の歩行速度に対するエタノールの効果を測定するためのアッセイ<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

サマリー

C. elegansは、エタノールが行動に与える影響を研究するための有用なモデルです。このアッセイは、這うワームの移動速度に対するエタノールの影響を定量化します。このアッセイを用いて、初期の感受性とエタノールに対する急性の機能的耐性の発生の両方を測定することができます。

要約

アルコール使用障害は重大な公衆衛生上の問題であり、効果的な治療戦略が少ないのが現状です。より効果的な治療法の開発を遅らせている一つの困難さは、エタノールが行動に与える影響の分子基盤の理解が比較的不足していることです。Caenorhabditis elegans（C. elegans）線虫は、エタノールの分子的影響について仮説を生成し、検証するための有用なモデルを提供します。ここでは、エタノールに対する行動反応における特定の遺伝子と環境要因の役割を調査するために開発され、使用されてきた検定について説明します。この行動出力として運動を用いています。エタノールは用量依存的に寒天表面での這い回りを急性的に抑制します。その効果は動的なものであり、高い濃度にさらされた動物は、初期感受性として知られる初期の強い這い回りの抑制を示し、その後、薬物が存在し続けるにもかかわらず、移動速度を部分的に回復させます。このエタノール誘発性行動可塑性は、ここで急性機能的耐性の発達として参照されています。この検定は、これらの2つの表現型が異なるものであり、遺伝的に分離可能であることを実証するために使用されてきました。C. elegansにおけるこれらの急性行動反応に対する遺伝的および環境的操作の影響を調べるために、ここで説明する単純な運動検定が適しています。

概要

アルコール使用障害（AUD）は広範囲にわたり、深刻な健康、社会、経済的問題を引き起こします。人間において、AUDを発症する素因は、遺伝と環境の両方に大きく影響されています^1,2。濫用可能性の強い生理学的予測因子は、初期のアルコール（エタノール）への反応レベル（LR）であり、これは素人の飲酒者によって示されます^3-5。このLR表現型は、遺伝的および非遺伝的要素の影響を受けます⁶。エタノールへのLRに影響を与える分子メカニズムを決定することは、エタノール反応行動の研究の重要な目標です。

線虫のCaenorhabditis elegansは、エタノールが行動に与える影響を研究するためのモデルとして、ますます使用されるようになっています^7-9。ワームと哺乳類の神経系機能のメカニズムには強力な分子的保存性があり、ワームでエタノールへのLRに影響を与えることが示されたいくつかの遺伝子は、哺乳類でもエタノールへのLRに影響を与えることが示され^10-16、人間の濫用可能性にも関与していることが示唆されています^17-19。

エタノールはワームを酩酊させ、それがワームの運動速度の低下に反映されます。いくつかの異なる研究室が、例えば研究する運動行動（這う対泳ぐ^{11,12,14,20,21}）や実験に使用する溶液の組成（線虫培養培地対Dentの生理食塩水^20,22）など、いくつかの点で異なる行動測定を開発しています。興味深いことに、これらの多様な測定法は、エタノールの影響に対するやや異なる用量反応プロファイルを示しています。これらの結果は、這う行動と泳ぐ行動の基礎となる行動の重要な違い^9,23、およびエタノール反応における環境変数である浸透圧²⁰の役割を指摘し、様々な測定法の実験的詳細を記述することの重要性を強調しています。

この記事では、這う行動に対するエタノールの急性効果を測定する測定法を紹介します。この測定法は、エタノールに対するLRへの遺伝的および環境的影響を研究するために広く使用されています^{8,10,20,24,25}。哺乳類のLR表現型は、エタノールへの初期感受性とエタノールへの急性機能的耐性の少なくとも2つの要素から構成されています^26,27。ワームでは、この行動測定法を用いて、LR表現型をこれら2つの要素に分離できることが示されています。遺伝的および環境的操作が両方の表現型に与える影響は、この単一の測定法を用いて検討することができます。重要なことに、これら2つの表現型は遺伝的に分離可能です。

プロトコル

アッセイの前日に実行するための手順1.

