間葉系幹細胞は通常、骨髄から得られ、拡大培養が必要です。処理前にサンプルが凝固する場合は、(酵素)血栓溶解薬ウロキナーゼを使用したプロトコルを適用して血栓を分解することができます。したがって、細胞は放出され、拡大培養に利用できるようになります。このプロトコルは、リサンプリングに代わる迅速で安価な代替手段を提供します。
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方法論記事
酵素法は、凝固した骨髄試料からの間葉系幹細胞を救出する
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
間葉系幹細胞(MSC)は、通常は骨髄から採取されますが、しばしば増殖培養が必要です。私たちのプロトコルは、臨床グレードのウロキナーゼを使用して骨髄の血栓を分解し、MSCを放出してさらに使用します。このプロトコルは、骨髄リサンプリングに代わる迅速で安価な代替手段を提供します。骨髄はMSCの主要な供給源であり、組織工学や自家幹細胞療法にとって興味深いものです。骨髄が抜血すると、造血系のすべてを含むため、骨髄が凝固することがあります。得られた血栓には、増殖培養または直接幹細胞治療のために失われたMSCも含まれています。イヌの骨髄サンプルの74%に血栓が含まれており、凝固していないサンプルから予想される幹細胞数の半分未満しか得られなかったことを経験しました。したがって、私たちは、労働集約的で費用のかかる骨髄の再サンプリングを避けるために、これらの血栓の酵素消化のためのプロトコルを開発しました。ウロキナーゼは、臨床的に承認され、すぐに入手できる血栓溶解薬であり、骨髄の血栓をほぼ完全に除去します。その結果、治療された骨髄穿刺液は、凝固していないサンプルと同数のMSCを生成します。また、ウロキナーゼ治療後も、細胞は代謝活性を維持し、軟骨形成、骨形成、脂肪形成の系統に分化する能力を維持しました。当社のプロトコルは、細胞の品質に影響を与えることなく、凝固した血液および骨髄サンプルをサルベージします。これにより、リサンプリングが廃止され、サンプリングコストが大幅に削減され、凝固したサンプルを研究や治療に使用できるようになります。
概要
間葉系幹細胞（MSC）は、再生医療及び組織工学における主要な役割を果たしている。彼らは彼らに自家療法の2,3のための理想的な候補をレンダリングしている、様々な細胞タイプ1に分化し、生着、移行することができます。最近、骨および軟骨修復のためのMSCを用いた臨床試験は、宿主病または心臓病、移植片対4を立ち上げた。これらのMSCは、臍帯または脂肪組織から採取することができるが、最も有望な結果は、骨髄由来の幹細胞5から得られた。
腸骨稜は、骨髄のかなりの量を収集することができ、したがって、吸引6の主な部位として働く。しかし、吸引の品質を回収骨髄の体積の増加に伴って減少する。骨髄穿刺液の最初の5mlを、高品質のMSCを含み、一方、より大量の撤退は、末梢血fの吸引物の希釈につながる高度に血管骨7を挿入します。抗凝固剤を使用しない場合は、そのため、本巨核球及び血小板の、骨髄吸引物は、凝固する傾向がある。しかし、たとえ抗凝固剤で、血栓が発生することがあります。
骨髄では、MSCは、全細胞プール8のごく一部を表し、ほとんどの組織工学または治療用途4培養中で増殖しなければならない。そのような文化が大きくすなわち 、初期の細胞プールに依存している。、多様性と高始動番号9の品質。引き出しからMSCの低い数字は、部分的にドナーの変動によって説明することができる。一方、低品質のサンプルからのMSCは、所望の細胞数に到達するために培養においてより長い時間を延長継代を必要とする。いずれの場合も、拡張継代は、細胞老化の源であり、10の潜在的分化の喪失につながる可能性がある。したがって、セルyを最大化することができるプロトコルを最適化ieldと有害な影響を防ぐには、11,12を開発しなければならない。
