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方法論記事

腫瘍の増殖、浸潤及び血管新生を研究するために、ニワトリでのヒト多発性骨髄腫異種移植モデルの確立

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⸱

DOI：

10.3791/52665

⸱

2015年5月1日

 ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine V, Innsbruck Medical University, 2Oncotyrol GmbH, 3Tyrolean Cancer Research Institute, 4Division of Vascular Biology, Department of Medical Biochemistry and Biophysics, Karolinska Institute

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ヒト多発性骨髄腫（MM）細胞は、間葉系細胞と生存および増殖のための細胞外マトリックス成分の支援微小環境が必要です。我々は、腫瘍の増殖、浸潤および血管形成に対する抗がん剤の効果を研究するために移植されたヒト骨髄腫および間葉細胞とin vivoでニワトリ胚モデルを確立しました。

要約

多発性骨髄腫（MM）、悪性形質細胞疾患は、不治のままであり、新規の薬剤は、患者の予後を改善するために必要とされます。これにより、骨の微小環境と自動/パラクリン成長因子の欠如により、ヒトMM細胞を育成することは困難です。したがって、ヒトMM細胞に対する新規治療薬の作用を研究するために、in vitroおよびin vivo培養系において適切な確立が急務となっています。ここでは、in vitroおよびin vivoで 、複雑な3D環境内でヒト多発性骨髄腫細胞を増殖するためのモデルを提示します。 MM細胞株OPM-2及びRPMI-8226は、GFP導入遺伝子を発現するようにトランスフェクトされた三次元スフェロイド、ヒト間葉系細胞とコラーゲンI型基質の存在下で培養しました。加えて、スフェロイドは、ニワトリ胚の漿尿膜（CAM）に移植した腫瘍の成長は、ステレオ蛍光顕微鏡法によってモニターしました。どちらのモデルも、新たな治療DRUの研究を可能にします複雑な3D環境と導入遺伝子に特異的なGFP-ELISAにおける移植片の均質化後の腫瘍細胞塊の定量化でGS。また、下にある宿主組織へのホストおよび腫瘍細胞の浸潤の血管新生応答は、実体顕微鏡により毎日モニターし、ヒト腫瘍細胞（KI-67、CD138、ビメンチン）、または宿主壁細胞被覆血管に対する免疫組織化学染色によって分析することができます（デスミン/ ASMA）。

結論として、onplantシステムは、複雑な3D環境でのMM細胞の増殖と血管新生を研究することができますし、MM細胞の生存および増殖を標的とする新規治療化合物のスクリーニングを可能にします。

概要

多発性骨髄腫(MM)は、骨髄における悪性形質細胞の増殖、骨病変、免疫不全1を特徴としています。プロテアソーム阻害剤(ボルテゾミブ)や免疫調節薬(ポマリドマイド、レナリドマイド)などの新たな治療選択肢はあるものの、MMは依然として不治の悪性腫瘍であり、予後は厳しいままです2。予後不良は、MM細胞クローンの異常な不均一性によって説明され、特に長時間の治療とMMクローンの選択圧下で、治療に対する反応が変動する原因となる可能性があります3。

新薬とその組み合わせの前臨床試験は、将来の医薬品開発にとって重要で時間のかかるステップです。したがって、MMの生物学的理解を深め、新薬の発見を可能にするためには、MMの有用なinvivoモデルが必要です。実際、血液悪性腫瘍および治療薬に最適な異種移植モデルは、重症複合免疫不全(SCID)マウス4-7、非肥満糖尿病/SCID(NOD/SCID)マウス8,9、またはβ-ミクログロブリンノックアウトNOD/SCIDマウス10,11などの免疫不全マウスである。