1. 新鮮な線虫の増殖培地へのL4段階のワームをピック（NGM）プレートはOP50 E.の芝生を播種20 CO / Nにおける大腸菌 、文化、それらを。各アッセイ条件は、10ワームが必要です。ワームのO / N損失を可能にするためにワームの過剰を選ぶ。
   1. 最初の日の成人のみアッセイ動物;多くの変異体は野生型よりも遅い速度で成長する。試験した全ての動物は最初の日の成人になるように発達の遅れを持っている株でピッキングのタイミングを調整します。

2.手順アッセイの日に実行する方法

1. アッセイのための準備：
   1. 標準播種していない60×15ミリメートルNGMプレート上でアッセイを行う。蓋をオフにして、2時間37℃で使用する全てのプレートを乾燥させる。それぞれの実験試験のために、4乾燥したNGMプレートを使用します。これらは、0 MMと400 mMのエタノールアッセイプレートとそれに付随する順化プレートになります。
      注意：NGMプレートの使用はここに重要です。プレートの組成の違いは、特にそれらのオスモル濃度は、強く行動にエタノールの用量応答に影響を与えることができる、これは、少なくとも部分的には、動物²⁰によって蓄積されたエタノール量の変化に起因する。 NGM寒天は160ミリオスモルである。
   2. 乾燥させた後、アッセイに使用される非シードNGMプレートの各計量および体重を記録します。空のプレートの重量に基づいて、プレート内でのメディアの音量を決定します。ボリュームの寒天の重量の変換を近似するために、メディアは等量の水と同じ重さと仮定する。
      注：私達の最も一貫した結果は、元の10ml容量が8.3〜8.9ミリリットルの間の乾燥後の体積を有することを十分に脱水したNGM培地で見出されている。 2時間の乾燥時間の代替は、プレートがインキュベータの違いを考慮して、この容量範囲に達するまで乾燥させることである。
   3. 4銅リング（1の内径を溶かす。6センチメートル）炎で鉗子でworms.Grasp各リングの異なる遺伝子型または治療群のための囲い、熱として作用するプレートの表面に（ブンゼンバーナーからの強い炎がうまく機能）約3秒。まだ「スキップ」からそれを防ぐために、鉗子でリングを保持している間すぐにプレートにリングを置きます。
      1. リングはリング上のいくつかの点で鉗子で軽く押し下げて、寒天の表面に対して平らに載ることを確認してください。リングを配置する場合、追加の3つのリングのための余地を残すように注意してください。
      2. すべての4つのカメラの視野内になるように互いにできるだけ近くにそれらを配置するように注意しながら、プレートの表面に3つの追加の銅リングを溶かす。
         注：寒天で良好なシールを作るには、アッセイの間のリングでワームを保つために不可欠である。板の上に周りのスキップリングが寒天で正しいシールを作る可能性は低いとワームは穴を掘ることを可能にするとワームを可視化を妨げる寒天を、傷跡があります。
      3. 各アッセイプレート乾燥し、播種していないと何エタノールを受信しませんする必要があります添付「順化」のプレートを準備。これらのプレート上の4つの銅リングを置きます。
   4. リング自体の視野内に書き込まないように注意しながら、次のリングで使用するワーム株とそれぞれのリングに、プレートの下にラベルを付けます。それに付随する順化プレートとアッセイプレート上のラベルと一致。
   5. 最終濃度が0mMのまたは400mMのエタノール（体積に対する重量）となるように各アッセイプレートに追加する100％エタノールの量を計算する。各実験（n = 1 の場合 ）、1 0mMの一つの400mMエタノール板が存在する。順化プレートはエタノールを受信しません。プレートの表面のまわりでそれをピペットで、エタノールを追加します。プレートをシールするために実験用フィルムを使用し、それが2時間ベンチ上に平衡化させる。
   6. 1.5時間が経過すると、アッセイの順応ステップ、ステップ2.2を開始する。
2. アッセイプレート：歩行運動アッセイを実施
   1. 慎重に順化板上の銅リングの中心に各実験群の10ワームを転送する。ワームのピックで軽くこすることによって、この時点で寒天上に表示されている任意の食品を削除します。同株は、臨床試験で同じ順序でプレート上に置かれないように、実験群は、実験的試験を横切るプレート上に置かれる順序を変化させる。
      注：目標は、順応プレート上の食品がアッセイプレートに移された場合、ワームは、食品の周りに集約され、運動に対する薬物の効果が隠されるため、食品の最小限の量でプレートに動物を転送することである。