私たちは、犬のMSCとの仕事を始めたとき、私たちは幸いに凝固したヒトサンプル（10人に1）はあまり頻繁であったが約3〜4におけるイヌの骨髄サンプルは、血栓が含まれているのを見て驚いた。一方で、それは我々が凝固したサンプルからのMSCのはるかに低い収量を観察していることを、全く驚きませんでした。凝固したサンプルの定期的な問題を解決するために、我々は代わりにリサンプリングの血栓溶解薬ウロキナーゼを使用してプロトコルを開発しました。
血栓溶解療法は、心臓発作、脳卒中ため、または不要な凝固の塞栓症の原因となる血管の閉塞などの生命を脅かす状況に対抗することができます。彼らは、プラスミンおよび酵素プラスミノーゲン活性化因子によるフィブリンの酵素的切断を通して血栓の分解によって働く。患者の治療のための幅広い使用にもかかわらず、ごく少数の出版物は、その利用血栓溶解活性を存在実験室でのアプリケーションは、凝固したサンプルを救出するために、主にリンパ球に焦点を当てた。 1987年、肉じゃがら 。 13と4年後の機能的なリンパ球になり、血栓を溶解するためのストレプトキナーゼの使用を記載し、デ·ヴィスら 。フローサイトメトリーアプリケーション14のための血液および骨髄からの白血病細胞を単離するためのストレプトキナーゼの使用を拡張する。より最近の刊行物は、癌の診断15アルテプラーゼの使用を示唆している。同じ酵素アプローチを使用している間、私たちのプロトコルは、多能MSCの分離に焦点を当てて、幹細胞分野の研究者のためのツールを提供するために、骨髄を形成する。
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プロトコル
注：腸骨稜からのヒト骨髄吸引は、ルツェルン州の倫理委員会の承認を得てドナー同意から採取した。犬の所有者のconsent.Human（約20ml）およびイヌ（約10ml）を骨髄穿刺液を直ちに中止後に3.8％クエン酸ナトリウムを15mlの添加により抗凝固して腸骨稜からイヌ骨髄吸引物を採取した手術室で。試料を回収と同日処理する実験室の環境に移した。
ウロキナーゼの調製（従来1回目使用すること）
- 製造業者の説明書に従って、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を使用してウロキナーゼを再：10 mlシリンジを用いてセプタム入口フラスコに10mlのPBSを加える。ミリリットル50,000射出ユニット（U）を得かき混ぜることによって乾燥物質を溶解する。
- Sに500μlのアリコート（25000 Uそれぞれ）を準備terileチューブ。ストアアリコート-20℃と、少なくとも6ヶ月間に必要なときにそれを使用しています。
2.取手順（従来すべての骨髄治療へ）
- 凝固した骨髄穿刺液あたりウロキナーゼの一アリコート（25000 U）を解凍し（25 mlまで吸引ボリュームが正常25000 Uの単一のアリコートを使用して治療されている）。
- 37℃の水浴または振盪インキュベーターを予熱。
血餅の3酵素消化物
- 処理中の骨髄試料の微生物汚染を避けるために、層流生物学的安全キャビネット内ですべての作業を行う。感染の可能性の人間の材料を使用する場合は、保護手袋の使用だけでなく、慎重な取り扱いをお勧めします。
- 無菌の50ミリリットルチューブの上に100μmのセルストレーナーを置きます。慎重にストレーナを傾けたり、凝固材料の周りに移動する、セルストレーナーを通して骨髄穿刺液を注ぐ。のための滅菌ピペットチップを使用して、フィルターメッシュを通してより良い流れ。
注：PBSで凝血塊を洗浄することにより、例えば 、血餅のすべての希釈は避けてください。ウロキナーゼは、間接的に作用し、効果的なダイジェストのための生検からの血清の成分（ すなわち 。、プラスミノーゲン）が必要です。凝固材料と手順を継続しながら、ろ液をステップ3.6においてさらに使用するまで室温で保つことができる。 - 滅菌ピンセットを使用して、空の細胞培養皿に骨髄クロット材料を転送します。滅菌メスを用いて約2ミリメートル3の小片に破片をカット。
- 滅菌ピンセットを用いた50ml反応管に血餅の小片を転送する。ミンチ血栓が濡れ外観を有することを確認してください。それが乾燥しているように見える場合は、湿らせるステップ3.1からのろ液の一部を使用。
