方法論記事

環境水試料から調製した次世代シーケンシングライブラリの品質を向上させるために自動化されたゲルサイズの選択

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DOI：

10.3791/52685

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2015年4月17日

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1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Faculty of Medicine, The University of British Columbia, 2Coastal Genomics, 3British Columbia Public Health Microbiology and Reference Laboratory

この記事について

サマリー

この原稿は、次世代シーケンシングのためのDNA断片を精製するための自動ゲルサイズ選択アプローチについて説明しています。Ranger Technologyは、アガロースゲルのローディング、電気泳動解析、および標的DNA断片の回収の全プロセスを完全に自動化し、ハイスループットで高品質な次世代シーケンシングライブラリを可能にします。

要約

これらのサンプルのDNA量と品質が異なるため、環境サンプルの次世代シーケンシングは困難な場合があります。次世代シーケンシングから最適な結果を得るためには、高品質のDNAライブラリーが必要です。水などの環境サンプルには、DNAの品質と量が少ないだけでなく、DNAと共沈する汚染物質が含まれている可能性があります。抽出およびライブラリ調製に関与する機械的および酵素的プロセスは、DNAをさらに損傷する可能性があります。ゲルサイズの選択により、シーケンシングアプリケーション用に定義されたサイズのDNA断片の精製と回収が可能になります。しかし、この作業は、DNAライブラリ調製ワークフローにおいて最も時間のかかるステップの1つです。ここで説明するプロトコルにより、アガロースゲルのローディング、電気泳動分析、および標的DNAフラグメントの回収を完全に自動化できます。

この研究では、淡水サンプルから高品質のDNAライブラリーを調製し、他の環境サンプルにも適用できるハイスループットアプローチについて説明します。間接的なアプローチを使用して、環境中の淡水サンプルから細菌細胞を濃縮しました。DNAは市販のDNA抽出キットを用いて抽出し、DNAライブラリーは市販のトランスポゾンベースのプロトコルを用いて調製した。500 bp から 800 bp の DNA 断片は、自動電気泳動ワークステーションである Ranger Technology を使用してゲルサイズを選択しました。サイズ選択DNAライブラリーのシーケンシングにより、リードの長さとシーケンシングの品質が大幅に改善されました。

概要

Metagenomicsは、存在する微生物群集を特徴付けるために、サンプル中のすべての遺伝物質の配列決定を含みます。これは、抽出された核酸をDNAライブラリに変換し、その後に次世代のシーケンシングを行う複雑で高価なプロセスです。最大限のデータ出力と正確なメタゲノミクス解析には、高品質のライブラリが不可欠です。水サンプルなどの環境サンプルは、分解される可能性のあるDNAの量が少ないことや、PCR4-6の阻害剤が存在することなどから、高品質なライブラリーの生成に大きな課題をもたらすことがよくあります。

高品質のライブラリは、理想的には狭い長さの範囲内のDNAのより長いセグメントで構成されています。シーケンシングランごとに生成される有用なデータの量を最大化するためには、ライブラリー内のDNAの長さは、少なくとも使用するシーケンシング法の最大読み取り長と同じ長さにする必要があります。Illumina MiSeqのようなシーケンシング・バイ・シンセシス技術を使用する場合、DNA断片のサイズはフローセル上でクラスターが生成される効率に影響します。例えば、ライブラリーが短いDNA断片と長いDNA断片の両方を含む場合、短いものはシーケンシングデータ7,8で過剰に表現されることになる。対照的に、同様のサイズのDNA断片を持つライブラリは、シーケンシングデータに比例して表されます。多くのライブラリー調製キットは、ライゲーションベースの方法を使用してDNAフラグメントにアダプターを添加し、インサート9,10を含まないアダプターダイマーを除去するにはサイズ選択が必要です。これを達成するための多くの方法11,12がありますが、最も一貫した結果をもたらす1つの技術は、DNAの電気泳動分離とそれに続く所望の長さのDNAの回収です13,14。このプロセスは、少数のサンプルに対して手動で実行できますが、数百のサンプルの処理に直面する場合は、自動化されたソリューションが必要になります。現在、ゲルサイズの自動選択に利用可能なプラットフォームは低スループットであり、シーケンシングのために大量のサンプルを処理するためには新しいプラットフォームが必要です。Rangerテクノロジーは、既存のリキッドハンドリングワークステーションと統合して、今日のハイスループット環境を満たすスケールで、サイズ選択と分析目的でアガロースゲル電気泳動を使用することができます。

