三次元（3D）腫瘍スフェロイド浸潤アッセイ

サマリー

周囲の正常組織への浸潤は、悪性腫瘍の決定的な特徴です。ここでは、進行したヒトがんの多くのモデルで例示されている天然の3Dバイオマトリックスへの浸潤のシンプルな半自動マイクロプレートアッセイを提供します。

要約

周囲の正常組織の浸潤は、一般に、腫瘍（良性とは対照的に）、悪性の主要な特徴であると考えられています。特に、いくつかの癌（ 例えば 、 多形性膠芽腫および頭頸部の扁平上皮癌などの脳腫瘍- SCCHN）のためには、深刻な罹患率の原因であり、生命を脅かすでも遠隔転移の不存在下であることができます。また、再発した癌は、残念ながら、多くの場合、現在より攻撃的な表現型での処理を以下に示します。したがって、標準的な抗増殖剤に対して相補的であり得る新規治療法を提供するために、侵入のプロセスを標的とする機会があります。今まで、この戦略は、侵入の詳細な分析および薬物スクリーニングに適した強固な、再現可能なアッセイの欠如によって妨げられてきました。ここでは、単純なマイクロプレート法を提供する（均一に基づいて、自己組織化3D腫瘍スフェロイド）のようなSTUのための大きな可能性を秘めています死にます。我々はまた、ヒト神経膠芽腫細胞株とターゲットと上皮成長因子受容体（EGFR）阻害剤に対する耐性の発達を強化マトリックス浸潤能と関連しているSCCHNモデルを使用してアッセイプラットフォームを例示します。単にデジタル画像解析を標準顕微鏡および画像キャプチャを必要とするイメージングサイトメーターおよび秒を使用して、1：我々はまた、半自動定量の二つの代替方法を提供します。

概要

古典的な抗癌剤の開発は、腫瘍細胞の増殖を阻害し、かつ/またはプログラムされた細胞死（アポトーシス）を促進する細胞毒性薬をスクリーニングするためのインビトロ細胞ベースアッセイの使用に大きく集中しています。より最近では、努力は、悪性細胞増殖の基礎となる分子原因の阻害剤の開発と標的療法に向かって移動しています。いくつかの見事な結果にもかかわらず、そのような薬剤は、多くの場合、薬剤耐性の急速な発達と関連しています。これは、癌死亡の大部分の原因である腫瘍細胞の浸潤性および転移能であり、その再発性疾患はしばしばより攻撃的な表現型を示すことを考えると、それは、新規に同定するために、インビトロ実験モデルにおいて ^1,2相補考慮することも論理的です癌のこれらの追加キー「顕著な特徴」を阻害する薬剤。

悪性進行の間に、腫瘍細胞は、取得します周囲の組織に侵入および/または遠隔臓器（転移）に拡散する能力。癌細胞は浸潤突起^3,4を形成することにより基底膜を貫通します。これらの構造は、アクチンフィラメント、特定の接着タンパク質およびプロテイナーゼで富化一括腫瘍細胞の運動性及び細胞外マトリックス^（ECM）5の分解に関与しているされています。浸潤突起は、ECMに延び、腫瘍細胞の浸潤のために重要であり、また、血行性（またはリンパ）播種および転移を促進する、脈管に溢出すると考えられています。

インビトロでの腫瘍細胞の浸潤を評価するための現在の標準的な方法は、以下のものが挙げられます。トランスウェルベースまたはボイデンチャンバーアッセイ単一細胞懸濁液は、ECM由来タンパク質の厚い層で被覆されたフィルタの上に播種した^2,6。次いで、細胞を侵入し、化学誘引物質に反応して、下部チャンバーに移動します。一般的に使用されるECMタンパク質は、I型コラーゲン、または基底膜の天然の組成を模倣する基底膜様マトリックス（EHS腫瘍⁷から派生BMM、 例えば 、マトリゲル、）です。