ヒトMMのマウスモデルは、いくつかの側面でヒトの疾患の表現型に似ていることがありますが、免疫不全マウスは近交系されているため、薬物に対する個々の反応を一つしかシミュレートせず、コストは非常に高くなります。免疫抑制のために、動物は特別な維持条件を必要とし、マウスでのヒトMMの生着には6週間から2ヶ月が必要です9,12、ただし、細胞が技術的に要求の厳しい手順を使用して骨髄に直接移植され、動物の生存率が低くなっています7,13。そのため、幹細胞ベースのオルガノイドモデル14、組織工学15、または洗練された3D細胞培養モデル16を用いた新しい方法が確立されている。近い将来、前臨床薬物試験のための古典的な動物実験と競合するでしょうが、生体の全身毒性試験に取って代わることはできません。

ニワトリの胚は、17-19歳になるまでの適応免疫応答の欠如により、ヒトの細胞や組織の異種移植に適した生物であることが以前に実証されています。さらに、各ニワトリ胚は、ニワトリ集団内の遺伝的多様性により、適用された薬剤または腫瘍細胞に対する個々の反応を反映しています。絨毛膜(CAM)は、腫瘍依存性血管新生を研究するための確立されたシステムです20-22。固形腫瘍をCAMに移植すると、増殖、浸潤、血管新生、転移など、in vivoでがんの多くの特徴を示します23-27。

私たちのグループの以前の経験に基づいて、CAM異種移植モデル20,26,27を使用して、ヒト3D培養システムの利点とex ovo発達ニワトリ胚のモデルを組み合わせたヒトMMモデルが確立されました。このMMモデルシステムにより、MM増殖の進行のリアルタイムモニタリング、細胞量の定量化、および前臨床薬物試験が可能になります。

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プロトコル

//：実験動物福祉のhatching.The NIH Officeは、この領域（HTTPで書かれたガイダンスを提供するまでオーストリアの法律、および米国公衆衛生サービスの実験動物福祉の事務所によると、鳥類の胚は生きた脊椎動物とは見なされませんwww.grants.nih.gov/grants/olaw/references/ilar91.htmおよびNIH公開番号：06から4515）。

1.細胞培養およびレンチウイルストランスフェクション

  1. 培養MM細胞株OPM-2、RPMI-8226およびRPMI1640培地中の骨髄からヒト間葉系幹細胞、存在下で、10％ウシ胎児ウシ血清及び100 IU / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシンおよび2mMグルタミン37℃、5％CO 2。
  2. トランスフェクション5×10 30μlのリポソームトランスフェクション試薬とトランスフェクション培地（10ml）を利用してウイルスパッケージングミックス（9μgの）DNAおよび3μgのをpLenti6 / V5 DESTのeGFPベクターと6 HEK 293FT細胞。 12時間後にトランスフェクション培地を除去し、10％ウシ胎仔血清および1％非必須アミノ酸（NEAA）で10ml DMEM培地を加えます。
  3. 5日後、水泳細胞（千XG、5分）の遠心分離後HEK293FT細胞の上清を収集します。他の場所28記載されているように、リアルタイムPCRによりウイルス力価を決定します。
  4. 完全増殖培地中で24ウェルプレート中のeGFPレンチウイルス粒子（1×10 5粒子）で1×10 6 MM細胞をトランスフェクション。 3日後、培地を2 / mlのブラストサイジンを添加することにより、選択プロセスを開始します。市販のeGFPレンチウイルスの場合は、500 / mlのネオマイシンを使用しています。
  5. 選択の2週間後、MM細胞をeGFP発現のクラスターが表示されます。遠心分離（千XG、5分）によって細胞を収集し、実験のためにOPM-2 EGFPおよびRPMI-8226 のeGFPサブラインとしてそれらを展開する（セクション2および3）。