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プロトコル

1。水の収集および濾過

  1. 様々なサイト（ 図1）からの淡水のサンプルを収集します。一連のフィルターを通してサンプルを渡し：1μmのフィルター、0.2μmのフィルター、および30kDaのカットオフ接線流フィルタそれぞれ体系的に独立した真核生物、細菌およびウイルスサイズの粒子にする。
    注：のみ精製し、0.2μmのフィルター（自由生活細菌）に回収された物質の分析は、このレポートに記載されているが、同様のアプローチがフィルターから回収された他の粒子に使用することができます。

2.細菌濃度、DNA抽出と精製

  1. 水のろ過システム（模式図、 図2）から0.2μmのメンブレンフィルターを取り外します。半分に0.2μmのディスクフィルターを折ると開放側を上にして50ミリリットルチューブに配置します。に1×リン酸緩衝溶液5ml（PBS）および0.01％のTween、pH7.4中の追加チューブ。複数のフィルタは、処理中に使用される場合、フィルタ毎に異なるチューブを使用する。 4℃でのフィルター付きストアチューブ（単数または複数）まで処理した。それ以外の場合は、2.2に進みます。
  2. 滅菌ピンセットで50mlチューブから0.2μmのメンブレンフィルターを削除します。ペトリ皿（チューブにPBS緩衝液を残す）にフィルタ（S）を配置します。
    1. 滅菌ピンセットと無菌のハサミで、小さなストリップにフィルタ（1センチメートル×1 cm）をカット。 DNA表面除染剤で拭くと、異なるサンプル間の1型の超純水でリンスし、70％イソプロパノール中に浸漬することによって、鉗子およびハサミを消毒する。
  3. バック同じ50ミリリットルチューブにストリップに切断フィルタを置きます。 50mlチューブ中のバッファー15mlの合計が存在するので、フィルタに1×10mlのPBSおよび0.01％のTween、pHが7.4を加える。
  4. （50 mlチューブをボルテックスアダプタを使用）、各50mlチューブに6クリーンタングステンビーズ（直径3mm）を追加パラフィルムでチューブをカバーし、そして20分間、激しくボルテックス。 MULTの場合ipleフィルターはきれいな50ミリリットルチューブに1サンプル、転送、プールのすべてのホモジネートから処理されます。 4℃で15分間3300×gでチューブを遠心。
  5. 1.7ミリリットルのマイクロチューブにペレットとアリコート細菌細胞（〜1ミリリットル分量）に懸濁します。サンプルあたり5マイクロチューブがあることに注意してください。
  6. 10分間万×gでマイクロ遠心チューブをスピンダウンし、〜200μlのマークまで上清のほとんどを除去。
  7. -80℃で試料を保存するか、製造元の説明書に従って市販のDNA単離キットを使用して、細菌のDNAを抽出するために進む。細菌のDNA抽出中にPBSまたはネガティブ抽出コントロールとしての水、およびEのいずれかを使用ポジティブ抽出制御として大腸菌 。
  8. 複数のチューブからのDNAが抽出されているので、1 2ミリリットルチューブに同じサンプルからのパラレルサブ分量をプールする。 0.1からなる溶液を用いてO / N沈殿を行う3 M酢酸ナトリウム、100％エタノールの2ボリューム、および5μg/μlの直鎖状アクリルアミドの5μLのボリューム。 -80℃でよく混合し、店舗のサンプル。
  9. 4℃で30分間、最大速度（17000×gで）で遠心。洗浄は氷冷70％エタノール、10 mMのトリス-Cl、pHが8.5の34μlの中でせいぜい5分間再懸濁DNAペレットのためのバイオセーフティキャビネット内で風乾さ1mlのペレット。
    注意：リニアアクリルアミドは、O / Nを沈殿させた後、DNAペレットを視覚化するのに役立ちます。
  10. 製造者の指示（材料の表を参照）、以下、それぞれ高感度蛍光核酸定量アッセイおよび微量分光光度計を用いてDNAの量と質を決定します。
    注：複数のサンプルを一度に製造される場合、二本鎖DNAとプレートベースの蛍光光度計/分光光度計を定量化するための超高感度の蛍光核酸アッセイが代わりに使用することができる。

