簡体ヒト好中球細胞外トラップ（のNET）の単離と取扱い

サマリー

以下のプロトコールでは、容易に入手可能な試薬を用いて、ヒト全血からの好中球細胞外トラップ（のNET）を単離するための非常に簡単な方法を記載している。次に、単離されたNETは、癌細胞を用いたin vitro接着アッセイにおいて使用することができる方法を示す。

要約

好中球細胞外トラップ（ネットは）最近、好中球の抗菌装備一式の一部として同定されている。別に感染との戦いにおける役割から、最近の研究は、それらが癌の進行を含む多くの他の疾患プロセスに関与し得ることを実証した。精製されたネットを分離すること、これらの機能の研究を可能にする重要な要素である。

このビデオでは、我々は容易に入手可能な試薬を用いて、ヒト全血からの無細胞NET単離の簡便法を実証する。単離されたNETは、その後、免疫蛍光染色、ブロッティングまたは様々な機能的アッセイのために使用することができる。これは、好中球自身の潜在的な交絡効果がない場合に、それらの生物学的特性の評価を可能にします。

密度勾配分離技術は、健康なドナーの全血から好中球を単離するために使用される。単離された好中球は、その後12-マイアにより刺激されるNETosisを誘導するISTATE 13-アセテート（PMA）。活性化された好中球は、その後破棄され、無細胞NETストックが得られる。

次に、A549ヒト肺癌細胞との接着アッセイにおいて使用することができる方法を孤立のNET実証する。 NETストックをコーティングするために追加された96ウェル細胞培養プレートのO / Nであり、ウェルの底に適切なNET単層形成を確認した後、CFSEで標識したA549細胞のウェルに使用される。接着細胞を、ニコンTE300蛍光顕微鏡を使用して定量化される。いくつかのウェルでは、1000U DNAse1はネットを分解するために数え10分前に追加されます

概要

好中球細胞外トラップ（のNET）タンパク質とヒストンの何百によって装飾された外DNAの鎖から構成される新たに発見された好中球由来の要素です。これらは、特定の刺激後の感染および炎症の文脈における好中球によって分泌され、それらが最初に感染に対する好中球の防御機構の一部であることが認められた。これらは、最初の細菌、ウイルスおよび真菌^1-3を含む種々の微生物の侵入者の捕獲を促進することが示された。微生物の捕捉することは、両方の直接NET関連タンパク質^3,4及び間接的に食細胞^5,6の地元の募集を通じてによってその破壊につながる。のNETの役割は、しかし、防衛をホストするために制限されていないようです。より最近では、彼らは、自己免疫疾患^7,8、血栓^9、妊娠関連障害^10、さらに癌の進行において重要な役割を果たすことが示されている^11,12。したがって、NETは、多様な生理学的プロセス、多数の重要な役割を果たしていると思われる。しかしながら、このような研究の新規な性質を考えると、多くのNETは、それらの効果を発揮するメカニズムについて解明されていない。ここで、我々は、好中球の不在内のネットの単離のための簡便法を提示する。

次のビデオでは、我々は、ヒト全血からのNETを単離するために簡略化され、容易な技術を実証する。無細胞のNETは、次いで、....

プロトコル

注：全ての実験は、地元の機関倫理指針に従って行った。

1.採血

1. 肘前venipuctureを通じて、グリーントップ（ヘパリン処理）チューブに健康なボランティアからの血液の14のチューブを収集し、氷上にセトリングする前に、各チューブを反転させる。最適な好中球の収量を確保するために、実験の15分 - 10内の血液を収集する。

全血から2.好中球の単離

1. 血液を希釈するCaおよびMgを含まないPBS 5mlの血液の各緑のトップチューブを洗ってください。 4×50ミリリットルコニカルチューブのそれぞれにおいて、RTでリンパ球分離媒体（LSM）の15ミリリットルを追加します。 18 G針を使用すると、鋭いLSM-血液インタフェースを作成する、慎重にLSMに希釈された血液の層60 mlシリンジに取り付けられた。
   注：可能な限り層の混合を避ける。
2. 休憩なしで21℃で30分間、800×gで遠心し。
   注：突然の休憩することができます異なる層の混合を引き起こす。
3. 底に赤血球および好中球堆積物を観察します。吸引し、底面のみ赤色層を残して、リンパ球および単核細胞が含まれているこれらの層の間のインタフェースを取り除くことを確認して、トップ2層（プラズマとLSM）を捨てる。
4. 各チューブに、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）20....

結果

NETは静的接着アッセイの成功の達成は、癌細胞の添加前のNETの単層（ 図1）を有するウェルの適切なコーティングを必要とします。それ以降のすべてのステップは、その層を破壊しないように注意して行う必要があります。のNETの適切な層を形成する場合には、 図2Aおよび図2Cに示すようにのNETに大きな癌細胞の接着を見ることが期待される。この効果は、 図2B及び図2Dに示すようにのNETを分解するDNAse1の添加によって抑止される。逆に、車両制御（ 図3）の存在下でのNETにA549接着の有意な減少があってはならない。高倍率視野（HPF）当たりの平均癌細胞接着の良好な推定を得るためには、ウェル当たり少なくとも4つのランダムHPFSをカウントすることが推奨される。よく、技術的な問題が原因のNETでコーティングされていないフィールドはCOUNのために考慮されるべきではないこれらとしての設定結果を改ざんする可能性があります。

ディスカッション

このビデオで実証好中球細胞外トラップ単離プロトコールは、好中球の単離およびNET形成のために文献で使用される様々なテクニックを兼ね備えています。これは、かなり複雑な変数のプロセスを簡素化し、他のプロトコルよりも少ない工程で精製された無細胞ネットを分離するための非常に信頼性と複製可能な方法を提供しています。また、容易に入手可能な試薬をプロトコル簡潔に追加し、大幅にコストを削減使用される。 NET濃度は容易に特定の目標（17）に合わせて操作することができるように、静的接着アッセイに向けてのNETのアプリケーションは、この分離技術によってもたらされる柔軟性を実証するのに役立つ。したがって、示された技法によって単離さNETは、様々な動的接着アッセイを含むアッセイの種類、遊走アッセイ、増殖アッセイの免疫蛍光および共焦点イメージング、電子顕微鏡法、フローサイトメトリー、ならびに伝統的なウェスタンブロッティングのために使用することができる。

その成功のために重要であるこのプロトコルのステップ数がある。まず、好中球が誤ってアポトーシスに至る分離プロセス中に活性化されてもよい。それは、ヒュー.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、変性、塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムなし	Wisent	311-425-CL
リンパ球分離培地 (LSM)	Wisent	305-010-CL
デキストラン塩酸塩 (粉末)	Spectrum	DE130	6% デキストラン溶液は、PBSにCaおよびMgを添加し、6%デキストラン粉末
RPMI-1640培地にL-グルタミン	を添加することによって作られます	350-000-CL	3% RPMI 溶液は、3% ウシ胎児血清
BD Pharm Lyse Lysing バッファー	BD Biosciences 555899
Phorbol 12-ミリスチン酸 13-アセテート (PMA)	Sigma-Alrdrich	P8139
DNAse1	Roche	11284932001
F12 DMEM	Wisent	319-075-CL
ウシ胎児血清 (FBS)	Wisent	080-150
ペニシリン/ストレプトマイシン	Gibco	15140-122
CFSE	Invitrogen	C1157
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
20 mm グリッド (150 x 25 mm)	Falcon	353025

を RPMI に添加して作られます。