定位注入法を適用すると、動物の行動の遺伝的影響を研究するために、

サマリー

cDNAを発現するレンチウイルスまたはshRNAの定位注射は、マウスの特定の脳領域における遺伝子発現を調節することができます。ここでは、そのようなオープンフィールド試験（OFT）および強制水泳試験（FST）のような行動のタスク、と定位注射を結合するためのプロトコルを提示します。

要約

定位注射は、マウスにおける標的脳領域に高力価のレンチウイルスを提供する有用な技術です。レンチウイルスは、脳組織への重大な損傷を与えることなく、比較的着目領域における遺伝子発現を過剰発現またはノックダウンすることができます。回復後、注射したマウスは、オープンフィールド試験（OFT）および強制水泳試験（FST）などの様々な行動タスクにテストすることができます。 OFTは、マウスは、新規オープンフィールドの中央に費やす時間の量を測定することにより、マウスにおける運動や気になる表現型を評価するために設計されています。もっと気になるのマウスは、対照と比較して、新規フィールドの中央で有意に少ない時間を過ごすことになります。 FSTは、水の入ったバケツの中に入れたときにマウスが不動費やす時間の量を定量することにより、抗うつ表現型を評価します。抗うつ表現型を有するマウスは、対照動物と比較し有意に少ない時間不動を過ごすことになります。このプロトコルの目的は、STERを使用することです遺伝的要因は、動物の行動を調節する方法を評価する行動試験と一緒にレンチウイルスのeotactic注入。

概要

それは、遺伝的に操作が容易であるため、マウスは広く神経生物学で使用されています。遺伝子ノックアウト技術は、研究者がそれぞれの遺伝的要因がマウスの行動を整形する方法を調査することができます。また、CRE-のloxPシステムは、異なる組織における遺伝子機能を研究する研究者を可能にする、マウスに特異的な遺伝子ノックアウトタイプ-組織および細胞のための貴重なツールを提供しています^。1しかし、実際には、CREプロモーターの発現パターンを制御するのが困難です、これまでに多くの確立されたCREドライバは地域特異的発現を達成していない^。2,3

あるいは、定位注射は、成体マウスの特定の脳領域を標的とする方法です。のcDNAまたはshRNAを発現する遺伝子操作されたウイルスを注入することにより、遺伝子発現の領域に特異的な変調を達成することができます。各マウスの脳の大きさは変化するが、特定の脳領域の位置は、定位COORDIを用いて決定することができます臀部は、マウス脳の頭蓋骨のランドマークから設定します。最も一般的に使用されるランドマークはブレグマ、ラムダ、および耳間のラインです。脳アトラスから得られた座標を使用して、各脳領域の^4つの正確な位置は、前後（A / P）によって識別することができ、内側-外側（M / L）、および背腹（D / V）がから軸ブレグマ/耳のラインの交差点。典型的には、注射は、蛍光顕微鏡検査によって確認することができるように、赤色、または緑色蛍光タンパク質（RFP又はGFP）のいずれかでタグ付けされたマウスの脳に注入したウイルス。

マウスの行動評価は、精神疾患の基礎研究のために特に必要です。患者における精神障害の症状は、典型的には、異常行動を伴います。これらの人間の行動の一部は、進化的に保存され、直接マウスに模倣し、観察することができます。たとえば、うつ病の行動的絶望を測定することにより、マウスでモデル化することができます。 OFTうつ病を持つ人々彼らがこれまでに役立ちます何もしないかのようにアンは、最終的に自殺につながる可能性が症状を感じています。げっ歯類では、これは、水のプールに浮遊対水泳マウス（放棄とみなす）の時間を測定する、強制水泳試験（FST）を使用してモデル化することができます。このパラダイムは、抗うつ薬との表現型を救出することによって検証されている。抗うつを受けた^7,8,9マウスは、未処理対照と比較して不動大幅に少ない時間を過ごすことになります。別の行動試験、オープンフィールド試験（OFT）は、マウスにおいて運動を評価するために設計されており、さらにマウスで気になる表現型を分析するために使用することができる^。5,6-このテストは、それらが接近しているときに、マウスをより安全に感じることを前提としています新規オープンフィールド内の壁に。彼らは好奇心の強い動物であるように、野生型マウスは、最終的には、新しい環境を探索します。ただし、フィールドの中央に少ない時間を費やしては、マウスがイニシアを克服することができなくなりますように、マウスに不安を示していますLの恐怖が新しい環境によってもたらされます。マウスの不安は、オープンフィールドの中央で費やす時間の量により定量されるように、多くの精神障害に存在するヒトでの臨床不安、と比較することができます。