3. DNAライブラリーの準備

  1. 〜0​​.2 ng /μLでの濃度に水サンプルから抽出したゲノム細菌DNAを正規化。
  2. トランスポゾンに基づく方法を用いて細菌DNAの酵素的に断片1ナノグラム（tagmentation）。製造者の指示に従って断片化したDNA上にアダプターとインデックスシーケンスを追加します。シークエンスインデックスが組み込まれている点で、製造業者の説明書に示されるように、被験体は、PCRの12サイクルにサンプルをtagmented。

4.自動ゲルサイズの選択

  1. メーカーの説明書に記載されている標準的なPCR後のクリーンアップ手順をスキップして（材料の表を参照してください）​​。サイズ選択後のPCR試料を直接に自動化されたゲルに基づくサイズ選択プラットフォームを使用。
    1. 各サンプルにローディングバッファーの3.5を添加する。
    2. 製造業者のプロトコルに続いて、電気泳動ワークステーション上にサンプルをロードし、500〜800塩基対のサイズ選択対象を指定して、300μlの抽出物中のプレキャスト1.5％アガロースカセットを用いたイオン体積。
    3. エタノール沈殿を経由して25μLまで生の出力材料（300μl）を濃縮する。
      注：または、フィルタープレートと真空マニホールドを経由してサンプル数が多いために濃度を自動化するために電気泳動ワークステーションを使用しています。
      1. 、3 M酢酸ナトリウムの0.1ボリュームを使用して生の溶出量を沈殿させ、100％エタノールおよび5μg/μlの直鎖状アクリルアミドの5μlの2倍量の。 -80℃CO / Nで、よく場所サンプルを混ぜる。 30分間17000×gで遠心分離サンプル。
      2. 上清を捨て、氷冷した70％エタノール1mlでDNAペレットを洗浄するために進む。
      3. 最終的に30分間17000×gで再び遠心サンプル、上清を廃棄し、空気乾燥し、10 mMのトリス-Cl、pHが8.5の25μlのDNAペレットを懸濁します。
  2. （オプション）5作るために自動化されたゲルサイズ選択プラットフォームを選択したDNAライブラリーのサイズの1μLを使用してくださいトリスEDTA緩衝液、pHが8.0を使用倍希釈。製造業者の説明書に従って二本鎖DNAの質を分析するために、チップベースのキャピラリー電気泳動装置を使用してライブラリーを分析する。

5.図書館正規化とシーケンシング

  1. メーカーの準備ガイドで説明したように（トランスポゾンライブラリ作製キットに含まれる）ライブラリ正規化ビーズを用いて、サンプルを正規化するために進んでください。
    1. あるいは、2 nMの最終的な二本鎖DNA濃度を達成するために、等モル比でプールし、続いて、高感度の蛍光核酸定量アッセイを使用して、二本鎖DNAライブラリーを測定する。プールされたライブラリの10μlの0.2 N NaOHを10μLを使用してライブラリを変性させるに進み、室温で5分間インキュベートする。 1ミリリットルと11.5 PMの濃度の最終容量に（トランスポゾン調製キットに付属）ハイブリダイゼーション緩衝液を使用して変性したライブラリを希釈する。
  2. ロードサンプル製造者の標準的な配列決定プロトコールに従うことによって、次世代シークエンシングプラットフォームの。

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結果

DNAの濃縮、および品質評価

細菌のDNA濃度は、0.01から0.11 ng ​​の/異なる流域部位の水サンプル当たりミリリットル（ 表1）の範囲であった。細菌画分から単離されたDNAは、それぞれ、1.8および0.3から1.6へ260/280および1.4の260/230比を持っていた。 A 260/230比のいくつかは、比較的低かったが、明らかな阻害が準備され、ライブラリと他の下流のアプリケーションでは観察されなかった。これらのアプリケーションは、PCRおよび定量PCRは、16SのrRNAおよびCPN 60、およびその後のアンプリコンの配列決定をした（データは示されていない）を標的テスト含まれる。

レンジャーテクノロジー

ハイスループット自動化されたプラットフォームを選択トランスポゾン...