2. 3D-多発性骨髄腫スフェロイドモデル

  1. チルI型コラーゲン溶液および10×DMEM On個の氷。
  2. コラーゲンマトリックスに10×DMEM培地の1/10量を混ぜます。 7.4のpH値に酸性コラーゲン溶液を中和するために水酸化ナトリウム（0.2 N）を加えます。氷上ストアコラーゲン/媒体液。
  3. ヒト間葉系細胞（50,000細胞/スフェロイド、 すなわち、30μlの低下）と、トランスジェニックMM細胞株（スフェロイド250,000、OPM-2 のeGFPまたはRPMI-8226 のeGFP）を混ぜます。
  4. 15ミリリットルチューブ（1,000×gで、5分間）で遠心細胞混合物は、細胞ペレットにコールド用意コラーゲン混合物（1mLの）を追加し、（千μlの先端で）よく混ぜます。
  5. 直ちに滅菌パラフィンフィルム上に24ウェルプレート中で（100μLチップで）コラーゲン/細胞混合物を30μlのピペットと細胞/コラーゲン混合物は、37℃（ 図1Aを参照）で30分間重合を可能にします。
  6. 1,10および100nMのボルテゾミブを含む1mLの培養培地でオーバーレイMMスフェロイド（ 図1B参照 ）。
  7. 37℃でのインキュベーションの72時間後、文書スフェロイドによって蛍光実体顕微鏡（ 図1C参照 ）。
  8. GFPを測定するための反応管に広い平坦なジョーを有する鉗子を使用して、各スフェロイドを転送（ 図1Dを参照）。

CAM 3. 3D多発性骨髄腫異種移植モデル

  1. 3日間37°Cおよび70％の湿度で、鳥類の卵のための特別なインキュベーター中で鶏の卵をインキュベートします。
  2. その後、オープン卵と移植胚は、細胞培養プレートの蓋をエタノール、正方形、10 cmのプラスチック製計量ボートで滅菌し、CAMが（ 図2A参照 ）を開発することができるように、さらに6日間「EX OVO」をインキュベートします。
  3. 氷の上にI型コラーゲン溶液および10×DMEMを冷やし、コラーゲンマトリックスに10×DMEM培地の1/10量を混ぜて、7.4のpH値に酸性コラーゲン溶液を中和するために水酸化ナトリウム（0.2 N）を追加します。氷上ストアコラーゲン/媒体液。
  4. トランスジェニックMM細胞株（OPM-2 のeGFPまたはミックスRPMI-8226 のeGFP;ヒト間葉系細胞とスフェロイド）250,000（50,000細胞/スフェロイド）。
  5. 15ミリリットルチューブ（千XG、5分、各​​試験化合物1バイアル用）で遠心細胞は、細胞ペレットに（望ましい稼動濃度で）薬物と1mLの冷たい準備コラーゲン混合物を追加し、（千μLチップで）よく混ぜます。
  6. 37℃での細胞外マトリックスの重合を可能にするために30分間よくパテ6にコラーゲンが低下パラフィルム上（30μlの各）を配置します。
  7. （2センチメートル離れた胚）から9日齢のニワトリ胚のCAMの未処理面に鉗子を用いて、ステップ3.6からの転送「オンプラント」（各ニワトリ胚のための4オンプラント、 図2Bを参照してください）
  8. 蛍光実体顕微鏡によるインビボでの 37℃での卵のインキュベーター中で成長し、70％湿度、文書異種移植の5日後（ 図2Cを参照）。 5時間冷蔵庫で4℃での低体温によってニワトリ胚を安楽死させます。
  9. 広い平坦な顎を持つ眼科はさみや鉗子による直下のCAM組織との異種移植片を取り除きます。 GFPの測定のためにそれらを使用します（セクション4、 図2Dを参照）または血管および/ ​​または侵入腫瘍細胞（第5節）の免疫組織化学的分析のため。

4. ELISAによるEGFPタンパク質の定量

  1. 200 / mlのプロテ​​アーゼ阻害剤を含有する0.5ミリリットルのRIPAバッファーに各MMスフェロイドまたは切除された異種移植片を転送します。
  2. 氷上の組織ホモジナイザーでスフェロイド/異種移植片を均質化。
  3. 液体窒素および37℃の水浴三の凍結/解凍サイクルを実行します。
  4. 20分（12000グラム）とストア上清4℃で遠心分離ホモジネート。
  5. サンプルをELISAキットのアッセイ緩​​衝液（200μL）で1:20に希釈します。製造業者のプロトコルに従って、ビオチン化抗GFP抗体を用いた商用GFP ELISAキットによりGFP-レベルを測定します。

