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方法論記事

培養細胞および動物組織中のDNAの酸化バイオマーカー、8-オキソ-7,8-ジヒドロ-2'-デオキシグアノシンのHPLC測定、

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DOI:

10.3791/52697

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2015年8月1日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Environmental Health Science and Research Bureau, Health Canada

この記事について

サマリー

このプロトコルの目的は、培養細胞または動物組織からのDNAにおけるHPLC-EDによるDNA酸化のマーカー、8-オキソ-7,8-ジヒドロ-2'-デオキシグアノシン（8-オキソdGuo）の検出です。

要約

酸化ストレスは、DNAなどの生体高分子の酸化につながる、多くの生理学的および病理学的プロセス、ならびに生体異物代謝に関連しています。そのため、DNAの酸化の効率的な検出は、医学と毒物学などの研究分野、各種のために重要です。酸化的損傷を受けたDNAの一般的なバイオマーカーは、8-オキソ-7,8-ジヒドロ-2'-デオキシグアノシン（8-オキソdGuoあるしばしば誤っと称される8-ヒドロキシ-2'-デオキシグアノシン（8-OH-dGuoまたは8 - オキソ - dGの））。電気化学検出（HPLC-ED）と、高圧液体クロマトグラフィーにより8-オキソdGuo測定するためのいくつかのプロトコルが記載されています。しかし、これらは主に酸化促進剤で処理された精製されたDNAに適用しました。また、原因の研究室間の方法論の違いに、主に分析機器の違いによる、HPLC-EDによる8-オキソdGuoの検出のための公表された方法の採用は、各研究室によって慎重な最適化を必要とします。 Aこのような最適化処理を説明する包括的なプロトコルは、不足しています。ここでは、詳細なプロトコールは、培養細胞または動物組織からのDNAにおいて、HPLC-EDによって8-オキソdGuoの検出のために記載されています。これは、DNA試料の調製を容易かつ迅速に試料調製の間に発生することが望ましくないDNAの酸化を最小にするように最適化することができる方法を示します。このプロトコルは、酸化剤KBrO 3で処理した培養ヒト歯槽腺癌細胞（ すなわち 、A549細胞）における、および多環式芳香族炭化水素ジベンゾ（DEF、P）クリセンに曝露されたマウスの脾臓から8-オキソdGuoを検出する方法を示しています（DBC、旧ジベンゾとして知られている（L）ピレン、DalP）。全体的に、この作品は、HPLC-EDの方法論は容易に生物学的サンプル中の8-オキソdGuoの検出のために最適化することができる方法を示しています。

概要

その定常状態レベルの酸化的DNA損傷の頻度の増加に寄与し、多くの病的状態とxenotoxic代謝中に増加させることができる反応性酸素種（ROS）。いくつかの可能な核酸塩基の酸化物の中でも、酸化的DNA損傷を容易に '2の酸化形態の一つである安定したマーカー8-オキソ-7,8-ジヒドロ-2'-デオキシグアノシン（8-オキソdGuo）を用いて測定することができます-deoxyguanosine（dGuo）1。 8-オキソdGuoは最も豊富なDNA損傷2であり、したがって、複数のDNAの酸化生成物3の存在にもかかわらず、DNA酸化のバイオマーカーとして、より詳細に検討されています。ヒトでは、この損傷は8-オキソグアニングリコシラーゼ1（hOGG1）4によって塩基除去修復を経て修復することができます。未修復のままにすると、8-オキソdGuoが塩基対置換変異の形成（ すなわち 、Gは転換をTに）に貢献することができる4。重要なことは、8-オキソdGuoは、確立されたマーカーのFOです開始と発癌2の促進に関連するr個のDNA損傷。したがって、8-オキソdGuoの正確な定量は、酸化的DNA損傷5の有用なバイオマーカーであると望ましいです。

