方法論記事

無傷の神経上皮におけるマウス嗅細胞の穿孔パッチクランプ記録：同定された嗅覚受容体を発現するニューロンの機能解析

DOI：

10.3791/52652

⸱

2015年7月13日

 , 
1UMR Centre des Sciences du Goŭt et de l'Alimentation, CNRS, INRA, Université de Bourgogne

この記事について

サマリー

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嗅覚ニューロンの生理学的特性の分析には、まだ技術的な限界があります。ここでは、遺伝子標的マウスの嗅上皮の無傷の準備で穴あきパッチクランプを介してそれらを記録します。この技術により、特定の嗅覚受容体を発現するニューロンの特定のリガンドに対する膜特性と応答の特性評価が可能になります。

要約

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特異的なリガンドで刺激すると嗅細胞（OSN）の生理的反応を分析する嗅覚主導の行動とその変調の基礎を理解することが重要です。これらの符号化特性は、匂い分子と嗅覚受容体（OR）との間の最初の相互作用に大きく依存OSNsで表されます。表現または重要であるのアイデンティティ、特異性およびリガンドスペクトル。 ORのリガンドを発見する確率は非常に低い上皮内でランダムに選択されたOSNで表されます。この課題に対処するため、このプロトコルは、定義されたORのプロモーターの制御下で蛍光タンパク質GFPを発現する遺伝子タグ付きマウスを使用しています。 OSNsは、隣接するセルは、それらの成熟と機能に影響を与えると、鼻腔ライニングしっかりと組織化上皮に位置しています。ここでは、OSNs eの特性をそのまま嗅上皮を分離し、パッチクランプ記録を介して記録する方法を説明します定義された嗅覚受容体をxpressing。プロトコルは、隣接する組織の影響力を維持しながら一つはOSNの膜特性を特徴付けることができます。パッチクランプ結果の分析は、リガンド/ OR相互作用、伝達経路および薬理学、OSNs 'コードの特性と膜レベルでのそれらの変調の正確な定量化をもたらします。

概要

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嗅細胞（OSN）は、嗅覚の最初のステップを表しています。げっ歯類で鼻腔を裏打ちする嗅上皮に位置し、彼らは脳にその軸索を介して送信される活​​動電位への臭気物質の化学情報を変換します。より良い嗅覚符号化メカニズムを理解するためには、OSNsの伝達及び膜特性を特徴付けることが必要です。最近まで、哺乳類OSNsの性質を特徴づけるために使用される技術のほとんどが解離OSNs 1-4で行いました。解離過程は、その環境からOSNsを解放するために、様々な機械的および化学的（ すなわち 、酵素）プロセスを使用しています。これらのプロセスは、記録のために利用可能な細胞の数が少ないを誘導します。この低い数字は、GFP標識細胞の場合にはより一層重要になることがあります。解離もsurvivを高めることができるOSNsと嗅上皮の他の細胞との間の局所細胞と細胞の相互作用を除去しますアルとOSNsのプロパティの調整。解離手順を回避するためには、無傷の製剤は、5開発しました。

各OSNは、大規模な多重遺伝子ファミリーの6から選択される一つの嗅覚受容体（OR）を発現します。マウスの主嗅上皮で発現〜千論理和があります。野生型動物で、または多数の、同一または非常に低い発現をOSNsを記録するための機会のために。これらの制限を克服するために、遺伝子標的化マウスが利用可能であるもので識別されたOR蛍光タンパク質で標識されている7-9表す全てOSNs。これらの標識されたOSNsは、前述の欠点を持つ解離準備7,10,11で機能解析を行うために使用されました。遺伝的に標識されたマウスからの無傷の上皮の準備5は、したがって、これらの問題を回避します。それはviの中に近い環境で正確に定義された論理和を表現OSNsの活動の監視を可能にしますできるだけVO。また、OSNsのパッチクランプ記録は、膜の特性、伝達経路の薬理学、リガンド/ OR相互作用の正確な分析を可能にします。すべてのこれらのトピックはほとんど細胞外記録を用いて分析することはできません。我々は、嗅覚受容体SR1とMOR23 12,13を表現OSNsの応答を監視するには、この技術を使用していました。技術の実現可能性は、ニューロン15,16を表現OSNs 14を発現しているMOR23上の他のグループだけでなく、上の他の論理和により確認されました。 OSNsの定義された集団の監視は17、付臭剤誘起塑性18、及び臭気コーディング15における嗅覚受容体の配列の変異の役割を老化、このような開発14のような多くの異なる状況での特性の分析につながることができます。このプロトコルは、このように、膜レベルで定義されたOSNsの機能的特性を監視するための強力なツールを提供します。