フィルタベースのボイデンチャンバー型アッセイ⁸の代わりに、細胞は、それらがゲルに侵入個別にまたは集合的に、次に単層を形成し、（線維芽細胞を添加してもよいた）ECMゲルの上に播種することができます。浸潤は、ゲル表面⁹から走行浸潤細胞および/ ​​または距離の数の点で測定することができます。通常、細胞は、周囲のマトリックス^2,6,10,11に腫瘍塊から侵入することを可能にするECMのゲル状の2つの層の間に配置された-腫瘍細胞はまた、完全にマトリックス中にいずれかの単一細胞懸濁液として、またはスフェロイドとして埋め込 ​​むことができます。

ここで説明した3次元（3D）腫瘍スフェロイド浸潤アッセイはhighlを使用して迅速、自動化侵入システムを提供しますウェルあたり1スフェロイドと、96ウェルプレートフォーマットでY再現性、標準化された方法^12。 BMMは、腫瘍細胞が、スフェロイド本体から侵入先の半固体マトリックスを提供するために、各ウェルに直接添加されます。 96時間 - 腫瘍細胞浸潤の程度は、72の期間にわたって間隔でモニターされます。この方法は、上記のインビトロ浸潤アッセイで過電流、次のような利点を提供します：腫瘍細胞は、腫瘍の微小領域またはミクロ転移を模倣3D構造に編成されています。腫瘍スフェロイドのサイズは非常に再現性があります。浸潤アッセイは、二次プレートに移動する必要なく、腫瘍スフェロイド開発同じプレート中でその場で行われます。自動画像解析の最新技術と組み合わせる方法は、高含有量と腫瘍細胞の浸潤のハイスループット分析の両方を可能にします。

画像分析は、96ウェルをスキャンイメージングサイトメーターを用いて行われます10分以内にプレート。合流アプリケーションを使用することにより、浸潤の程度および速度は、単一の細胞によって、または細胞クラスターは、腫瘍スフェロイドから拡散及びマトリックスに侵入するのいずれかによって達成動的に測定することができます。低いスループットのために、画像解析のための別の方法は、倒立顕微鏡と標準画像化ソフトウェアの使用に基づいて、提示されます。

プロトコル

再現性サイズの腫瘍球の1世代

1. リン酸緩衝生理食塩水（PBS; 25 cm ²以上8用の5ミリリットル- 75cm ^2のフラスコを10 ml）で洗浄する腫瘍細胞の単層を、（74 CMの25cm ^2のまたは2ミリリットル1 mlで細胞解離酵素を追加フラスコ^{2）2、37℃}で細胞をインキュベートする- 5分。
2. 顕微鏡下で細胞の剥離を確認し、完全増殖培地（75cm ^2のフラスコ25 cm ²以上8ミリリットルのための5ml）で細胞解離酵素を中和します。
3. 5分間500×gで遠心分離し細胞懸濁液。
4. 、上清を除去し、チューブをタップし、P1000ピペットを用いて完全増殖培地1ml中に細胞ペレットを再懸濁します。これは、細胞クラスターことなく、単一細胞懸濁液を得るべきです。
5. （最適な細胞密度がOで各細胞株について決定する必要が2×10 ⁴細胞/ ml -血球計数器を用いて細胞を計数し、0.5を得るために、細胞懸濁液を希釈300の腫瘍スフェロイド取得するRDER - 4日間の細胞播種^12,13の後に直径500μm）を。
6. 無菌の容器に細胞懸濁液を移し、マルチチャンネルピ ​​ペットを使用して、よく超低付着（ULA）を96ウェル丸底プレート¹²に200μL/を分注します。
7. インキュベーター（37℃、5％CO _2、湿度95％）でプレートを移します。 4日後、視覚的に腫瘍スフェロイドの形成を確認し、3次元浸潤アッセイを進めます。

