嗅覚ニューロンの生理学的特性の分析には、まだ技術的な限界があります。ここでは、遺伝子標的マウスの嗅上皮の無傷の準備で穴あきパッチクランプを介してそれらを記録します。この技術により、特定の嗅覚受容体を発現するニューロンの特定のリガンドに対する膜特性と応答の特性評価が可能になります。
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この記事について
サマリー
要約
特異的なリガンドで刺激すると嗅細胞（OSN）の生理的反応を分析する嗅覚主導の行動とその変調の基礎を理解することが重要です。これらの符号化特性は、匂い分子と嗅覚受容体（OR）との間の最初の相互作用に大きく依存OSNsで表されます。表現または重要であるのアイデンティティ、特異性およびリガンドスペクトル。 ORのリガンドを発見する確率は非常に低い上皮内でランダムに選択されたOSNで表されます。この課題に対処するため、このプロトコルは、定義されたORのプロモーターの制御下で蛍光タンパク質GFPを発現する遺伝子タグ付きマウスを使用しています。 OSNsは、隣接するセルは、それらの成熟と機能に影響を与えると、鼻腔ライニングしっかりと組織化上皮に位置しています。ここでは、OSNs eの特性をそのまま嗅上皮を分離し、パッチクランプ記録を介して記録する方法を説明します定義された嗅覚受容体をxpressing。プロトコルは、隣接する組織の影響力を維持しながら一つはOSNの膜特性を特徴付けることができます。パッチクランプ結果の分析は、リガンド/ OR相互作用、伝達経路および薬理学、OSNs 'コードの特性と膜レベルでのそれらの変調の正確な定量化をもたらします。
概要
嗅細胞（OSN）は、嗅覚の最初のステップを表しています。げっ歯類で鼻腔を裏打ちする嗅上皮に位置し、彼らは脳にその軸索を介して送信される活動電位への臭気物質の化学情報を変換します。より良い嗅覚符号化メカニズムを理解するためには、OSNsの伝達及び膜特性を特徴付けることが必要です。最近まで、哺乳類OSNsの性質を特徴づけるために使用される技術のほとんどが解離OSNs 1-4で行いました。解離過程は、その環境からOSNsを解放するために、様々な機械的および化学的（ すなわち 、酵素）プロセスを使用しています。これらのプロセスは、記録のために利用可能な細胞の数が少ないを誘導します。この低い数字は、GFP標識細胞の場合にはより一層重要になることがあります。解離もsurvivを高めることができるOSNsと嗅上皮の他の細胞との間の局所細胞と細胞の相互作用を除去しますアルとOSNsのプロパティの調整。解離手順を回避するためには、無傷の製剤は、5開発しました。
各OSNは、大規模な多重遺伝子ファミリーの6から選択される一つの嗅覚受容体（OR）を発現します。マウスの主嗅上皮で発現〜千論理和があります。野生型動物で、または多数の、同一または非常に低い発現をOSNsを記録するための機会のために。これらの制限を克服するために、遺伝子標的化マウスが利用可能であるもので識別されたOR蛍光タンパク質で標識されている
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プロトコル
このプロトコルは、大学·デ·ブルゴーニュの動物ケアのガイドラインに従っており、大学·デ·ブルゴーニュの倫理委員会によって承認されました。
1.動物
- ジャクソン研究所で入手可能な遺伝子操作されたOR-IRES-tauGFPマウスを使用してください。これらのマウスは、嗅覚系19の軸索標的と発展を分析するために、ピーター·Mombaerts「研究室で開発されました。例えば、MOR23-IRES-tauGFPライン、在庫数006643は、公式の歪み名B6を負い、129P2- Olfr16 tm2Mom / MomJ。同様に、SR1-IRES-tauGFPライン、在庫数6717は、正式名称のB6を負い、129P2- Olfr124 tm1Mom / MomJを。
- 動物の年齢について：プロトコルのより良い成果のために、年齢の2および4週間の間、動物を使用しています。この年齢層では、解剖が容易（より柔らかい骨、より強固な嗅上皮）と樹状ノブが双方向であるですgger古い動物と比較します。
電極と溶液の調製
- 刺激ピペットの場合：購入はピペットを刺激prepulled。そうでない場合は、手動でそれらを準備。
- 炎を使用して、先端から約1cmで6、1mmのガラス....