さらに広まっ2デオキシグアノシンの酸化的損傷を受けた形態のための正しい名前に関する文献における混乱と、日常的に酸化的DNA損傷6のバイオマーカーとして測定した化合物（複数可）の正しい名前があります。 8-オキソdGuo（ 図1に示す）の6,8-ジケトおよび6エノール、8-ケト互変異性型は、文献5,7で説明した2つの最も顕著な互変異性体です。 6,8-ジケトフォーム7.4の生理的pHで最も顕著な形態であり、そして最も顕著なDNAの酸化生成物7です。したがって、8-オキソdGuoはなく8-ヒドロキシdGuoこの酸化生成物6のための最も適切な名前です。むしろnucleobより、2 - デオキシグアノシン（dGuo）ことに注意することも重要ですアーゼのグアニン（グア）またはリボグアノシン（郭）が、それぞれ、最も方法6により検出されます。

DNAサンプルの消化i）においてばらつき、試料調製中に発生する可能性がある8-オキソdGuoにdGuoのii）の不定酸化、 およびiii）必要性：8-オキソdGuoの正確な検出および定量化が原因に困難です分析HPLC-ED法8の効果的な検証のため。 III）を部分的にのみを含めることによって対処している間にこのプロトコルでは、封入金属キレート剤とキレート剤処理されたソリューションと特殊なDNA単離試薬によって、我々は完全なDNA消化のための有利な条件を提供することにより、）私を達成することを目的とし、II）ポジティブコントロールは、したがって、本方法は、生物学的試料中の8-オキソdGuoを検出することができることを提供します。さらなる検証はこの論文の範囲を超えています。しかし、このプロトコルは将来のを助けると確信していますユーザーは、彼らが正式にその目的に応じて、プロトコルを検証する必要がどの程度を決定します。メソッドの仮の検証に必要な手順のリストがさらに提供されます。 8-オキソdGuo検出のための方法の開発と展開の間に、公表された方法を検討し、併合されました。したがって、この方法は、8-オキソdGuoの検出および定量のための方法がうまく採用されている場合にも、検査の迅速かつ簡単な手段を提供しながら、多くの場合、重要な実験の詳細を欠いている、いくつかの公開されたソースから情報を収集する必要がなくなります。この適応方法は、正常培養細胞およびマウス組織からDNAサンプルを分析するために使用しました。このビデオの記事は、HPLC-EDによる8-オキソdGuoを確実に検出および定量化のための効果的な方法を確立する他のグループを支援します。

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プロトコル

ことを確認し、すべての畜産、住宅、取り扱いおよび実験は、ローカルルールと規制に準拠し、その実験プロトコルは、任意の研究を開始する前に承認されています。記載された実験では、動物のケア、処理、および治療はカナダ保健省の動物管理委員会によって承認されました。サプライヤーの詳細については、「試薬テーブル」を参照してください。

1.生物学的サンプルを収集

  1. 細胞または動物組織
    1. 10％ウシ胎児血清、ペニシリン100単位/ ml及びストレプトマイシン100μg/ mlを含むF12-K培地でヒト肺胞腺癌A549細胞を成長させます。
    2. 10 cmのプレートあたり約100万個の細胞でシード細胞。各実験について、酵素消化及びHPLC分析のために十分なDNA（80μgの）を提供するために、合計12プレート（X 4用量つの生物学的複製ごとに3つのプレート）のセットを使用します。
    3. 細胞密度はおよそより大きくなるとimatelyプレートの表面積の70％は、培地を除去し、リン酸緩衝生理食塩水4mlの（PBS）、pH7.4で細胞を2回洗浄します。
    4. 動物培養細胞については、陽性対照としてKBrO 3を使用しています。
      注：KBrO 3濃度と8-オキソdGuo周波数と正の直線関係は、文献9で報告されています。
    5. PBSでKBrO 3を溶解します。細胞培養培地中の最終濃度は未露光細胞に8-オキソdGuoの相対的で統計的に有意な増加を得ることが1mm以上であることを確認してください。シリーズ（ 例えば 、12 10 cmのプレート）の各プレートにKBrO 3の同じ濃度を追加します。
    6. 37℃で3時間培養します。メディアを取り出し、PBSで1回洗浄。
    7. （ストック濃度2.5グラム/ ml）のトリプシン溶液1mlを加え、37℃で3分間インキュベートします。
    8. 4ミリリットルのPBSで洗浄し、各単一50ミリリットルに設定円錐polystyrから細胞を採取エン遠心管、および4℃で5分間1,000×gで遠心します。
    9. PBSを除去し、さらなる分析まで-80℃で細胞ペレットを保存します。他の箇所10記載の人工DNAの酸化は、さらに、核の単離によって最小化することができます。
  2. 動物組織
    1. 必要に応じて動物を用量。このプロトコルでは、成人（9週齢）オリーブオイルに溶解し20 mgのDBC / kg体重当たり一日で3日間連続して毎日の経口胃管栄養法により男性の牟田マウスを治療します。
      注：このトランスジェニック動物の港に操作されたE.からλバクテリオファージおよび変異レポーター遺伝子のlacZ コリ 11は、トランスジェニックげっ歯類突然変異試験12に使用されます。
    2. 例えば 、動物の剖検を行い、マウスはイソフルランを使用してできて麻酔した後、胸腔の開口部に続いて頸椎脱臼を介して安楽死させました。直ちに液体窒素中で凍結組織を点滅。分析まで-80℃で保存した組織。
      注：処理後の安楽死の時期はもう一つの重要な変数（例えば、DNAの酸化はラットの脳と肝臓13における騒音暴露後72時間で最大であった）であってもよいです。

