
| プラスチック組織培養皿 (100 mm) | Sarstedt, Inc. | 83.1802 | |
| 手術用ハサミ | Fine Science Tools Inc. | 14060-09 | 直線、シャープ、長さ9cm |
| 湾曲グレーフ鉗子 | Fine Science Tools Inc. | 11052-10 | |
| 加湿CO2インキュベーター | マンデル・サイエンティフィック・カンパニー・インク | SVH-51023421 | |
| 病理組織学的検査 | |||
| ホルマリンホルムアルデヒド | Sigma-Aldrich, Inc. | HT5011 | |
| パラフィン | フィッシャーサイエンティフィック インターナショナル株式会社 | T555 | |
| エチルアルコール | メルク KGaA, ダルムシュタット | EX0278-1 | |
| グルタルアルデヒド | シグマ・アルドリッチ株式会社 | G6403 | |
| カコディレート | Sigma-Aldrich, Inc. | 31533 | |
| 顕微鏡スライドVWR | サイエンティフィック社 | 48300-025 | 25x75 mm |
| キシレン | フィッシャー科学 インターナショナル株式会社 | X5-4 | |
| メイヤーズヘマトキシリン | Sigma-Aldrich, Inc. | MHS16 | ファンネル 濾紙付き |
| HCl | フィッシャーサイエンティフィック インターナショナル・インク | A144S-500 | |
| エオシン | シグマ・アルドリッチ株式会社 | HT110116 | 濾紙付きファンネル |
| Permount™実装媒体 | サーモフィッシャーサイエンティフィック社 | SP15-100 | |
| ガラスカバースリップ | 外科医療工業株式会社 | 84503 | 24回;24 #1 |
| TUNEL検出キット | In Situ細胞死検出、POD | 11 684 817 910 | |
| オーブン | Despatch Industries Inc. | LEB-1-20 | |
| ロータリーミクロトーム | ライカマイクロシステムズ(株) | RM2145 | |
| 濾紙 | Whatman International Ltd. | 1003150 | #3 |
| 顕微鏡 | ニコンイメージングジャパン株式会社 | E800 | |
| 皿一式 | ウィートン・インダストリーズ社 | 、ラック、カバー | 900200 |
| 1.5 mlエッペンドルフチューブ | Sarstedt Inc. | 72.69 | 39x10 mm |
| オービタルおよびレシプロウォーターバス | ExpotechUSA | ORS200 | |
| リン酸緩衝生理食塩水 | GIBCO | 14190-144 | |
| ヒュームフード | Nicram RD Service | 3707E |
参考文献
- Tushuizen, M. E., Diamant, M., Sturk, A., Nieuwland, R. Cell-derived microparticles in the pathogenesis of cardiovascular disease: friend or foe. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (1), 4-9 (2011).
- Martinez, M. C., Tual-Chalot, S., Leonetti, D., Andriantsitohaina, R.
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