行動パラダイムと定位注射の組合せは、対象の脳の領域に特異的な遺伝子の発現を改変するための新規な方法です。マウスの行動に変調遺伝子発現の効果が決定され得ます。脳全体のノックアウトとは対照的に、この方法は、それが、特定の脳領域を標的として特に有用です。また、定位注射は、典型的には、成人、野生型マウスで行われ、従って、内因性遺伝子の発現は、発生段階を通じて維持されています。遺伝子は、開発の胚または出生後の段階での生存のために必要とされている場合、このメソッドは、交絡の影響を回避します。一つの主要な制限は、実験用マウスはthroug行く必要があるということですHマウスの頭蓋骨を持っている侵襲手術は、オープンされます。さらに、遺伝子変調度は、ウイルスの力価及び効率によって決定されます。ウイルスは、特別な機器を必要とする定位座標を使用して適切な領域に注入する必要があります。正しい注射部位の確認のみ死後に完成させることができます。

この方法は、以前に様々な神経疾患における特定の遺伝子の関与を試験するために使用されてきました。例えば、（ドーパミンを合成することを可能にする）Thの遺伝子を標的ウイルス媒介性RNAiは、黒質緻密部に注入し、そして運動行動分析を行った^。10別の研究では、関連して、マウスの挙動を評価するために、レンチウイルス、サイレンシングDISC1の定位注射を使用しました統合失調症に。 DISC1のノックダウンは、新規性に応じて増加した運動につながった（類似統合失調症における陽性症状）、およびより大きな不動FST ^11は、同様に、追加の研究は、5-HT _1Bの過剰発現は、OFTに増加した探索行動に、この方法を用いて、抗不安表現型と一致つながったことがわかった^。12定位注射はCRE-loxP配列マウスで組換えを誘導するためにCREウイルスを提供することができます。この方法は、選択的扁桃体におけるY2受容体と分界条床核を削除するために使用されました。行動分析の際に、これらのマウスは、遺伝子は、中央扁桃体に削除された抗うつ表現型に見つけましたが、された遺伝子が基底外側扁桃体や分界条床核に削除された表現型がない^。13このように、この技術を動物行動の遺伝的影響を研究するためのユニークなツールを提供します。

プロトコル

注：動物に関わるすべてのプロトコルはIACUCの＃44057、ペンシルベニア州立大学の動物保護ガイドラインに従って追跡しました

1.レンチウイルス生産

注：トランスフェクションの前日には、LentiX-293細胞は、80％の集密度になるようにしてください。

1. ただ、トランスフェクションの前にDME​​Mで細胞を洗浄し、室温で5分間、ペニシリン（100 IU / ml）およびストレプトマイシン（100μg/ ml）を含むDMEM / 10％FBS 10mlにインキュベートします。
2. 3の比率（1μgのDNA：PEIの3μL）1 DMEM mlの1分間ボルテックスで1にDNAとポリエチレンイミン（PEI）（1mg / ml）を希釈します。 DNAの量はDNAの濃度に依存しました。室温で10分間インキュベートします。
   1. 例えば、皿当たりPEIの60μlのベクタープラスミド10μgを、psPax2 ^145μgのプラスミド、水疱性口内炎ウイルス（VSV）を5μgからなるDNAプラスミド20μgのを、使用しています。
3. 1分間ボルテックスすることにより再びDNAとPEI溶液を混ぜます。室温で10分間インキュベートします。
4. DMEM（100ミリメートル皿中の10ミリリットルの培地のためのすなわち 1ミリリットル）の全培養液の1/10ボリュームを追加します。皿にドロップすることにより、DNA-PEI混合物の低下の1ミリリットルを追加し、培養培地になるまで周りの皿を旋回DNAとよく混合されます。
5. 室温で6時間インキュベートし、上清を除去します。培地の5ミリリットルを追加します。
6. トランスフェクション後48時間では、50mlチューブ中で4℃で5分間、627×gでウイルス上清を回収し、スピン。超遠心管に0.45μmのシリンジフィルターを通してウイルス上清30mlのをフィルタリングします。
7. チューブのバランスをとるために滅菌水を追加し、パラフィルムの小片でチューブをカバーしています。 4℃で120分間、11249×gでチューブをスピン。真空チップを用いて液体を除去します。
8. 冷PBS100μlのチューブを追加します。静かに4°CO / Nでチューブを揺すります。
9. ウイルス、ピペットTを再懸濁するために、彼はPBSを先端でペレットに触れないように注意しながら、ペレット10回以上のステップ1.8で追加されました。これが完了するまで、ペレットを再懸濁されることはありません。
10. -80℃で液体窒素とストアにフラッシュ凍結、チューブあたり10〜20μlのでウイルスを等分。