2. DNA抽出、沈殿および洗浄（組織を2.2に直接進むために）

  1. 例えば、DNAzolとしてDNA単離剤1mlを50mlコニカルポリスチレン遠心管中に回収した細胞をホモジナイズします。溶液が均一になるまで、細胞ペレットを分散させるために千μlのピペットチップを使用してください。新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブにホモジネートを転送します。 10〜20分間氷上でインキュベートします。 2.3に進みます。
  2. 500μlのDNAの隔離剤を含む1ミリリットルハンドヘルドテフロン加工のガラスホモジナイザーで組織の15〜20 mgの均質化します。ゆっくり上げ、約1分間の下ホモジナイザー;より柔軟な組織が少ない時間を必要とします。穏やかな治療法は、DNAの少ないせん断を保証します。約10〜20分間、氷上でホモジネートを保管してください。
  3. ペレット1.5ミリリットルの円錐形マイクロチューブ10,000×gで、4℃で10分間遠心分離によりホモジネート。
  4. 慎重にペレットを接触させることを避けるために細心の注意を払って新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブに上清を移します。
  5. ホモジネートを1ml当たり0.5ミリリットルの100％エタノールを添加することによってホモジネートからDNAを沈殿させます。単離試薬を確実にするために、チューブを10回反転し、EtOHで十分に混合されています。
  6. この時点で、DNAの沈殿を（200μlの最大保持容量で、 例えば ）プラスチックピペットチップにそれをスプールしてから、新しい1.5ミリリットルの円錐形のマイクロチューブに移し、粘性です。
    注：クイック遠心分離は、単離されたDNAから残りの溶解物を除去するために使用することができます。
    （DNA洗浄と可溶化）
  7. 単離されたDNAは75％エタノールを1ml加えます。チューブを10回反転させて徹底的にDNAペレットを一時停止します。
  8. 慎重にチューブからエタノールをデカント。その目を確認してくださいEのDNAペレットをチューブの側面に付着します。 1-2分間垂直にチューブを保存し、チューブの底から余分なエタノールを除去するために、ピペットを使用しています。
  9. もう一度洗浄し、そしてC（数ヶ月のための安定した）-20℃でエタノール中のサンプルを保存したり、すぐに消化に進むのいずれかのDNAを繰り返します。
  10. 消化緩衝液中でDNA（以下に記載）を溶解した後、（ すなわち 、260nmにおける吸光度を分光光度計を使用して）標準的な分光法を用いて定量化します。