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結果
このプロトコルの結果は、解剖の品質に依存します。この解剖の手順は、（ すなわち、上皮の損傷を避けるために）短い（10〜15分未満）および正確でなければなりません。 図1は、理想的な準備は、異なる倍率レベルでどのように見えるかを示しています。明視野下での低倍率では（例えば、支持細胞OSNsのノブなど）異なる細胞型は区別できる（ 図1A）です。最高倍率レベルでは、典型的には80X 160Xに、明視野で、OSNsの樹状ノブは支持細胞（ 図1B）から明確に区別する必要があります。蛍光灯の下では、唯一の樹状ノブ、GFP標識細胞の繊毛は、（ 図1C）表示されます。 2つの画像を比較することにより、標識された細胞は、記録ピペット（ 図1D）に近づけることができます。
解剖の温度はそれほどリューションと解剖のタイミングが重要です。解剖の最初の部分は、中隔（3.2節3.1.1）の調製は、氷冷溶液中に5から10分以内.......
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ディスカッション
正しく健全なOSNsの特性を監視するために、このプロトコルの能力は、製剤の品質に大きく依存します。したがって、解剖の手順は非常に重要です。最初に、解剖媒体の質（pHは、浸透圧）、酸素および温度（氷のように冷たいが、凍結していない）に注意を払うことが重要です。第二に、解剖ツールと上皮の操作は、損害を回避することができるように制限する必要があります。最後に、可能な限り最大のOSN集団にアクセスするために、できるだけ平坦製剤を得ることが重要です。
解剖の質は、健康な準備を得ることが基本です。しかし、異なるアプローチが解剖のために使用することができます。ここでは解剖を背ために腹を提示するが、一部のユーザーは、急速に鼻腔を開き、嗅上皮の中隔の凹部への迅速なアクセスを持つように解剖背を開始することを好むことができます。各ユーザーは、従ってPRを適応させることができます関心領域の健全な準備に到達するための最も効率的な戦略のotocol。
準備が顕微鏡下になると、準備の健康の永久モニタリングが必要です。実際、不健康な準備がギガシールに到達する.......
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開示事項
著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言する。
謝辞
著者は、OR-GFPマウスの寛大な贈り物に対してPeter Mombaertsに感謝したいと思います。アンヌ・ルフランとCSGAの動物施設は、優れた動物の世話をしています。資金は、CNRSがATIPおよびATIP Plusの助成金、Conseil Régional de Bourgogne(FABERおよびPARIの助成金)、Université de Bourgogne(BQRプログラム)を通じて提供しました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ファラデーケージ | TMC | 63-500シリーズ | が必要:環境(実験者の動き、冷却コンピュータ用ファンなどの機器の振動など)によって引き起こされる振動から記録システムを分離します。また、ファラデーケージと一緒に購入することも、カスタムメイドのファラデーケージを装備することもできます。このケージは、環境光学系 |
| からの電気ノイズを避けるために推奨されます顕微鏡 | リンパス | BX51WI | 直立マイクロコープ落射蛍光を装備;ユーザーの好みに応じて固定または移動ステージ |
| オリンパス | LUMPLFL40XW | 少なくとも2つの目的が必要です:細胞への粗いアプローチのための4倍または10倍、および40倍の浸漬長距離例オリンパスLUMPLFL40XW / IR /0,8 / WD:3.3 MM | |
| 拡大鏡 | オリンパス | U-TVCAC | 絶対に必要:対物レンズとカメラの間の光路に配置されています。記録電極カメラOlympus DP72でノブに正確に到達するために画面上の画像を拡大することができます |
| 良いカメラは、蛍光だけでなく、明視野でニューロンを見るために必要です;制御ソフトウェアは簡単で、写真を撮り、細胞への電極のアプローチを監視するためにライブカメラ画像を行うことができます。超高感度カメラは、 | |||
| オリンパス/クロマ | フィルタリング | 。GFPの例:励起:BP460-490:エミッション:HQ530/50m | |
| アンプ | HEKA | EPC10 USB | は、記録電極を流れる電流を監視し、TTL信号をスプリッツァーに送信することでパフを制御します。EPC10のセットアップは、コンピューター |