- ピペッティング5ミリリットルマイクロピペットを用いて、5回によって凝血塊を粉砕する。サンプルにウロキナーゼの1分量を追加します。水浴中、またはのいずれかで37℃で30分間インキュベート揺れ（優しく）インキュベータ。
- 5ミリリットルピペットを用いて5回上下にピペッティングとによって粉砕物。バイオセーフティキャビネットに、この手順を実行します。 37℃でさらに30分間インキュベートする。インキュベーション後5mlのピペットを使用して再度5回粉砕する。ステップ3.2からの濾液とプールする新鮮さ100μmのセルストレーナー上を通過。
- 遠心分離機500×gで10分間、周囲温度で細胞懸濁液。上清を捨てる。以下に記載またはMSC増殖培養のためのあなたの研究室の標準的な手順に従って、メディアで細胞ペレットを再懸濁。
拡張細胞培養およびCFUプレート4.シード
- α-MEM、10％ウシ胎児血清（FBS）、100 U / mlペニシリン、100mg / mlのストレプトマイシンおよび2.5mg / mlのアンホテリシンBを補充した：基礎培地50ml中の（赤血球および単核細胞からなる）細胞を再懸濁。ノイバウアーchambeを使用してトリパンブルー溶液で1:10に希釈した細胞を数えるR。
- 5×10 7細胞/ cm 2の密度で細胞培養フラスコ中の細胞をプレーティングし、37℃の加湿インキュベーター中でインキュベートする。利用可能な場合は、低酸素（5％酸素）の条件を使用しています。 CFUアッセイの制御のために、直径10cmの細胞培養皿に10 9細胞をプレー。
- 他の細胞は懸濁状態のままで、培養の3日後に、間葉系幹細胞は、細胞培養皿に付着している。 5 / mlの塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）を補充した基礎培地でメディアを変更。 CFUアッセイ制御のために、同様に細胞培養皿を扱う。
- メディア週3回の交換を、2週間の合計のための細胞培養を続けます。細胞が80％コンフルエントを超えた場合、トリプシン処理によって分割。 CFUアッセイ制御のために、同様にメディアを交換しますが、2週間のために細胞を分割しないでください。
CFUアッセイ5.ギムザ染色
- DIL：皿当たりギムザ-溶液10mlを準備UTE原液（グリセロール中で7.6グラム/リットルギムザ：メタノール）滅菌水で1:10（常に新鮮なワーキング希釈液を調製）。
- 細胞培養皿から培地を除去し、PBSで細胞を洗浄。ペトリ皿に液体を適用するときに非常に警戒して、細胞を洗浄をオフにしないようにしてください。
- RTで5分間純メタノールで細胞を固定してください。メタノールを捨てる。ギムザ溶液を添加し、37℃の加湿インキュベーター中で60分間インキュベートする。
- PBSで2回洗浄する。空気は、ペーパータオル上で第一の板状のヘッドを乾燥させる。手動でコロニーを数える。これが最善のプレートの背面にマーカーペンを使用して達成される。
6. MSCの分化
- 犬MSCの分化
注：犬MSCは、4週間の適切なメディアでの刺激により軟骨、骨形成および脂肪生成系統に分化した。 - のために 脂肪細胞分化、4×10 5 CEでの単層における培養のMSC次のように二つの異なる培養条件を交互LLS / cm 2で、
- DMEM +グルタ、3％FBS、100単位/ mlのペニシリン、100mg / mlのストレプトマイシン、2.5 / mlのアンホテリシンBおよび170 mMのインスリンを含有する脂肪生成維持培地で培養。
- 3％FBS、5％ウサギ血清、1μMデキサメタゾン、500μMの3-イソブチル-1-メチルキサンチン、33μMビオチン、5μMロシグリタゾンおよび17μMパントテン酸16を補足した維持培地と脂肪生成誘導メディア文化。
- オイルレッドOで染色することにより脂肪滴を楽しむ。簡単に述べると、10％ホルムアルデヒドで細胞を固定し、PBSで洗浄し、イソプロパノール中0.35％オイルレッドOで染色。
- 7×10 3細胞/ cm 2と以下に刺激で単層中の骨形成分化培養MSCの場合：