2.定位注射

楽器の2.1）準備

1. ハサミ、平滑末端の鉗子、ニードルホルダー、メス、綿棒、および滅菌インジケータと密封されたパック内の布、および手術前にオートクレーブを置きます。さらに、10％ポビドンヨード、70％のエチルアルコール、吸収性縫合糸、加熱パッド、人工涙液、ガラスビーズ滅菌器、ドリル、ドリルビット、2使い捨て注射器、注射器、電気かみそり、鎮痛薬（ケトプロフェン）を得、麻酔（アベルチン）、手袋、噴射ポンプと定位装置。
2. 0.2＆を使用して、新鮮な1.25％アベルチン溶液その日、無菌フード内のフィルタを作成します＃181;滅菌シリンジフィルターをM、および無菌の血清バイアルに入れます。 200ミリリットルの水に溶解し、その後、tert-アミルアルコール5mlに2,2,2-トリブロモアルコール2.5gのを混ぜます。 5. ¹⁵未満のpHを保ちます

マウスの2.2）準備

1. マウス（375ミリグラム/ kg）の重量に基づいて、アベルチン管理します^。15は、腹腔内（IP）注射によってアベルチンでマウスを注入し、その後完全に麻酔をかけたまで戻しケージに配置します。
2. 乾燥を防ぐために、IP注射を介して鎮痛剤（ケタプロフェン、5ミリグラム/ kg）を、所定の位置にマウスの目に人工涙液を与えます。
3. マウスは彼らの足をつまんで完全に眠っていることを確認してください。マウスは足のピンチに応答する場合には、（50μLの用量で）より多くの麻酔薬を与えます。電気かみそりを使用して、マウスの頭部を剃ります。 （典型的には、ちょうど耳の後ろから、鼻のトップへ）上で動作する領域、および周辺エリアを剃ります。
4. マウスIを配置定位装置NTO。前部クランプに前歯をラッチし、クランプを下げ、顎が完全に安全であるように、それを締めます。
5. 完全に頭を安定させるために外耳道に耳バーを挿入します。内耳に損傷を与える可能性が、あまりにも遠くに耳棒を挿入しないように注意してください。完成したら、マウスの本体は、ヘッドの位置を中断することなく、わずかに移動させることができるようになります。
6. 作業中はマウスの体温を調整するために、マウスの下に加熱パッドを配置します。
7. 徹底的に手術領域を清掃してください。綿棒を使用して、手術部位の途中から始まり、外側に移動し、円を描くように、10％ポビドンヨードをこします。そして、同じように手術部位に70％のエチルアルコールをこするために綿棒を使用しています。 2回繰り返します。

2.3）最初の切開

1. マウスが準備されると、滅菌機器バッグを開きます。トウチ前に手袋を変更楽器をngの。無菌布を取り出し、布の上に機器​​を配置します。あらゆる楽器は未滅菌表面に接触した場合、それを滅菌する15秒間ガラスビーズ滅菌器を使用しています。
2. 非利き手で利き手と平滑末端の鉗子にメスを取ります。平滑末端の鉗子にそっと握り、マウスの皮膚を使用し、メスを用いて切開します。約1.5cm（鼻側）に耳の上に切開を開始し、耳の下の約0.5cmにまで及びます。 （ 図1）、ブレグマを露出するために、マウスの頭の中央に垂直に切開を拡張します。
3. ブレグマが可視化された後、静かに頭蓋骨の表面を覆う任意の血液を除去するために滅菌綿棒を取ります。ヘッド側に皮膚をプッシュするために、2つの綿のヒントを参考にしてください。