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プロトコル

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このプロトコルは、大学·デ·ブルゴーニュの動物ケアのガイドラインに従っており、大学·デ·ブルゴーニュの倫理委員会によって承認されました。

1.動物

  1. ジャクソン研究所で入手可能な遺伝子操作されたOR-IRES-tauGFPマウスを使用してください。これらのマウスは、嗅覚系19の軸索標的と発展を分析するために、ピーター·Mombaerts「研究室で開発されました。例えば、MOR23-IRES-tauGFPライン、在庫数006643は、公式の歪み名B6を負い、129P2- Olfr16 tm2Mom / MomJ。同様に、SR1-IRES-tauGFPライン、在庫数6717は、正式名称のB6を負い、129P2- Olfr124 tm1Mom / MomJを。
  2. 動物の年齢について：プロトコルのより良い成果のために、年齢の2および4週間の間、動物を使用しています。この年齢層では、解剖が容易（より柔らかい骨、より強固な嗅上皮）と樹状ノブが双方向であるですgger古い動物と比較します。

電極と溶液の調製

  1. 刺激ピペットの場合：購入はピペットを刺激prepulled。そうでない場合は、手動でそれらを準備。
    1. 炎を使用して、先端から約1cmで6、1mmのガラスピペットを曲げます。アイレットによって強化1.5センチメートル熱収縮チューブでこれらの6つのピペットプラスストレート7 番目に挿入します。
    2. 熱は、互いに取り付けバレルを維持するためのチューブを縮小します。バレルの他の端に追加の熱収縮チューブを取り付けます。マルチバレルプラーで、この刺激ピペットを引き出します。
    3. 曲がった先端を強化するためにアイレットの周りにいくつかの白い液体接着剤を追加します。ドライO / Nましょう。
  2. （：; pHは7.6と305 mOsmでのNaCl 124、KClの3、 硫酸マグネシウム1.3、 塩化カルシウム2、NaHCO 3で26、のNaH 2 PO 4 1.25、グルコース15mMの中で）正常なリンガー細胞外溶液の1または2 Lを準備します。 4°Cで保管してください使用するまで。
  3. （mm表示）細胞内のストック溶液を調製する：KClを70、KOH 53、メタンスルホン酸30、EGTA 5、HEPES 10、ショ糖70。 pHを7.2（KOH）と310ミリオスモル。使用するまで4℃で保管してください。数週間のために良いです。
  4. 実験前（直前に）即時にナイスタチンを有する細胞内記録液を準備します。
    1. ナイスタチンの3 mgの計量、DMSOの50μlを添加します。完全に希釈されるまでボルテックス20秒後、2〜3分を超音波処理します。
    2. 細胞内の原液5mlのDMSO-ナイスタチン溶液20μlを追加します。ボルテックス20秒は、その後3分間超音波処理します。 4℃でこの溶液を維持し、直接光から保護し、ナイスタチンは、光に敏感です。この溶液は、数時間のために使用することができます。毎日交換してください。
    3. 嗅上皮製剤は、顕微鏡下であると、電極を埋めるために火炎伸長イエローチップで1mlシリンジに、この溶液の一部を取ります。直接光から保護します。 RT、ナイスタチン溶液を一度に安定していません。時間ごとに注射器や氷の中にそれを保持1mlの溶液を交換してください。
  5. 内部ナイスタチン溶液で15〜20MΩの抵抗と長い首と小さな先端（〜2μm）を得るために、プラーと記録電極を引き出します。
  6. ヒュームフードの下でDMSO中に0.5 Mで、付臭剤溶液を調製します。アリコートし、使用するまで-20℃で維持します。所望の濃度まで、リンゲル液中の付臭剤を希釈します。刺激ピペットを埋めます。