   2. これはワームが穴を掘ることができますし、アッセイを妨害するように、ピックと寒天の表面を壊さないように注意してください。室温で30分間ワームをインキュベートする。
   3. 各プレートのイニシエーションの間に適切な間隔があることを確認します。経験豊富な実験者は、<1.5分で4輪用の40の動物、10 /リングを移動させることができますが、2分までの任意の間隔が許容される。標準的なアッセイは、10〜12分であり、0 MMおよび400 mMのエタノールの両方の曝露の30-32分で記録映画を持っています。
   4. 第二のムービーが開始しなければならない前に、最初のムービーファイルの保存を可能にするために、約2分30秒離れて400 mMの露光用の0 mMの曝露と順化板に順化プレートを開始します。
   5. 30分間の順応期間の後、アッセイプレートに順応プレートからワームを転送する。それらは各プレートの補完の間のタイミングを追跡する、順応プレートに添加したのと同じ順序でアッセイプレートにワーム（0 mM以下の400mMエタノール）を転送する。気化エタノールの損失を最小限にするために実験用フィルムでプレートを密封する。
   6. U薄い刃の平坦化ワームにすくい運動は、平坦化されたピックの上にワームを収集するために選ぶSE。それはピックにワームを接着するのに役立ちますように、一般的にワームを搬送する際に用いられる細菌、を使用せずにアッセイプレートに播種していない順化プレートからワームの転送を実行します。
      注意：プレートの最初のウォームをプレートに加え、最後のワームよりも長いエタノールにさらさ​​れるので、動物がこの段階で転送される速度が非常に重要であり、以前の時点でいくつかの時間依存効果を示し得る。これは株は最初の実験の反復全体のプレート上に配置されて回転させるための主な理由である。
3. 歩行アッセイを実行します。ビデオ撮影
   1. そのような2048x2048 7.4と0.5倍の顕微鏡対物レンズ、0.8倍の倍率とカメラとして、視野（約42x42 mm ²の正方形）のすべての4輪の同時イメージングを可能にし、顕微鏡/カメラの組み合わせを使用して、81、m個の画素CCD。
   2. 強度閾値ステップで物体認識を助ける視野を横切っての照明にも使用する（下記参照）。 3「X3」バックライトはうまく動作します。
   3. イメージメディア側を上に配置プレート上のワームの光源を送信した伝統的な顕微鏡と比較してバックライトを使用する際に失われたコントラストを生成し（蓋ダウン）、。
   4. 移動するワームのタイムラプスムービーをキャプチャする画像解析ソフトウェアを準備します。 2分（1​​20フレーム）ムービーとして、1秒毎に12ビットグレースケール画像をキャプチャするためのソフトウェアを設定します。まだ十分な画像解像度を維持しつつ、出力ファイルのサイズを低減するために、1024×1024ピクセルの画像をキャプチャする2×2ビニングモードを使用する。
   5. 映画を記録します。最後のワームがそのプレート上に配置した10分後に最初のプレート（0 mMのエタノール）の120フレームの動画撮影を開始します。ムービーファイルを保存します。
   6. 第二のプレート（400 mMのエタノール）を記録します。このプロセスを繰り返します最後にワーム30分後に始まる両プレートは、各露光のために30〜32分の時間点を捕捉する第一プレート（0 mMのエタノール）上に置いた。
      注：分析すべき次のプレートの記録を開始する前に、各キャプチャセッション後の画像ファイルを保存するのに十分な時間を確保してください。
   7. アーカイブされた映画の未来プルーフ用の8ビット256グレースケールのTIFFファイルに各ムービーのコピーを変換し、これらの映画が開かれ、そのようなImageJの²⁸など、他のパブリックドメインのオープンソースイメージングソフトウェアプログラムによって分析されることを可能にする。
      注：ここで説明する画像解析ソフトウェアは、独自のファイル形式を使用しています。
4. イメージプロ（ImagePro）ソフトウェアを使用して映画の分析。
   1. キャプチャされたら、画像-Proソフトウェアまたはその同等Plusを使用して映画を分析する。
      注：他のオブジェクトトラッキングソフトウェアの様々な利用可能で正常に複数C.を追跡するために使用されたこと1時間²⁹などで虫オブジェクト識別ステップは同様の原理に基づいているソフトウェアは、合理的に、ここで説明したものに代替できた。記載されている方法は、画像プロプラスソフトウェアのバージョン6.0から6.3と7.0であって、イメージ·プロプラスソフトウェアの新しいバージョンでは、マイナーな違いがある場合がございます。