2.4）機器のセットアップ

1. 任意の血液を頭蓋骨の表面から除去され、そしてブレグマが明確に可視化された後、注射器（コンを準備10 ⁸ TU / mlで、1マイクロリットルの容量）のセント。ヒュームフードでは、注入されるウイルスを注射器を埋めます。気泡が内部にないことを確認してください。それは完全に確保されていることを確認して、定位装置に注射器を置きます。
2. 無菌の注射針の先端がブレグマの交点と耳のラインに設定されているように、それは、右の頭蓋骨の表面を超えるまでゆっくりとシリンジを下げます。ゼロとしてこの点を設定し、この点からの座標を決定します。
3. 関心のある脳の領域に応じて、定位座標を変化させます。脳地図^4を利用して、これらの座標を決定します。座標が決定されると、これらの座標と一致するように、注射器の針を動かします。座標を使用して歯状回をターゲット：M / L = +/- 1ミリメートル、A / P = -1.82 mmです。穴が掘削される必要がある場所を視覚化するために頭蓋骨の上に右に針を下ろします。
4. 少しシリンジを上げ、ドリルを取り、ドリル双方向を配置T右側頭骨に対して約45°の角度でターゲットドリルサイト以上。掘削を開始し、頭蓋骨は方法を提供するまでの掘削を続けます。頭蓋骨の方法を提供すると、抵抗の低下を検出することができます。皮質の損傷を防止するために、脳内にドリルしないように注意してください。
5. 滅菌綿棒を取り、穴からの血を拭い。
6. 先端が右脳（ない頭蓋骨）の表面上に位置するように、シリンジを下げます。 D / vの脳アトラス座標に基づいて、所望の深さまで下げ0にシリンジ（深さ）座標を設定します。歯状回に到達するには、-1.79 mmのD / Vに設定します。
7. 0.2μL/分の速度で注入を開始します。注射器は、所望の深さよりも低いスリップしないことを保証するために監視します。この問題が発生した場合は、そっと再び所望の深さまで注射器を上げます。
8. 注入が完了した後、任意の残存ウイルスが吸収されたことを確認するために、約2分待ち。ゆっくりとシリンジを上げ、任意のリチウムを除去するために、綿棒を使用注射部位から一口分。
9. 他の半球のために繰り返します。

2.5）縫合

1. そのパッケージとグリップから針ホルダを使用して針を滅菌縫合糸と針を外します。離れて針ホルダから針の尖ったエッジに直面しています。非利き手で平滑末端の鉗子を保持し、グリップには、マウスの皮膚を、それを使用しています。利き手で始まります。
2. 優しく皮膚を通して縫合糸をプッシュして切開の反対側の皮膚をつかむために平滑末端の鉗子を使用しています。約0.75インチが残るまでを通して縫合材料を引き出します。
3. 針を放し、そして、その後、針ホルダの周りに1時間を縫合糸をラ​​ップ針ホルダーを0.75インチ残りの縫合糸をつかみ、そしてを通して縫合糸を引っ張るように平滑末端の鉗子を使用し、針と針ホルダーように彼らは元​​々にあったものにヘッドと反対の側に終わります。これは、結び目を形成すべきです。
4. この手順を繰り返しますさらに3回、針ホルダは、各時間に終わるヘッドの側面を交互に。
5. 縫合糸をカットし、手順を繰り返し2.5.1-2.5.3切開が閉じられるまで。

2.6）術後ケア

1. 静かにマウスの耳のバーを削除し、前方クランプからそのあごを削除します。
2. それがウェイクアップし、独自に動き回るまで加熱パッド上でマウスを保管してください。毎日マウスを監視し、そのような、グルーミング食べたり飲んでいないような痛みの兆候、のために維持し、目。必要と認めたときに追加の鎮痛剤を与えます。