3.酵素消化

  1. 適切な量を組み合わせることにより、「消化緩衝液」を調製一塩基リン酸Na、50mMの二塩基リン酸Na（2.0のKCl、1.0ミリモルのデスフェラール（DFO）と200のMgCl 2を含む）50mmの（サンプル数に応じて消化し ​​ます） （また、2.0のKCl、1.0mMのDFOおよび200のMgCl 2を含みます）。各サンプルは、4.0μlの一塩基および17.0μlの二塩基性リン酸塩溶液を必要とします。
  2. チューブの底から残りのエタノールを除去し、約5分間、空気乾燥サンプル。 DNAが完全に乾燥しないことを確認してください。
  3. 消化緩衝液の21.0μlのDNAを抽出した80μgのを溶解、私は消化バッファーの2.0μLに溶解したDNアーゼの1単位を追加します。
  4. ボルテックス軽く完全な混合を達成し、37℃で1.5時間インキュベートします。
  5. インキュベーション期間の終わりに、2.0ミリモルのKCl、1.0mMのDFOおよび200 mMのMgCl 2を含有する50mMの二塩基性リン酸ナトリウム溶液216.4μLを加えます。
  6. 二塩基の9巻、50 mMのリン酸Na（2.0 mMのKClを含む、1.0 mMのDFOおよび200のMgCl 2）で消化緩衝液の一冊を組み合わせることにより、「消化緩衝液-2」を準備します。
  7. 私は消化緩衝-2の16.3μlの酵素ホスホジエステラーゼの0.025単位（PD​​E）を追加します。数秒間上下にピペットし、軽くボルテックス十分な混合を達成し、37℃で1.5時間インキュベートします。
  8. 0を追加します。消化緩衝液-2の8.0μlのアルカリホスファターゼ（AP）の0.4単位。数秒間上下にピペットし、軽くボルテックス十分な混合を達成し、37℃で1.5時間インキュベートします。 33.0μlのHPLCグレードメタノールを追加します。
  9. 酸化を最小限にするために使用するまで-80℃ですぐに、以下に記載またはストアとして、HPLCで消化されたDNAサンプルを実行します。注：ここで提案1.5時間の消化ステップは、そのような間隔に基づいて他の場所9と同様のプロトコルは、完全なDNA消化9を達成することを発見に提案しました。したがって、完全な消化を達成するための唯一の制限因子は、時間であり、この酵素の阻害は、試料の不均一性が無視できたと仮定しました。