- アドバンストDMEM（GIBCO）+グルタ、5％FBS、100単位/ mlのペニシリン、100mg / mlのストレプトマイシン、2.5 / mlのアンホテリシンB、501; M L-アスコルビン酸-2-リン酸、10mMのSS-グリセロリン酸および100nMデキサメタゾン。
- フォン·コッサ染色（5％のAgNO 3）で鉱化預金を特定します。簡単に説明すると、蒸留水5％のAgNO 3を含むPBS汚れで洗浄し、10％ホルムアルデヒドで細胞を固定する。
- 軟骨細胞分化
- スポンジ状の医療機器からカットキューブ（側面あたり3 mm）は、凍結乾燥されたI型コラーゲンから構成され、セル17を支持する足場材料として用いる。
- 4×10 6細胞/ ml（〜7万細胞/立方体）の濃度の立方体の上にシードのMSC。
- 培地の添加の前に、細胞を30分間キューブに付着させる。
- DMEM / F12 +グルタ、2.5％FBS、100単位/ mlのペニシリン、100mg / mlのストレプトマイシン、2.5 / mlのアンホテリシンB、40 / mlのデキサメタゾン、50μg/ mlのアスコルビン酸からなる軟骨形成培地中のMSC-コラーゲン構築物を維持する酸2リン酸、を50μg/ mlのL-プロリン、1×インスリン - トランスフェリン - セレンX、および増殖因子β1を形質転換を10ng / mlである。
- 構文セクションにプロテオグリカンの蓄積を可視化するためにアルシアンブルー染色を使用してください。簡単に言えば、0.01％のH 2 SO 4および0.5M塩酸グアニジンに溶解した0.4％アルシアンブルーのセクションO / Nを染色する。次に、洗浄のセクションでは、40％DMSOおよび0.05MのMgCl 2中で30分間洗浄した。細胞を核ファーストレッドで対比染色した。
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結果
と一緒に、彼らは私たちの研究室（ 図1A）に到着したとき、犬の骨髄サンプルの74パーセント（N = 54）は血栓を含んでいたことの事実は、私たちはMSCの相当数が、血栓内に捕捉されたと信じていた、これらのサンプルからMSC利回りの低下。実際に、切片凝固材料の単純なDAPI染色は、高密度（ 図1B）中の有核細胞の存在を確認する。これは最終的にウロキナーゼを使用してプロトコルを開発するために私たちをトリガー拡張文化に利用可能なMSCの低い数字、につながる。一般的に私たちのプロトコルを適用した場合、ほぼ完全に消失凝固する。ただし、メソッドの開発中に、我々はダイジェストの前後に計量することによって体系的にダイジェスト血餅の問題に取り組んだ。これらの実験は、未消化の残りは、初期血餅重量（ 図2A）の15％（イヌ）または9％（ヒト）であることが明らかになった。
骨髄由来MSCの典型的な特徴はAです細胞培養皿に付着するビリティ。研究者は、MSCのために選択するには、この特性を利用する。結果として...
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ディスカッション
患者は少しだけ追加作業が手術室に人員によって行わなければならない利点と、（我々の場合、主に手術を背骨）手術を受けている間に定期的に、我々は、骨髄をサンプリングする。サンプルはすぐに撤退した後、クエン酸ナトリウムと混合されるにもかかわらず、彼らは、処理のために研究室に到着したとき、多くのサンプルが部分的に凝固しただった。この段階では、凝固した標本を交換するリサンプリングは、別々の追加の介入が再びローカルまたは全身麻酔6必要となります。これが貢献する臨床スタッフとドナーの両方の意欲を必要とし、資源21を大量に消費する。
ここでは、多能性MSCを分離するために凝固した骨髄サンプルに組換えヒトウロキナーゼを使用するプロトコルを提供する。我々は、ウロキナーゼ処理は細胞を傷つけず、分化能が保持されていることを実証できた。プロトコル同等の細胞プールを得ながらunclottedサンプルと比較して、わずか約1 1/2時間によってサンプル処理を延ばすので、短い。現在までに、このプロトコルは正常にいくつかのロットからウロキナーゼを使用して、異なる個人お...