嗅上皮の調製

注：OR-IRES-tauGFPマウスまたはプロモーターの制御下tauGFPを発現します。これらのマウスでは、関心のORを表す全てのニューロンをGFPで標識されます。このプロトコルは、すべてのゾーンで発現和するように適合されています。しかし、解剖や録音は背側ゾーンで発現論理和のために容易です。

  1. ケタミンとキシラジンの混合を注入することにより、動物を麻酔（150ミリグラム/ kgおよび10mg / kgのBODY体重、それぞれ）。断頭は、若いマウスに対する鋭いハサミでまたは古いマウスに対する適切に維持げっ歯類ギロチンで行うことができます。
    1. リング解剖ハサミを使用すると、背側の皮膚を介して長手方向の内側の切開を行います。それを引き離すことにより、皮膚を削除します。はさみを使用して、顎関節に下顎を切りました。歯に冠状カット平行な上部の前歯を削除します。
    2. 目の後ろの頭の冠状カットを行い、ヘッドのだけ前方部分を保持します。スコープの下で解剖用の氷冷リンゲル液でそれを浸し。
  2. スコープの下で解剖：腹側に、上顎/歯に沿った長手方向のカットを行います。鼻腔の背側面以下、縦方向に背側骨をカットします。ほとんどの骨と口蓋を削除します。セプタム、室温で酸素化リンガーにそれに接続されている上皮を転送します。
  3. 最終的な解剖のための：右の記録を開始する前にセッションでは、ピンセットで基本となる隔壁から上皮を引き剥がします。鉗子でとの密着性が強い中隔の前の部分にある2つの4〜5ミリメ​​ートルのシザーカット（使用microvannasはさみ）で上皮を外します。
    1. 慎重中隔上皮への背側の接続に沿ってそれを切断することにより鋤鼻器官を削除します。上向きに粘液層を有する記録チャンバーに上皮を移します。ハープと室内でフラットに保ちます。
  4. 蛍光光学系と感度カメラを搭載した正立顕微鏡下でチャンバーをインストールします。 40Xの水浸対物レンズ（開口数0.8）と拡大レンズによって達成余分2Xや4X拡大による高倍率でのコンピュータ画面上の準備を可視化します。室温で酸素化リンガー（1-2 ml /分）で連続的に灌流。

4.レコーディングセッション

  1. 蛍光細胞を検索：480で準備を励起530から550 nmの範囲の光を放射するためのEGFPナノメートル;蛍光と明視野の下で確実に表示されている1樹状ノブをターゲットにしています。
  2. ナイスタチンと細胞内液と電極を埋めます。そっと電極をタップして気泡を除去。
  3. 電極ホルダに電極を挿入し、ピペットで正圧を適用します。抵抗は15〜20MΩでなければなりません。
  4. セルの近くに電極をもたらします。抵抗は〜40MΩに達すると、正圧を解放し、ギガシールに到達するまでのわずかな負圧を適用します。
  5. シールに到達すると、約-75 mVの膜電位に設定し、
  6. セルが開かれると、刺激プロトコル、薬理学的治療を進めます。単一の付臭剤の刺激、自発的活動の記録200〜500ミリ秒の応答を測定するために、500ミリ秒のために刺激して、最大10秒13のための細胞の応答を測定します。薬理学的治療については、次の薬剤を灌流所望の濃度20。