2. 3D腫瘍スフェロイド浸潤アッセイ

1. 氷上でBMMを解凍します。
2. -20℃でP10、P200およびP1000ピペットと滅菌チューブのために（必要な総容量に応じて、1.5ミリリットル容量以上）を滅菌フィルターチップのセットを保管してください。
3. 氷の上で4日目のスフェロイドを含むULA 96ウェルプレートを置きます。
4. マルチチャンネルピペットを用いて、穏やかに回転楕円体プレートからの増殖培地100μl/ウェルを削除します。私に向かって、このステップ角のためのヒントウェルとスフェロイドの場所の底部との接触を回避U底ウェルのnside壁;スフェロイドの乱れを最小限に抑えることができます。
5. 氷のように冷たいのヒントを使用して、氷のように冷たいチューブにBMMを転送します。サイトカイン誘導侵攻や薬物評価研究のため、氷のように冷たいのヒントを使用してBMMに（2×最終濃度で）試薬を加えます。例えば^、S CALおよびCAL ^R扁平上皮癌細胞の浸潤を刺激する上皮成長因子（EGF）を使用します。 、静かに渦巻く泡の形成を回避することによって十分に混合します。
6. ゆっくりウェルの内壁に向かって先端を目指し、U底ウェルにBMMの100μLを分注します。最適な画像解析のために、スフェロイドは、ウェル¹²の中心部に残っている必要があり 、この工程が最も重要です。
7. 6複製/条件 - 5を許可する必要なすべてのウェルについて繰り返し手順2.6。必要に応じて、新たにチルド先端に変更します。
   注：経験のある、ディスペンマルチチャンネルピペットを使用してそれ自体BMM。
8. 存在する場合、滅菌針を使用して、気泡を除去。
   1. 顕微鏡を用いて、視覚的にスフェロイドが中央位置にあることを確認してください。ない場合は、4℃で3分間、300×gでプレートを遠心します。これは、スフェロイドを中心に、各ウェル内に配置されていることを確認します。
9. 37℃のインキュベーターにプレートを転送し、BMMを固化することができます。
10. 1時間後、マルチチャンネルピペットを用いて、穏やかに完全成長培地100μl/ウェルを追加します。サイトカイン誘導浸潤または薬物評価研究のために、培地（1×最終濃度）中のサイトカインまたは阻害剤が含まれます。試薬は、ステップ2.5でBMMに追加されなかった場合あるいは、（所望の最終濃度を3倍）、この時点で培地に追加します。

3.自動画像取得

1. サイトメーター上でのスキャンプレート間隔の駅で（仕様については、 装置材料の表を参照してください）すぐに72時間、またはより遅い侵入腫瘍細胞株のための96時間までのステップ2.10の後にゼロ（T0 =セットアップ浸潤アッセイの日は、時間からrting。
2. 「Confluenceの「アプリケーションを選択します。
3. 回転楕円体にフォーカスがあることを確認し、必要に応じて、手動で調整し、「 設定オフフォーカス」修正。
4. 「 サンプリングの設定 」の下では、ビュー（FOV）の中央のフィールドをスキャンする]を選択します。 BMMの添加に続いて、腫瘍スフェロイドは、このようにウェル全体をスキャンする必要はありません、中央の位置に残っている必要があります。
5. ソフトウェアでは、プレートマップ上に強調表示することによってスキャンする井戸を定義します。 「 スキャン開始 」をクリックします。
   注：スキャンは自動的に保存され、後でオフラインで確認することができます。