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
この作業は、スイス国立財団助成金CR3I3_140717/1およびスイス対麻痺財団によって支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 基礎中部成分 | |||
| PenStrep 100X | Gibco | 15140122 | |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| MEM Alpha w/ Nucleoside, w/ stable Glutamine | Amimed | 1-23S50-I | |
| FBS Heat Inactivated | Amimed | 2-01F36-I | |
| Amphotericin B | Applichem | A1907 | |
| 脂肪原性中体成分 | |||
| DMEM-HAM F12 + GlutaMAX | Amimed | 1-26F09-I | |
| インスリン | シグマ | I5500 | |
| ラビットセラム | Gibco | 16120099 | |
| デキサメタゾン | Applichem | D4902 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
| ビオチン | シグマ | B4639 | |
| ロシグリタゾン | シグマ | R2408 | |
| パントテンーテ | シグマ | P5155 | |
| オイル レッドオー | シグマ | O0625 | |
| 骨形成媒体成分 | |||
| L-アスコルビン酸2-リン酸 | シグマ | A8960 | |
| ß-グリセロリン酸 | シグマ | G9422 | |
| 硝酸銀(AgNO3) | SigmaS6506 | ||
| 軟骨形成培地成分 | |||
| Biopad - スポンジ型医療機器 | ユーロリサーチ | ||
| L-プロリン | Sigma | P5607 | |
| インスリン-トランスフェリン-セレン x | Gibco | 51500056 | |
| ヒト形質転換成長因子-&β;1 | Peprotech | 100-21 | |
| アルシアン ブルー 8GX | シグマ | A3157 | |
| 核ファスト レッド | シグマ | N8002 | |
| ジェネリック | |||
| クエン酸三ナトリウム二水和物 | Applichem | A3901 | |
| PBS | Applichem | 964.9100 | |
| ウロキナーゼ | メダック | 1976826 | |
| 0.5% トリプシン EDTA | Gibco | 15400054 | |
| Giemsa 染色 | Applichem | A0885 | |
| ホルムアルデヒド | Applichem | A0877 | |
| 硫酸 (H2SO4) | Applichem | A0655 | |
| ジメチルスルホキシド (DMSO) | Applichem | A1584 | |
| 塩化マグネシウム (MgCl2) | Applichem | A3618 | |
| グアニジン塩酸塩 | Applichem | A1499 | |
| 消耗品 | |||
| 50 ml 反応チューブ | Axygen | SCT-50ML-25-S | |
| 10 ml シリンジ | ブラウン | 4606108V | |
| ステリカン針 (22G) | ブラウン | 4657624 | |
| 1.7 ml マイクロチューブ | ブランシュヴィヒ | MCT-175-C | |
| 100 μm細胞ストレーナー | ファルコン | 6.05935 | |
| 滅菌鉗子 | Bastos Viegas、SA | 489-001 | |
| 滅菌メス | |||
| プリマリア細胞培養皿 | ファルコン | ||
| Cチップノイバウアー改良バイオ | スイステック | 505050 | |
| 細胞培養フラスコ-フラスコT300 | TPP | 90301 | |
| 機器 | |||
| 微生物バイオセーフティキャビネット クラスII | スカン | 82011500 | |
| ウォーターバス | メモリ | 1305.0377 | |
| ストライペット 血清ピペット 5ml | コーニング | 4487-200ea | |
| 顕微鏡 | オリンパス | CKX41 | |
| 加湿インキュベーター ヘラセルズ 240 | サーモ科学 | 51026331 | |
| ヘレウスMultifuge 1S-R | Thermo scientific | 75004331 |
参考文献
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