5.データ解析

  1. 以下のように、付臭剤の刺激によって誘発された電流を分析します（ミリ秒での最大振幅の90％に達するのに必要な時間、）最大振幅、立上り時間、合計電流（PASの曲線下面積）、時間を50％に（ミリ秒で開始し、最大振幅の50％で応答オフセットとの間の時間）。
    1. 描き、ヒル方程式を用いて用量反応曲線をフィット、異なる濃度（最大振幅に達した）ピーク伝達電流を使用する：I = Imaxと/（1 +（K 1/2 / C）N）Iがピーク電流を表します。 、最大応答の半分に達したときのK1 / 2濃度、C付臭剤の濃度とnヒル係数を飽和濃度で最大応答をIMAX。
  2. 最大脱分極のための電流クランプ、踏太で膜電位の記録を分析しますL電位は（mVsecの曲線下面積）を誘発しました。 30秒〜1分の記録を超えるレコード自発スパイク活動。電流（5-10 pA）での注射によって誘発されたスパイクを介してレコード興奮。

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結果

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このプロトコルの結果は、解剖の品質に依存します。この解剖の手順は、（ すなわち、上皮の損傷を避けるために）短い（10〜15分未満）および正確でなければなりません。 図1は、理想的な準備は、異なる倍率レベルでどのように見えるかを示しています。明視野下での低倍率では（例えば、支持細胞OSNsのノブなど）異なる細胞型は区別できる（ 図1A）です。最高倍率レベルでは、典型的には80X 160Xに、明視野で、OSNsの樹状ノブは支持細胞（ 図1B）から明確に区別する必要があります。蛍光灯の下では、唯一の樹状ノブ、GFP標識細胞の繊毛は、（ 図1C）表示されます。 2つの画像を比較することにより、標識された細胞は、記録ピペット（ 図1D）に近づけることができます。

解剖の温度はそれほどリューションと解剖のタイミングが重要です。解剖の最初の部分は、中隔（3.2節3.1.1）の調製は、氷冷溶液中に5から10分以内...

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ディスカッション

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正しく健全なOSNsの特性を監視するために、このプロトコルの能力は、製剤の品質に大きく依存します。したがって、解剖の手順は非常に重要です。最初に、解剖媒体の質（pHは、浸透圧）、酸素および温度（氷のように冷たいが、凍結していない）に注意を払うことが重要です。第二に、解剖ツールと上皮の操作は、損害を回避することができるように制限する必要があります。最後に、可能な限り最大のOSN集団にアクセスするために、できるだけ平坦製剤を得ることが重要です。

解剖の質は、健康な準備を得ることが基本です。しかし、異なるアプローチが解剖のために使用することができます。ここでは解剖を背ために腹を提示するが、一部のユーザーは、急速に鼻腔を開き、嗅上皮の中隔の凹部への迅速なアクセスを持つように解剖背を開始することを好むことができます。各ユーザーは、従ってPRを適応させることができます関心領域の健全な準備に到達するための最も効率的な戦略のotocol。

準備が顕微鏡下になると、準備の健康の永久モニタリングが必要です。実際、不健康な準備がギガシールに到達する...

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開示事項

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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言する。