4.自動画像解析

1. 「Confluenceの「アプリケーションを選択します。
2. 「分析」タブでは、APPLICを調整エーションの設定が（ 例えば 、「精度」：低、通常、高、「強度閾値」：1 - 15）はBMM（ 図1参照）内に延びる細胞プロセスおよび浸潤突起を含む回転楕円体の周りに正確なセグメンテーションを生成します。および/または種々の時点で、各腫瘍細胞株のための設定を調整します。 「Confluenceの'アプリケーション措置選択FOVで、浸潤細胞で覆われたウェル領域の％。
3. 解析設定が適切であることを確認し、いくつかの異なるウェルをクリックすることで、プレートの他のスフェロイドのために（ すなわち、セグメント化は正確です）。分割は正確に回転楕円体の概要を示していない場合は、さらにアプリケーションの設定を調整します。
4. 「 分析の開始 」をクリックします。
5. 「 結果」タブで、分析の品質を確認するために、複数のウェルを確認してください。スプレッドシートプログラムにエクスポート」まあレベルデータ」。
6. Repea全ての時点のt分析。科学的なグラフと選択肢の統計ソフトウェアを使用して、棒グラフの時間に対する複製ウェルおよびプロット侵入の平均％のコンフルエンス（％コンフルエンス）を計算します。

5.マニュアル画像取得

1. 倒立顕微鏡を用いて、当該細胞株の浸潤の速度に応じて、96時間（96ウェルプレートのために、これは、約20を取る - 72まではt = 0から始まる時間間隔で各腫瘍スフェロイドのための画像を記録します - 30分）。 10X対物レンズを使用してください。浸潤領域が完全にビューの10Xフィールド内に捕捉するには大きすぎるとき4Xの目的に使用します。
2. 取得した各個々の画像を保存します。
3. キャリブレーションのために、両方の10倍と4倍の目標を使用して、ステージの目盛り（1ミリメートル）の画像を撮影（および画像を保存）。

6.手動画像解析

1. 選択した画像解析ソフトにステージ目盛画像を開きます。
2. GRATを入力してくださいicule測定、単位（μm）と、（10Xまたは4X）使用目的やキャリブレーションを行います。この手順は、一度だけ必要です。後続の画像分析のために、単純に必要なキャリブレーション設定を再ロードします。
3. 浸潤アッセイの画像を開き、画像を得るために使用される顕微鏡対物レンズ（10倍または4倍）に応じて、キャリブレーション設定を選択します。
   1. また、インポート画像は、撮像サイトメーター（ステップ3）で得られた倒立顕微鏡を用いて得られた画像について説明したように、手動で分析する（ 図3及び図4に示した結果を参照）。
4. スフェロイドがカバーするエリアを測定します。
   1. 代表的な結果（仕様は装置材料の表を参照のこと）のために、ここで使用されるソフトウェアでは、「メジャー」に移動し、「カウント/サイズ」を選択します。 「ファイル」、次に「設定ロード」を選択し、予め定めASSAを選択Y設定。そして、「カウント」を選択します。回転楕円体は、その後、正確にセグメント化されるべきです。
   2. 代わりに「魔法の杖/トレース]ウィンドウを開くには、「オブジェクトをマージ/描画'を「編集」に移動します。回転楕円体画像をクリックするとセグメンテーションを得るために、ワンドのカーソルを使用してください。手動でマウスを使用して、回転楕円体の輪郭を描くために（「 魔法の杖」ウィンドウで）「トレース」を選択します。
5. スプレッドシートに異なるパラメータ（面積、直径、周囲など ）のエクスポート測定。スプレッドシート上のレコードの関連画像情報（ 例えば 、ウェル数、相対時点）。
6. 科学的なグラフや統計ソフトウェアを使用して、時間に対する複製スフェロイド（侵略）の平均面積をプロットします。あるいは、線形GRAとして対時間領域に対するT = 0そしてプロット浸潤（％のT0）において、各時点でスフェロイド面積の変化を計算しますペーハー。

結果

3Dスフェロイド腫瘍の浸潤が図1に概略的に示した単純な、再現可能な、自動化された方法を用いて評価する：再現可能なサイズの腫瘍スフェロイドをULA 96ウェル丸底プレートに細胞をプレーティングすることによって得られます。 4日後に開始スフェロイドはBMMに埋め込まれています。これは、腫瘍細胞が侵入し、回転楕円体の外に広がっているに半固体の構造を提供します。スフェロイドは、各ウェルの底に、中央に配置され、BMMへの侵入を容易に72まではt = 0から開始した間隔で監視されている - イメージングサイトメーターを用いて96時間。これは完全に自動化された画像解析を提供することができます。