4. HPLCを実行します：移動相の調製、計測のセットアップとメンテナンス

  1. すべての緩衝液を調製するために超純水を使用し、高い結合強度樹脂（ 例えば 、キレックス100で処理した：スチレンdivinylbeイミノジ酢酸とnzene共重合体は、高い親和性を有するキレート化遷移金属）は、試料調製中に金属汚染及びDNAの酸化を最小限に抑えるために、そのイオン。
  2. 250mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH 6.2を準備します。リン酸ナトリウム（FW = 119.98グラム/モル）を一塩基ために第二リン酸ナトリウム（FW = 177.99グラム/モル）の3.6957：1の比率を使用してください。
    例：したがって、3 L原液のために、一塩基性の70.81グラムと二塩基粉末の28.43グラムを組み合わせ、例えばまで2.8 Lを、水を追加し、溶液のpHが6.2であることを確認します。濃縮された酸または塩基によって個別にではなく、準備250mMのモノまたは二塩基性リン酸ナトリウム溶液とのpHを調整します。 10のKClの濃度を得るために、塩化カリウム2.24gのを追加します。
  3. - HPLCグレードのメタノール、溶剤 - Bの超純水、溶媒C - リン酸緩衝液のステップ4.2から溶媒Bを：含む、3本、少なくとも1 Lごとに移動相を準備します。ボトルにHPLC移動相供給チューブを挿入します。 remainiNGチューブはまた、ボトルの一つ（ 例えば、溶液C）中に浸漬し、それらが混合のために必要とされていない場合でも発動を促す必要があります。
  4. 実行中、2.0mMのKClを含む50mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.2）、6％のMeOHの最終溶液を達成するために、6％溶媒A、74％溶媒Bから20％溶媒Cとしての移動相溶液を混合。
  5. 、電気化学検出器から電極を外し、それと電極洗浄液できれいに参照電極と作用電極とメーカーが推奨する研磨ディスクを分解。 、超純水で洗浄された表面を洗浄し、穏やかに水を拭き取り、検出器は、システムをオンにする前に乾燥していることを確認します。
  6. 検出器を組み立て直して電極に移動相入口を接続します。流れをオンにして、移動相が流出移動相チューブを取り付ける前に電極を埋めることができます。最適化を開始する前に新しい列をインストールします。インストールが適切な方向およびfであることを確認してくださいすべてのメーカーの推奨をollows。
  7. かなり前（ 例えば、1時間）、サンプルのHLPC計器をオンにすると、平衡化を可能にするために、ベースラインノイズを低減するために分析します。推奨設定については、表1を参照してください。背圧力限界は、カラムの損傷を避けるために、3,000 PSIに設定してください。脱気装置の電源をオンにします。ポンプをプライミングし、溶媒勾配を設定するに進みます。
  8. ドライプライム製造業者の指示に従ってポンプ。移動相が交換されたか、チューブの入口が空気にさらされている行を濡らすためにこれを行います。
  9. プライミングディスクを見つけて、そこに10〜15ミリリットルのプラスチックシリンジを挿入します。注射器が完全にラインを開く前に挿入されていることを確認します。回線を開くには、単に一回転するディスクを反時計回りに回します。
  10. 適切なHPLCインターフェースの選択と素数を開始します。静かラインに流体を描画するために注射器を引き出します。流体が流れているしたら、首相は完了です。プログラムができるようにします実行を終了します。すべての行（楽器に応じて、通常は4）を繰り返します。
  11. 代わりに、行がすでに以前のドライプライムから濡れるウェットプライム（下記参照）。
    注：多くの時間が使用する（ 例えば 、2週間以上）との間に経過すると、ドライ素数をお勧めします。
  12. HPLCユーザインタフェースを使用して25％のそれぞれの移動相溶媒成分の組成を変更します。インターフェースから、その後、「ダイレクト機能」オプションを選択し、「ウェットプライム」オプションを選択します。これは同時にプライム全てのラインになります。
  13. すべての空気が、それは廃棄物容器に入ると、ウ​​ェットプライムラインを観察することによって、システムの外にあることを確認してください。良いプライム後、気泡が一列に残っていないことを確認してください。泡が持続する場合、プライミングを繰り返します。
  14. ポンプがプライミングされると、HPLC移動相の移動を開始します。手動で6％のメタノール（溶媒A）および94％の移動相の組成を変更するためにHPLCを使用して、インターフェイス水（溶媒B）、0.9 ml /分の流速を選択します。 5分は、カラム洗浄工程から任意のメタノールをクリアすることができます。
  15. 5分後、6％のメタノール（溶媒A）、74％の水（溶媒B）、20％の緩衝液（溶媒C）の組成を変化1.0mL /分の流量を増加させます。 表1に要約し、カラムの損傷を回避するために、3,000 psiのに背圧の上限を設定するなどの他のパラメータを設定します。
    注：HPLCセットアップの潜在的な問題が漂うベースライン、スプリットピークと減少し、信号強度が含まれます。これらは通常、各使用後に頻繁な電極クリーニングカラムを洗浄し、緩衝液（ 例えば 、粒子状物質または微生物増殖）汚染のないことを保証することによって克服することができます。
  16. 安定したベースライン信号を達成するために、約1〜1.5時間、移動相を実行します。
  17. 機器のソフトウェアインタフェースを使用して、 表1に示され、15分の時間を実行したように、選択パラメータ。 SAMを注入PLE。複雑なサンプルのために増加した実行時間を使用します（15分間隔を超えてピークの有無を観察することによって、経験的にこれを決定します）。
    注：インストゥルメントソフトウェアは、自動サンプリング用のサンプル実行条件のプログラミングとセットアップを可能にします。
  18. 実行が完了した後、検出器のインターフェースを使用して検出器セルをオフにします。これは、不適切な取り扱いやシャットダウンなどの検出器は、機器に損傷を与える可能性がパワーダウンに関するメーカーの推奨に従うことが重要です。これは、機器が故障することがあり、検出器の背面を切り替えることにより、セルの電源を切らないでください。
  19. 手動6％メタノールおよび94％の水を移動相の組成を変更します。 5分間実行します。
  20. 手動ですぐに0.7 ml /分の流速を低下させる、50％MeOHおよび50％の水に組成物を変更します。少なくとも20分間実行します。推奨される時間のためにこのステップを実行しないと、カラム、検出器に損傷を与える可能性があります。 、流れの電源を切りその後、脱気装置の電源をオフにdが。