   2. 2分（1​​20フレーム）のセグメントに映画を分析します。まず、背景を平坦とウォームオブジェクトのコントラストを向上させるために画像にフィルタを適用する。次のようにフィルタを選択：メニュー>プロセス>フィルタ>強化>フラット化：パラメータ：背景=ダーク。 WIDTH = 20 Pixのを備えています。
   3. フィルタリングステップの後に映画を再保存が、常にそのフィルタリングされていない形でオリジナルのムービーを保持します。
      1. 配置され、銅リングとオーバーラップするような大きさの関心（ROI）の円形領域とは別に、各環における動物の運動を分析します。コマンド...メニュー>メジャー>トラックオブジェクトとワームを特定し、追跡する。これはトラッキングDが表示されますATA表ウィンドウ。追跡オプションボタンは、特定のトラックが除外されるように、任意の実験的なアーティファクトを制限することができます。
   4. 自動追尾]タブで、次のパラメータを使用します。トラックパラメータ：速度制限（検索半径）= 400ミクロン/フレーム、加速限界=オート、最小の総トラック長を=400μmで、優勢なモーションタイプ=混沌。トラックパラメータ内のオブジェクトは：部分トラック= YES、最小長= 21フレーム、トラッキング予測深さ= 1フレームを許可します。
   5. 追跡プロセスを開始するには、自動的にすべてのトラックを探すカウント/サイズオプション]ダイアログボックスと追跡ダイアログボックスを開き、ボタンをクリックして機能する。分析用のワームオブジェクトを強調するために、軽量化背景ピクセルを無視するワームピクセルのグレースケール強度を使用して重要なしきい値ステップを提供してカウント/サイズ]ダイアログボックス、内の強度範囲の選択のためのマニュアルのオプションを選択します。
      1. 強度閾値SLIを調整しますDERをすべて暗いオブジェクトを強調包括的な範囲を作成するには（下限値を設定する上限、1を設定するには、1）。 0-4,095の規模0-1,500の範囲は、より細かいチューニングのための良い出発点である。
      2. そのような銅リング、プレート上の任意の破片のような単一のワームオブジェクトより大きく、小さいオブジェクトを除外するためにサイズのフィルタを適用します。カウント/サイズオプション]ダイアログボックスの2尺度との姿勢の様々な個々のワームのためにサイズをカバーこれを行うには、サイズのパラメータ選択>計測メニュー項目を設定します。 （エリア範囲^{：28,000-120,000μm2}で、境界範囲：600-2,500ミクロン）。
      3. 変異株を分析するプレート上の他の動物よりも有意に小さい、または大きい場合、設定を変更する必要がないように、最初の動物を追跡​​する前に、株の異なるサイズに対応するために、物体認識のためのフィルタ設定の範囲を広げる半ば分析。
   6. 追跡ダイアログボックスで[続行]をクリックしてトラッキング処理を完了します。視覚自動フィルタの設定に基づいて、それを排除する正当な理由がない限り、すべてのワームが表現されていることを確実にするために映画の中の各ワームの進行に出力トラックを比較する。手動でサイズのフィルタ基準を満たして確認された非ワームのオブジェクトの存在によって生産されたトラックを削除します。
   7. 各フレーム間の各ワームの速度を計算するためのソフトウェアを使用します（距離はフレーム間の1秒あたりのオブジェクトの重心のために旅し）とにおけるワームの人口のためにすべてのトラック全体で各トラックの平均速度と平均速度を表示銅リング。この最終的な平均は実験的な臨床試験の面ではn = 1であると考えています。統計分析とデータアーカイブのためのスプレッドシートプログラムにデータをエクスポートします。
   8. データは、プレート上の第一のリングのために記録された後、次のリングにROIを移動させパラメータを変更することなく、追尾処理を繰り返す。
   9. ：を通して移動の相対速度を算出する
   10. 相対速度（％）=未処理（400 mM）の速度/（0 mM）の速度×100。
       注：別の遺伝子操作は、多くの場合、動物の基礎歩行速度を変える。動物の歩行速度に対するエタノールの効果を決定するために、異なる遺伝子型または条件にわたってこれらの効果を比較することができるようにするために、相対速度を算出する。