癌細胞の浸潤の異なるタイプの例は、 図2に示されている- 。4極めて悪性のヒト多形性膠芽腫 （GBM）細胞株U-87 MGは、タイト、球状三次元構造を形成し、その中のローカル脳腫瘍を例示するためにここで使用されます侵略は、キー生命を脅かすです特徴。一度BMMに埋め込 ​​まれた、典型的な「スターバースト」侵入パターン¹²で拡散U-87 MGスフェロイドからの細胞。腫瘍細胞は、半径方向にそれらが3次元の形状を維持したマトリックス内に延びます。 BMM中に延びる細胞プロセスの詳細および浸潤突起による腫瘍細胞浸潤の程度は、明らかであるとき、U-87 MGスフェロイドについては、図2に示すように、プロセスは、72時間の期間にわたって続きます。画像を使用して完全に自動化された画像解析は、フローサイトメーター、経時的腫瘍細胞の浸潤の正確な定量を可能にします。自動分析がU-87 MG回転楕円体からBMMに伸びる細胞突起の周りにセグメンテーションを生成し、図1に示すように、図2の定量化が得られます。この細胞株について、腫瘍スフェロイド体が侵入面積の測定から除外されることに注意してください。

invasの異なるパターンイオンは、人間の頭頸部扁平上皮癌細胞株によって表示されました。 CAL ^SおよびCAL ^Rは同質であるが、CAL ^Sに対して^は敏感であり、EGFRチロシンキナーゼ阻害剤に耐性の¹⁴ CAL ^R。 EGF、EGFの濃度（2.5 ngの/ mlまで）増加させたとして、しかしBMM（ 図3）に侵入も細胞株の非存在下では、スフェロイドは「芽」に見えます。 EGFのより高い濃度（40及び80 ngの/ mlで）での浸潤の程度が低下しました。これは、以前^15を報告された侵入の点でEGFに対する古典ベル型用量応答と一致しています。 20 ngの/ mlのEGFで、CAL ^S細胞ながらCAL ^{Rスフェロイド}の本体から押し出され、指状突起は、72時間（ 図3）の後に、低侵襲性でした。スフェロイドは、細胞株との間の最大の違いのために20ng / mlのEGFを含む（BMMに入れた後に、この差動侵入は48時間明らかでした）および72時間後に最大（ 図4）。これらの画像は、U-87 MGに関しては、イメージングサイトメーターを使用して迅速に取得しました。しかし、この場合には、別の方法を例示するために、侵入の程度は、スタンドアローンの画像解析ソフトウェアを用いて手作業で定量し、グラフィカルに提示されている（ 図3及び4）。これらの結果は、具体的には、薬剤耐性、浸潤性の表現型に拮抗します化合物をスクリーニングするために利用することができる薬剤感受性と耐性細胞間の表現型の違いを示します。

3D腫瘍スフェロイド浸潤アッセイの1概観図 。ワークフローはちょうどBMMへの埋め込み後の方法は、U-87 MG神経膠芽腫スフェロイドの代表画像を含むことを含むステップを示している（上のパネルを、T = 0）および浸潤した後 BMMへ（下のパネル; tは72時間を=）浸潤細胞によって覆われた面積を測定し、セグメンテーションとありません。バー=100μmである。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図BMMへのU-87 MG神経膠芽腫の回転楕円体の侵入の2時間コース。U-87 MGはBMMに3Dの侵入を監視し、イメージングサイトメーターを用いて72時間まで定量した回転楕円体。（A）代表的な画像との（B）定量腫瘍細胞浸潤を示しています。バー=500μmの。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