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ディスカッション

アダプターダイマーと優先的に現在のプラットフォームで配列決定されている小型のインサートサイズのクラスタリングの存在は、使用可能な収率で、かつアンダー利用設備の容量15の減少を表している。ライブラリーを調製するためのトランスポゾンベースのアプローチと組み合わさビーズビーティング法の使用は、抽出4,5の他の方法と比較して、よりDNAの剪断を生じ得る。それにもかかわらず、抽出およびライブラリの準備のすべてのメソッドは、潜在的にシークエンシングの分布に偏りを紹介8,16を読み込みます。ライゲーションに基づく方法と組み合わせる自動核酸抽出プラットフォームを使用して、実験的な観測は、ショットガンライブラリーから、アダプターダイマーの過剰を除去するようには見えなかった（データは示さず）。この研究は、それによってアダプターダイマーまたは小のキャリーオーバーを最小化する、非常に特定の範囲内のDNAフラグメントを選択するサイズによって環境サンプルからライブラリーを調製するために修正されたプロトコルを用いDNA断片。自動化されたゲルサイズ選択プラットフォームの使用は、500〜800塩基対（ <...

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開示事項

ジャレドR.スロボダンとマシューJ·ネスビット両方が沿岸ゲノミクス、レンジャーテクノロジーを提供して個人所有のブリティッシュ·コロンビア州の法人の株式を保有。

謝辞

この作業は、Genome BC、Genome Canada、およびCoastal Genomicsによって資金提供されました。著者らは、サンプルの収集と処理に協力してくれたKirby Cronin氏とMichael Chan氏に感謝します。また、バイオインフォマティクスの支援について、Thea Van Rossum氏とFiona Brinkman博士に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
蠕動ポンプ Masterflex P/S 1400 SeriesThermo Scientific 1400-1620
0.2 &マイクロ;m Supor 膜VWRCA28143-969ポールコーポレーション、アンハーバー、ミシガン
タングステンカーバイドビーズ 3 mm (200)Qiagen69997
イソプロピルアルコール 70%ジェドモン製品825751ヘルスケアプラス
DNA 離れて VWR7010Molecular BioProducts, Inc. カリフォルニア州サンディエゴ
Milli-Q 浄水システムフィッシャーサイエンティフィックZMQS6VF0Yメルクミリポア。このシステムは終了しました。
20x PBS pH 7.5VWRE703-1LAmresco, Inc., Solon, OH
Tween 20Fisher ScientificBP337-100Fisher chemicals
Vortex adapter for 2 (50 ml)チューブVWR13000-V1-50MoBio、カールスバッド、カリフォルニア州
Vortex-Genie 2、120 V (G560型)VWRSI-0236サイエンティフィック・インダストリーズ(株)
ベックマン遠心分離機Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltdモデル J-6B
PowerLyzer Powersoil DNA 分離キットVWR12855-100MoBio、カールスバッド、CA
24 (1.5-2 ml) チューブ用ボルテックス アダプターVWR13000-V1-24MoBio、カールスバッド、CA
マイクロフュージ 18 遠心分離機ベックマン・コールター367160
ニンバス ワークステーションを選択レンジャーテクノロジーハミルトンロボティクス92720-01リキッドハンドリングワークステーションと統合されたレンジャーテック(電気泳動ハードウェア)
レンジャー試薬キットを含む コースタルゲノミクスCG-10600-150-12-21ローディングバッファーとカセットを含む
エチルアルコール(無水)市販アルコールP016EAANグリーンフィールド エタノール
酢酸ナトリウムシグマ・アルドリッチS2889-250G
リニアアクリルアミド (5 mg / ml)ライフテクノロジーズAM9520ビオン
エッペンドルフ冷蔵遠心分離機Raeycoラボ機器システム管理株式会社5417R
バッファー EB (250 ml)Qiagen19086
NanoDrop 1000 分光光度計Thermo ScientificND-1000
Qubit 蛍光光度計Life TechnologiesQ32857Invitrogen.この製品は販売を終了しました。
Qubit dsDNA HS assay kitLife TechnologiesQ32854Invitrogen
高感度DNA試薬Agilent Technologies5067-4626
高感度DNAチップAgilent Technologies5067-4626
Agilent 2011 BioanalyzerAgilent TechnologiesG2938B
Nextera XT DNAサンプル調製キットIlluminaFC-131-1024
ネクステラ XT インデックスキットイルミナFC-131-1001
MiSeq 試薬キット v2 (500サイクル)イルミナMS-102-2003
ミセックシステムイルミナSY-410-1003
州 アン

参考文献

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DNA Ranger DNA 500 800 bp

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