結果

いくつかの異なる遺伝子型とその対になったコントロールからの代表的なデータ（ 図1）は^{、8,24 を}提示されている。データは、具体的にアッセイした動物において、そのハイライトの違いを選択した。曝露の10分での効果の程度は、 図1B-Gの左軸に示されている株の初期感度と考えられている。 10分での対照よりも大きな相対速度を有する変異株は、エタノール（ 図1F、G）に耐性であると考えられ、一方（ 図1Dエタノールに対して過敏であると考えられる制御よりも小さい相対速度を有する変異株E）。図1の右の軸は10-と30分の期間の間の速度の回復の程度を示している。これは急性の機能的な耐性の発生（AFT）の速度の測定値を表しており、相対的なSPEから減算10分での相対速度として計算されます30分でED。対照動物は、AFT（ 図1Cの開発の低い速度を有すると考えられているよりも大きな回復値は、対照動物（

ディスカッション

C.で利用可能なシンプルな神経生物学と遺伝的ツール虫は、ワームの行動に対するエタノールの影響の分子基盤を研究するために優れたモデルにする。ここでは、エタノール^{8,10,20,24,25}に対する急性行動応答のいくつかの分子および環境メディエーターを同定するために使用されたアッセイを記載する。この方法は、二つの異なるエタノール応答挙動の表現型、初期感度と一緒に哺乳動物における応答のレベルの複合表現型をモデル化する急性機能寛容、の開発の分化と同時検査を可能にします。同じアッセイを容易それによって他の薬物の行動的影響の評価における複数の株の同時試験を利用して、他の薬理学的薬剤を研究するために適合させることができる。

10-12分間の時間窓らに歪みの初期感度を測定するために有用な時刻を提供hanol。露出の最初の10分の間で400 mMのエタノールの効果の分析は露出の第二分に始まる速度効果を示すが、効果の定常状態は、エタノール曝露²⁰の第七分までに達成されていません。による移動速度にこの時間依存性効果のために...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
C. elegans 株	Caenorhabditis 遺伝学センター
60 x 15 mm ペトリ皿、三重通気	Greiner Bio-One	628161	他の皿ブランドでも構いません。
NGM アガー	様々な		NaCl（3 g/L）、アガー（17 g/L）、ペプトン（2.5 g/L）、1 ml コレステロール（エタノールに5 mg/ml）、1 ml（1 M）MgSO4、1 ml（1 M）CaCl2、25 ml（1 M）KPO4、pH=6、975 ml H2O
フォーセット	様々な		例えば、Fisher Scientific #10300
37 °C インキュベーター	様々な		アガーの乾燥用
デジタルバランス	様々な		プレートの重量とアガーの量を決定するために
銅リング	Plumbmaster	STK#35583（48キャップスレッドガスケット）	1.6 cm 内径、1.8 cm 外径の銅リング
100% エタノール	様々な
パラフィルム M	Bemis	PM996
CCD カメラ	QImaging	RET-4000R-F-M-12	このカメラは広い視野を持っています。
C-マウントと 0.5X の物体レンズを備えたステレオマイクロスコープ	Leica	MZ6	廃止されたモデルで、M60が現在の同等品です。
光源	Schott	A08923	視野全体に均一な照明のための3”x3” バックライト
イメージングおよびトラッキングソフトウェア	Media Cybernetics	ImagePro-Plus v6.0-6.3	ソフトウェアの新しいバージョンにはトラッキング機能があります。