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図3. CAL ^R（抵抗性）とCAL ^S（敏感）腫瘍スフェロイド侵入。（A）代表的な画像とEGFの用量依存的なCALの^RおよびCAL ^S腫瘍スフェロイド侵入の（B）手動定量化が示されています。バー=500μmの。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図4。Bに配置された場合、CAL ^R（耐性）スフェロイドからの細胞は、CAL ^S（敏感）腫瘍スフェロイドより侵襲的ですEGF刺激CAL ^R腫瘍スフェロイドがCAL ^Sより顕著侵攻。（A）代表的な画像と、（B）浸潤を手動で定量化を示す時には、MM。示されています。バー=500μmの。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

ディスカッション

（神経膠芽腫とSCCHN）ここで説明する2つの腫瘍モデルは、具体的には、それらが効果的な治療法¹²に対する満たされていない必要性と臨床的に関連する局所浸潤癌であるように私たちの3Dアッセイを例示するために選択しました。薬物治療、 インビトロ薬力学（PD）バイオマーカーの変化の評価BMMおよび/ ​​または全体によって腫瘍球の侵入の免疫蛍光分析からの細胞回復を可能にする具体的な市販の試薬 ​​を使用し、次のウェスタンブロットまたは溶解物の免疫アッセイによって容易に行うことができ、次の染色をマウントします。

この浸潤アッセイは、in vitro薬物スクリーニングでの将来のための半固形培地ので、特に適切なへの腫瘍細胞の浸潤の迅速かつ再現性の評価に有用な技術です。癌細胞は、それらが腫瘍スフェロイドで示される「マイクロ腫瘍」から広がるように、3Dのようにマトリックスに侵入し、extracellul内に延びますARマトリックスのような環境。アッセイの真の三次元性が平坦とは異なる細胞形態に明らかである固体基板上に移動させるとき、付着形態の細胞が前提としています。侵入の程度は容易に、または画像化ソフトウェアと組み合わせて、標準的な顕微鏡を用いて、自動読み出しを可能にする、イメージングサイトメーターのいずれかを使用して定量します。さらに、この方法は、（細胞株は、蛍光タンパク質を発現するか、蛍光色素で予め標識付き例えば^）13蛍光イメージングに適しています。

U字型のウェル内に回転楕円体の中心位置を乱す恐れがある場合の方法は、BMMの添加によって表されるだけの重要なステップで実行するのは簡単です。これは、異なる焦点面におけるスフェロイドと、次善の画像解析をもたらすことができます。これは、各ウェルに慎重にゆっくりとBMMを追加することが重要です。 BMMの添加後に、プレートをチェックすることをお勧めします顕微鏡下およびローカリゼーションが許容できないとみなされた場合、これは穏やかな遠心分離によって改善することができます。経験では、これはほとんど必要ありません。この方法は、堅牢かつ非常に再現性であるが、実験間の変動は、BMMの異なるバッチで発生する可能性があります。これを回避するために、一連の研究を完了するために、単一バッチから十分BMMを購入することが望ましいです。

（そのようなアッセイのためのような）方法の限界は、腫瘍細胞は、おそらく、アッセイの時間枠の間に受ける浸潤および増​​殖を区別するのが困難です。細胞の倍加時間を考慮し、またはそのようなサイトカラシンDなどの細胞周期阻害剤を導入することができるが、制御または明らかに、特に急速に成長する腫瘍細胞を、それらのために、腫瘍進行のこれらの二つの異なる側面を区別することは容易ではないことより「広大」のではなく、浸潤、侵入パターンを持っています。このためにそれは並列3D増殖アッセイは、任意の阻害または刺激剤の具体的な効果を評価するために実行されることが示唆されます。注意深い用量応答研究が行われている場合、それは、増殖に対する影響を最小限の濃度を選択することも可能です。例えば、我々はHSP90は17-AAGは、24時間で、50％（GI ^_50）12によって3Dの成長を阻害する濃度以下の濃度ですでにU-87 MG 3D腫瘍スフェロイドの浸潤を阻害する阻害することを示しました。