3.オープンフィールドテスト

3.1）の設定

1. 50センチメートル高い壁で、寸法50センチメートル×50 CMと空の角、プラスチックアリーナを得る（が、わずかに大きくすることができます）。実験の開始に先立って、70％のエチルアルコールでアリーナを清掃してください。エチルアルコールが完全に舞台上にマウスを置く前に乾燥していることを確認します。
2. にアリーナを配置床、照明は影とグレアを最小限にするために設定されていることを確認してみてください。
3. トラッキングソフトウェアを使用する場合は、（マウスの明確な見解を持つように十分離れて完全包含するように、全体の舞台が、十分に近い）、オープンフィールドの真上にオープンフィールドの上に約1.5フィートのカメラを置きます。
4. ゾーンを設定するには^16。ボックス（X 30センチメートル30cmの約領域）の中央にゾーンを設定し、サイドパネルのゾーン1]タブをクリックします。
   1. 上部パネルの形状のアウトラインを選択し、中央ゾーンの周囲を概説します。ゾーンの追加]を選択し、中央ゾーンの内側をクリックしてください。プログラムのプロンプトを使用して、（これは、この手順のための「中心」と呼ばれる）ゾーンに名前を付けます。行動試験を手で記録される場合は、フィールドの底部は、テープを使用して、マークされた10センチ×10cmの正方形に分割されていることを確認してください。
5. 設定が正しい、とマウスが簡単にVISIになるようにソフトウェアを設定します画面にBLE。試験領域（照明）およびマウスの色に適合するように、マシン上の検出の設定を調整することによって、これを達成します。
   注：設定が正しい場合、システムは、任意の影や尿/糞便をマウスだけを追跡し、しないでください。特定のソフトウェアの設定は、アリーナの照明、マウスの色に依存します。

3.2）順化とテスト

1. その周囲にそれらを順応させるために試験前行動部屋1時間に実験用マウスを移動します。順化のための彼らのケージにマウスを残します。
2. 行動タスクテープにカメラの電源を入れ、マウスが壁に直面しているように、舞台の中央前方に向かってマウスを置きます。
3. 5分間のタイマーを設定し、競技場から離れます。可能な場合は、誤ってマウスに影響を与えないように、部屋を出ます。
4. 5分がアップしたら、マウスを削除し、そのケージに配置します。
5. 徹底的に次のマウスに進む前に、フィールドを一掃するために70％のエチルアルコールを使用してください。エチルアルコールが完全に乾燥していることを確認します。

3.3）得点

1. すべての4つの足は、x 30センチメートル途中30センチメートル内にあるときに、フィールドの中央にあるように、マウスを検討してください。
2. マウスを中心に費やす時間の量を定量化。あるいは、（例えば、Noldusのethovisonとして）追跡ソフトウェアを使用して、この時間を決定します。
   1. これを行うには、分析]タブに移動し、分析·プロファイルの下に「動き」をクリックしてください。現在設定されているカテゴリを削除し、[場所]タブの下の「ゾーン内」を選択します。中央ゾーンを選択します。次に、結果を表示する（結果]タブの下の）「解析出力」を選択します。各試験のために不動に費やされる時間の一覧表が表示されます。
3. それ以外の場合は、手でOFTスコア。オープンフィールドは、OPEの底に概説25 10センチメートル×10センチの正方形を持っている必要がありますNフィールド（ステップ3.1.3に概説されるように）。アリーナの中心部へのエントリの数に加えて、マウスを中心に費やす時間の量を定量化する^。16
   注：センター30センチ×30センチメートルエリアはオープンフィールドの中心と考えられています。マウスは、すべての4つの足が30×30センチエリア内にあるかどうか中心領域に生息すると考えられています。

4.強制水泳試験

注：行動のタスク間の5日間の最小値を許可します。

4.1）の設定

1. 2 L明確なバケツを取得し、22℃の水で満たします。テーブルの上にバケツを置き、照明は影とグレアを最小限にするために設定されていることを確認してみてください。
2. トラッキングソフトウェアを使用する場合は、直接オーバーヘッドバケットのカメラを置きます。
3. マウスが画面上で簡単に表示されるようにソフトウェアを設定します。

4.2）順化とテスト

1. 行動ROに実験用マウスを移動します周囲を順応するためのテストの前にOM 1時間。順化のための彼らのケージにマウスを残します。
2. テープへのカメラの行動タスクをオンにします。静かに、バケツの水の中央にマウスを置きます。でマウスを落とさないことを確認します。マウスをゆっくり下げ、そのフロント足が最初に水に触れるようにします。水没から自分の頭を防ぐために注意してください。
3. 6分間のタイマーを設定し、行動の領域から離れます。
4. 6分がアップしたら、バケツからマウスを削除し、そのケージに戻ってマウスを置く前に、余分な水分を拭き取ってください。