謝辞

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著者は、OR-GFPマウスの寛大な贈り物に対してPeter Mombaertsに感謝したいと思います。アンヌ・ルフランとCSGAの動物施設は、優れた動物の世話をしています。資金は、CNRSがATIPおよびATIP Plusの助成金、Conseil Régional de Bourgogne(FABERおよびPARIの助成金)、Université de Bourgogne(BQRプログラム)を通じて提供しました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ファラデーケージTMC63-500シリーズが必要:環境(実験者の動き、冷却コンピュータ用ファンなどの機器の振動など)によって引き起こされる振動から記録システムを分離します。また、ファラデーケージと一緒に購入することも、カスタムメイドのファラデーケージを装備することもできます。このケージは、環境光学系
からの電気ノイズを避けるために推奨されます顕微鏡リンパスBX51WI直立マイクロコープ落射蛍光を装備;ユーザーの好みに応じて固定または移動ステージ
オリンパスLUMPLFL40XW少なくとも2つの目的が必要です:細胞への粗いアプローチのための4倍または10倍、および40倍の浸漬長距離例オリンパスLUMPLFL40XW / IR /0,8 / WD:3.3 MM
拡大鏡オリンパスU-TVCAC絶対に必要:対物レンズとカメラの間の光路に配置されています。記録電極カメラOlympus DP72でノブに正確に到達するために画面上の画像を拡大することができます
良いカメラは、蛍光だけでなく、明視野でニューロンを見るために必要です;制御ソフトウェアは簡単で、写真を撮り、細胞への電極のアプローチを監視するためにライブカメラ画像を行うことができます。超高感度カメラは、
オリンパス/クロマフィルタリング。GFPの例:励起:BP460-490:エミッション:HQ530/50m
アンプHEKAEPC10 USBは、記録電極を流れる電流を監視し、TTL信号をスプリッツァーに送信することでパフを制御します。EPC10のセットアップは、コンピューター
ソフトウェアによって制御されますHEKAPatchmaster、実験中のアンプを制御します
マイクロマニピュレーターSutterMP225精密マイクロマニピュレーターは、マイクロメーターの1/10までの正確な動きを可能にします。このモデルは非常に安定しています。
電極プーラーSutterP97をドリフトさせる可能性のある油圧マニピュレーターを避けてくださいFT345-Bワイドトラフフィラメント付き。 約2μの記録用ピペットを準備するため。細胞に到達するための長い先端を持つm直径。抵抗は15から20MΩであるべきです穴あきパッチクランプ溶液
ガラスSutterBF120-69-10私たちの記録条件では、このガラスはピペットの記録に理想的です
室ワーナーインスツルメンツRC-26Gチャンバーは顕微鏡下で準備を設定するために必要です。チャンバーの中央で調製を維持するために、ネット/アンカーを使用する必要があります。
ガラスWPITW100F-47のグループで取り付けられ、これらのピペットは
、プルとツイストの関連付けによってマルチバレルプーラーMDIPMP-107-Z
の精密圧力インジェクター トゥーイーカンパニーP / N T25-1-900シングルチャンネル   この精密圧力インジェクター は、マルチバレルプーラーで排出される圧力を制御します。手動またはアンプによって5Vによって制御されます。TTLs
マイクロマニピュレーター成茂YOU-1粗いマニピュレーターは、パフ電極を記録部位に近づけるのに十分
チューブ N/Aタイゴンチューブ パファーからの圧力をパフピペット
に 溶液/灌流/化学
真空ポンプガードナー デンバー300シリーズ振動膜ポンプは、他のタイプのポンプよりも静かで効率的です
灌流システムN/AN/A重力灌流システム 記録室から外部溶液を出し入れするためのポリエチレンチューブ付き
ナイスタチンSigma-AldrichN3503穴あきパッチクランプ
ジメチルスルホキシSigma-AldrichD5879の内部溶液を罠にかけるために必須穿孔パッチの内部溶液のナイスタチンを二溶かすために使用されます 
塩化ナトリウムSigma-AldrichS9625細胞外溶液
塩化カリウムSigma-AldrichP4504細胞内/細胞外溶液
塩化カルシウム二水和物Sigma-AldrichC7902細胞外溶液
リン酸ナトリウム 一塩基性一水和物 (NaH2PO4)Sigma-AldrichS9638外溶液
硫酸マグネシウム七水和物(MgSO4 7H2O)Sigma-Aldrich63140細胞外溶液
グルコースSigma-AldrichG8270細胞外溶液
重炭酸ナトリウムSigma-AldrichS6297細胞外溶液
EGTA(エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N′,N′-四酢酸)Sigma-AldrichE3889内部溶液
水酸化カリウムSigma-AldrichP1767溶液
メチルスルホキシSigma-AldrichW387509細胞内溶液
Hepes-NaSigma-AldrichH7006内溶液
スクロースSigma-AldrichS0389細胞内溶液
付き振動テーブルオマウスで使用される蛍光タンパク質に応じてをする必要はありませんは記録刺激は事前に引っ張られた刺激ピペットを準備するために使用されます、このプーラーは、7バレルでパフ電極を準備することができます。です 薬品 ド 細胞内部ド細胞

参考文献

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