一方、このアッセイの重要性は、他の標準的な浸潤アッセイ（ 例えば 、フィルタに基づくアッセイまたは3Dマトリックス¹中に単一の細胞の浸潤）と比較して、腫瘍細胞が似ている、回転楕円体から周囲のマトリックスに侵入することです"したがって、マイクロ腫瘍」または「マイクロ転移」、とは、アカウントに腫瘤の病態生理学の重要な側面を取ります。我々は、本発明の方法は、情報を提供します最初にスフェロイドを残し、また、個々に、単一細胞をBMMにより遠い領域に達すると、腫瘍細胞の集団行動。さらに、腫瘍球内の細胞は、遺伝子発現の変化を介して、移動および浸潤を促進することができ、低酸素および栄養枯渇が発生する可能性があり、このような特徴は、2Dのアッセイには存在しません。また、これのすべては、より複雑な3D分析が容易に標的検証および創薬に使用することができるように、具体的な96ウェルプレートを使用することにより、高スループットフォーマットと最新の画像技術で利用可能です。

我々は、本発明の方法は、腫瘍細胞の浸潤のさらなる側面に対処するためのさらなるアプリケーションを収容することができます。具体的には、余分な複雑さは、回転楕円体自体または周囲のマトリックスの中に、例えば、線維芽細胞および/または内皮細胞のような宿主細胞の添加によって想定され得ます。これはまた、異なる同時の使用により（剛性の観点からだけではなく、変更することができますBMMのncentrations）だけでなく、組成の点で（採用腫瘍モデルの特定の組織/器官に依存して、他の成分を添加することにより：乳癌^17）のための脳の癌¹⁶とコラーゲン例えば、テネイシン。

同様のセットアップ（スフェロイド及びイメージングの発生）は、腫瘍スフェロイドは、複雑な組織¹²または他の細胞特異的オルガノイド（ 例えばためのアストロサイトとに似た胚様体と共培養され、3D、組織浸潤を評価するために適合させることができます神経膠腫消化管癌の¹⁸または陰窩の文化）が、さらなる作業が自動化された画像解析を有効にする必要があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Corning Matrigel basement membrane matrix	Corning	354234	凝固を防ぐため 4 °C で保存し、冷却したピペットチップを使用して分注すること
Cultrex basement membrane extract, PathClear	Trevigen	3432-005-01	凝固を防ぐため 4 °C で保存し、冷却したピペットチップを使用して分注すること
超低接着 96-ウェルプレート	Corning	7007
EGF	Miltenyi Biotec	130-093-825	100 μl の 1% BSA (w/v) 水溶液を 100 μg の EGF に加える。この溶液 25 μl に 4,975 μl の RHB-A Medium を加え、5 μg/ml のワーキングストックを作成する。分注して -20 °C で保存すること
RHB-A medium	Stem Cells Inc.	SCS-SF-NB-01	EGF の希釈用
DMEM	GIBCO	31966-021	使用前に 37 °C のウォーターバスで温めること
ウシ胎児血清	Biosera	1001/500	使用前に 56 °C で加熱し、補体を不活化させること
TrypLE	GIBCO	12605	細胞解離溶液
Celigo サイトメーター	Nexcelom Bioscience	n/a	画像キャプチャおよび解析用の専門機器。顕微鏡による手動の画像キャプチャおよび独立した画像解析ソフトウェアでの代用も可能
IX70 倒立顕微鏡	Olympus	n/a	手動画像キャプチャ用にカメラと共に使用
Retiga Exi Fast 1394 デジタルカメラ	Qimaging	n/a	手動画像キャプチャ用に顕微鏡に取り付け
Image-Pro Plus 7.0	Media Cybernetics	n/a	手動画像キャプチャのためにカメラと顕微鏡を制御するソフトウェア
Image-Pro Analyzer 7.0	Media Cybernetics	n/a	スフェロイドサイズの手動測定用スタンドアロン画像解析ソフトウェア
Excel 2010	Microsoft	n/a	科学的グラフ作成および統計ソフトウェア
Prism 6.0	GraphPad	n/a	科学的グラフ作成および統計ソフトウェア