5. Immunohi血管や侵入腫瘍細胞のstoc​​hemical分析

  1. 4℃で4％パラホルムアルデヒドO / NでCAM領域で切り出し異種移植片を修正しました。
  2. 包埋カセットに固定された異種移植片を配置し、段階的な増加アルコールシリーズ（50％、70％、80％、95％エタノール、キシロール、パラフィン、各ステップ60分間）を用いて組織の埋め込みステーションに移します。
  3. 卓上型ロータリーミクロトームを使用することにより、セクションの異種移植片（5ミクロン）。 O / N 56°Cでのガラススライド上のパラフィン切片焼きます。
  4. 二重蒸留水に減少段階的アルコール系によって脱パラフィン切片（キシロール、95％、80％、70％、50％エタノール、再蒸留水;各ステップ10分）。
  5. 抗原回復溶液（; pHは7.0、体積100μlのクエン酸塩緩衝液）との水浴（95℃、20分）で抗原回復を実行します。
  6. 30分間、100μlの3％H 2 O 2 /メタノールを用いて内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックします。
  7. を含むPBSでブロックセクション45分（体積100μl）を、10％ウシ胎児血清。
  8. 一次抗体の100μlで1時間染色を（1μgの/ ml）を、室温で、1％ウシ胎児血清を含むPBSで希釈しました。
  9. PBSで3回洗浄した後、室温で1％ウシ胎児血清を含むPBS中のビオチン化二次抗体（0.1μgの/ ml）で1時間インキュベートします。
  10. PBSで3回洗浄した後、製造業者の説明書に従って、アビジン/ビオチン複合体（ABC）とジアミノベンジジン（DAB）基質溶液によって呈色反応を行います。
  11. 5.11。ヘマトキシリン​​で二重蒸留水、対比にセクションを転送することによって反応を停止し、合成封入剤とのセクションをマウントします。

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結果

3D多発性骨髄腫スフェロイドアッセイにおける標的化合物のインビトロでの分析で

これにより、in vitroで初代ヒトMM細胞を培養する制限に、我々は、細胞外成長マトリックスおよび骨髄（ 図1A、B）から支持初代ヒト間葉系細胞を利用したヒトMM細胞株のためのインビトロ培養モデルにおける新しい3Dを確立しました。 EGFPトランスジェニックMM細胞株は、スフェロイド内の3D成長後に視覚化し、MM腫瘍塊の定量化を可能にします。両方のMM細胞株OPM-2 EGFPおよびRPMI-8226 のeGFPステレオ蛍光顕微鏡でGFPの発現によって可視化したボルテゾミブ腫瘍の漸増濃度（1〜100nMの）の存在下で3日間培養した（ 図1C） 。腫瘍細胞塊は、スフェロイドの均質化後に定量化し、GFP-ELISA（ 図1でのeGFPの内容...

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ディスカッション

難治性MMのための新たな治療薬の開発は、薬物に対するヒトMM細胞の感受性を評価するために少ない時間がかかり、高価な生体内のシステムを必要とします。これまで、わずか数の生体内のシステムは、新しい抗骨髄腫治療の前臨床評価のために利用可能です。それらのすべては、化合物ライブラリー29の大規模スクリーニングのためにそれらの限界があります。

ヒトMM細胞のための最高の現行モデルは、高度免疫不全マウス7,13,30と七面 ​​鳥の胚29です。 SCIDマウスおよび鳥類胚異種移植モデルの両方は、MMの生物学を研究し、新規の治療化合物を試験するために使用することができます。しかし、マウス系は、近交系の遺伝子型を含む、技術的に要求の厳しい手順、長い観察期間と高いコストを、いくつかの制限があります。

本研究では、新規な3Dスフェロイドおよびトリ異種移植モデルは、ヒトのMESの存在を伴うヒトMM細胞の生物学を研究するために提示されています支持部品としてenchymal幹細胞及び細胞外マトリックス。 MM細胞が強く、それぞれの...