| ソフトウェア | によって制御されますHEKA | Patchmaster | 、実験中のアンプを制御します |
| マイクロマニピュレーター | Sutter | MP225 | 精密マイクロマニピュレーターは、マイクロメーターの1/10までの正確な動きを可能にします。このモデルは非常に安定しています。 |
| 電極プー | ラーSutter | P97 | をドリフトさせる可能性のある油圧マニピュレーターを避けてくださいFT345-Bワイドトラフフィラメント付き。 約2μの記録用ピペットを準備するため。細胞に到達するための長い先端を持つm直径。抵抗は15から20MΩであるべきです穴あきパッチクランプ溶液 |
| ガラス | Sutter | BF120-69-10 | 私たちの記録条件では、このガラスはピペットの記録に理想的です |
| 室 | ワーナーインスツルメンツ | RC-26G | チャンバーは顕微鏡下で準備を設定するために必要です。チャンバーの中央で調製を維持するために、ネット/アンカーを使用する必要があります。 |
| ガラス | WPI | TW100F-4 | 7のグループで取り付けられ、これらのピペットは |
| 、プルとツイストの関連付けによって | マルチバレルプー | ラーMDI | PMP-107-Z |
| の精密圧力インジェクター | トゥーイー | カンパニーP / N T25-1-900シングルチャンネル | この精密圧力インジェクター は、マルチバレルプーラーで排出される圧力を制御します。手動またはアンプによって5Vによって制御されます。TTLs |
| マイクロマニピュレーター | 成茂 | YOU-1 | 粗いマニピュレーターは、パフ電極を記録部位に近づけるのに十分 |
| チューブ N/A | タイゴンチューブ パファーからの圧力をパフピペット | ||
| に 溶液/灌流/化学 | |||
| 真空ポンプ | ガードナー デンバー | 300シリーズ | 振動膜ポンプは、他のタイプのポンプよりも静かで効率的です |
| 灌流システム | N/A | N/A | 重力灌流システム 記録室から外部溶液を出し入れするためのポリエチレンチューブ付き |
| ナイスタチン | Sigma-Aldrich | N3503 | 穴あきパッチクランプ |
| ジメチルスルホキシ | Sigma-Aldrich | D5879 | の内部溶液を罠にかけるために必須穿孔パッチの内部溶液のナイスタチンを二溶かすために使用されます |
| 塩化ナトリウム | Sigma-Aldrich | S9625 | 細胞外溶液 |
| 塩化カリウム | Sigma-Aldrich | P4504 | 細胞内/細胞外溶液 |
| 塩化カルシウム二水和物 | Sigma-Aldrich | C7902 | 細胞外溶液 |
| リン酸ナトリウム 一塩基性一水和物 (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S9638 | 外溶液 |
| 硫酸マグネシウム七水和物(MgSO4 7H2O) | Sigma-Aldrich | 63140 | 細胞外溶液 |
| グルコース | Sigma-Aldrich | G8270 | 細胞外溶液 |
| 重炭酸ナトリウム | Sigma-Aldrich | S6297 | 細胞外溶液 |
| EGTA(エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N′,N′-四酢酸) | Sigma-Aldrich | E3889 | 内部溶液 |
| 水酸化カリウム | Sigma-Aldrich | P1767 | 溶液 |
| メチルスルホキシ | Sigma-Aldrich | W387509 | 細胞内溶液 |
| Hepes-Na | Sigma-Aldrich | H7006 | 内溶液 |
| スクロー | スSigma-Aldrich | S0389 | 細胞内溶液 |
参考文献
- Lowe, G., Gold, G. H. Nonlinear amplification by calcium-dependent chloride channels in olfactory receptor cells. Nature. 366 (6452), 283-286 (1993).
- Ponissery Saidu, S., Dibattista, M., Matthews, H. R. Odorant-induced responses recor....
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再版と許可
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