4.3）得点

1. トラッキングソフトウェアを使用する場合はNoldusによって示唆されるように、水泳対フローティング時間を定量化するために、（これはデフォルトの設定でなければならない）、11％パーセントの不動を設定します。
2. トラッキングシステムを使用して定量化するために、分析]タブに移動し、分析·プロファイルの下で運動をクリックしてください。に、現在設定されているカテゴリを削除し、移動状態を選択（個人の行動の下で）左サイドパネル。 11％の不動を設定します。
3. [結果]タブの下で、トラックの可視化を選択します。結果を表示する（結果]タブの下の）分析出力を選択します。各試験のために不動に費やされる時間の一覧表が表示されます。
4. 手の採点場合、マウスはマウスが不動に費やす時間の水泳や登山、と量を消費する時間を測定します。また、初めての不動のレイテンシを測定します。結果のセクションにある図2を参照してください。

結果

正確な定位注射は正しい座標を設定に大きく依存しています。ウイルスを注入するために使用される針の先端はブレグマの交点と耳線（ 図1）上で直接設定する必要があります。これは、針が正しく配置されているか否かを確認するために立体顕微鏡を使用すると便利です。顕微鏡で見ると、ウイルスが注入された場合、それはブレグマの交点と耳ラインで直接着陸なるように、針が配置されるべきです。つまり、注射針の開口部が直接交差点の上に配置する必要があり、あります。本研究では、RBM8aに対するshRNAを、エクソンジャンクショ​​ン複合体の中核因子を発現するレンチウイルスは歯状回の中に注入しました。レンチウイルスはまた、感染した神経細胞を標識するためにRFPを発現する。 図2の赤色信号（ 図3）によって示されるようにウイルスが正しい領域に注入されたことを示しています。

行動タスクでの重要性を実現するために_content ">、サンプルサイズは、グループごとに12〜15匹のマウスからの範囲でなければならない。行動タスクは二週間定位注射した後に行うことがで...

ディスカッション

成功定位注射は三つの要因に依存している：、生きているマウスを維持する座標の正しいゼロ点（ブレグマの交点と耳間のライン上の針の先端）を設定し、ゼロ点に右の深さを設定する（針の先端をちょうど）脳組織の外側に触れます。マウスの生存率は重要です。手術の生存は、マウスが適切に麻酔し、適切な鎮痛を受けていることを確認することによって支援することができます。疼痛は、手術後の乏しい回復の主な原因であることが知られています。マウスが完全に（それが足のピンチに反応してはならない）手術を通じて麻酔し、（マウスの重量に基づいて）鎮痛剤の適切な投与量を与えている、生存を助けるべきであることを確実にすること^。17また、マウスを上に維持されるべきです手術のプロセスを通して、加熱パッド、それが麻酔から目覚めるまで。彼らは麻酔されたときにマウスは、自分の体の温度を調節することはできません。自分の体の気性atureは、手術のプロセスの間に大幅に低下します。定位手術の長さが比較的短い場合であっても、低体温は真剣に、マウスの生存を損なう可能性があります。適切な縫合技術も成功した手術を行うのに役立つです。マウスは、それらの縫合糸で選ぶしようとしますので、傷...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
定位装置アイテム51725	Stoelting co.	51725
五等分位定位固定装置ポンプ	ストールティング株式会社	53311
注射用スチリンジ、65 RN	ハミルトン	7633-01
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
PEI	株式会社ポリサイエンス	23966
はさみ	細かい手術器具	14084-08
鈍い端鉗子	細かい手術器具	11002-12
針ホルダー	細かい外科用ツール	12001-13
ドリル	ラム プロダクツ インク	マイクロトルク コントロール ボックス、ペダル付き Tech2000 ハンドピース
ガラス ビーズ滅菌器	Inotech	IS-400
吸収性縫合糸		M-K518r19	性、逆切断
綿棒	VWR	89031-270
加熱パッド	Gaymar	TポンプTP-500 PN11184-000
人工涙液	ラグビーNDC 0536-6550-91
シリンジ	BDシリンジ	309623
布
手袋	Ansell	Senseitouch #7823
アベルチンまたは他の麻酔薬	レシピの引用
ケトプロフェンまたは他の鎮痛薬	獣医師
追跡ソフトウェア	、ノルダス	、Ethovision、XT
、追跡カメラ	ノルダス	メディアレコーダー