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開示事項

著者らは、全く競合する金融利害関係はありません

謝辞

著者は、免疫組織化学とニワトリ胚の準備における優れた技術支援を提供してくださったCornelia Heisさんに感謝したいと思います。この研究は、オーストリア科学基金(FWF Grant No. P19552)と欧州連合(EU FP7プロジェクトOptatio No:278570)の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
RPMI-8226細胞DSMZACC 9STRプロファイル
OPM-2細胞DSMZACC 50STRプロファイルヒト
間葉系幹細胞 PromoCellPC-C-12974
HEK293FTセル InvitrogenR700-07
RPMI1640 MediumSigma AldrichR0883
ウシ胎児血清 HyCloneThermoScientificSH30070.03
L-Glut- Pen- Strep solutionSigmaG6784
DMEM MediumGibco31966
NEAASigma Life SciencesM7145
Transfection Medium/Opti-MEM Gibco51985
eGFP レンチウイルス粒子GeneCopoeiaLPP-EGFP-LV105すぐに使用できるウイルス粒子
pLenti6/V5Dest6 eGFP ベクターInvitrogenPN 35-1271著者から
ViralpowerTM 包装ミックス InvitrogenP/N 35-1275
トランスフェクション試薬/ リポフェクタミン 2000Invitrogen11668-027
ブラストシジンInvitrogenR210-01
ネオマイシンバイオクロムA2912
コラーゲン-タイプ1 ラットテールBDバイオサイエンス354236
DMEM粉末テクノロジーズ Art.Nr 10338582
プリチデプシンファーママーボル
テゾミブLKT研究所B5871
SPF-white hen eggsCharles RiverFertilized  white Leghorn  ニワトリの卵
プラスチック計量ボートneoLab Art.Nr. 1-1125for ex-ovo culture
Petridish square (Lids)SimportD210-16for ex-ovo culture
RIPA Buffer (10x)Cell Signaling#9806
Protease阻害剤錠剤Roche11 836 170 001
Complete Mini EDTA-free
GFP ELISACell Biolabs, Inc.AKR-121
Histocette IISimportM493-6
PFA  37%Roth7398.1
DPBSLonzaBE17-512F
Ethanol absolutNormapur20,821,321
Roti-HistolRothArt.Nr.6640.4
ParaplastSigmaA6330
SuperFrost顕微鏡スライドR. Langenbrinck アート-NR。
Labor- u. Medizintechnik03-0060
DakoCytomation ウォッシュバッファー 10xDakoCytomationCode-NR.
S 3006
ターゲット回収液 (10x)  pH 6,1DAKOCode-Nr.
S 1699
H2O2Merck
m-a-hu ASMA clone 1A4DAKOM0851
m-a-hu CD138 clone MI15DAKOM7228
m-a-hu Vimentin clone V9DAKOM0725
m-a-hu Desmin clone D33DAKO M0760
m-a-hu Ki67  クローンMIB-1  ダコ M7240
ビオチン化ヤギ - 抗マウスIgGVector Laboratories Inc.BA-9200
ベクタステインエリートABCキットベクターラボラトリーズ株式会社#PK-6100
FAST DAB錠セット。シグマバイオケミカルズ#D4293
メイヤー'S haemalaun solutionMerck1,092,490,500
Roti HistokittRothArt.Nr.6638.2
ベンチトップロータリーミクロトームThermo Electron, Shandon Finesse ME+
Tissue embedding stationLeica, TP1020
Egg-IncubatorGrumbach BSS160
デジタルカメラ(オリンパスE410)とフレキシブルな冷光を連結した実体蛍光顕微鏡 オリンパス、SZX10
Ultra Turrax IKA T10ホモジナイザー
ライフ

参考文献

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