標準の5準備

  1. 上記の手順4.1から4.3に概説されるように移動相バッファを準備します。これは、試料注入の後に異なる溶液の混合に起因するピークを避けるために、標準の製造のためのHPLC移動相を使用することが重要です。
  2. 使用前に超純水で5に、この解決策1を希釈し、最終的な解決策は、6％のメタノールを含んでいなければなりません。
  3. dGuoスタンダード
    NOTE：dGuoの検出に必要な高い酸化電位は、電気干渉化合物の測定のリスクを高めることができます。これは、例えば、検証260nmでdGuoのUV検出の標準曲線及びECの検出を使用して作成した標準曲線と比較することができます。両方がよく整列している場合（ 例えば 、 補足図1）は 、サンプルマトリクス効果が考慮されており、一つはむしろECの検出よりも、260nmのUVによってdGuo検出に進むことができます。
    1. 1.5ミリリットルマイクロチューブにdGuo 1.0mgのを測定します。 1.0ミリリットルHPLCグレードのメタノールを追加します。
    2. 高速でボルテックスdGuoが完全に溶解するまで。これは主要な株式です。数週間のために-20℃で保存します。
    3. 二dGuoストック（0.5 mm）を作成するには、HPLC移動相の857μlの一次dGuo株式の143μLを希釈します。使用するまで氷上で保存し、新鮮な毎日を準備します。
    4. 標準曲線を作成するために、さらに希釈液を作る（ 例えば 、 表2）。ストアソリューション氷上で、新鮮な毎日を準備します。実験試料と直列に基準を実行します。
    5. 実行する前に、最適な電圧を見つけるために、株式の最高濃度を用いて、検出器電圧を変化させます。
  4. 8-オキソdGuo標準
    1. 1.5ミリリットルマイクロチューブに8-オキソdGuo 1.0mgのを測定します。 0.1ミリリットルHPLCグレードのメタノールを追加します。高速の渦8-オキソdGuoが完全に溶解するまで。これは、8オキソdGuoの主要株式です。 SEVのため-20℃で保存ERAL週間。
    2. 別のチューブでは、一次株式およびHPLC移動相バッファ、渦の997.1μLの2.9μLを兼ね備えています。これは、二次株式（10,000 nm）で。
    3. 標準曲線（250 nM）をするための実用的なソリューションを作成するには、二次株式の24.4μlを、移動相緩衝液の975.6μLを兼ね備えています。
    4. 標準曲線を作成するために必要なソリューションを提供するためのさらなる希釈を行って（ 例えば 、 表3）。ストアソリューション氷上で、新鮮な毎日を準備します。実験試料と標準を実行します。
  5. 定量化
    1. （HPLC-コンピュータインタフェースの一部として、 補足図2A参照 ）、標準的なソフトウェアを使用して、8-オキソdGuoとdGuoの両方の曲線下面積を統合します。
    2. 、標準曲線の式を用いて標準曲線（曲線（ 補足図2B）の下の面積対各分析物の既知の濃度を構築し、8-ための比率を計算します各サンプルのオキソdGuo / dGuo。

6.アガロースゲル電気泳動

注：アガロースゲル電気泳動は、DNAの消化の完全性を検証するために行ってもよいです。

  1. 750ミリリットル超純水で242グラムトリス塩基（FW = 121.14）を溶解することにより、50×トリス - 酢酸-EDTA（TAE）バッファを準備します。 、そしてRTで1 L.店の最終体積に超純水を加え; 57.1ミリリットルを氷酢酸および0.5 100mlのM EDTAを加え（溶液のpHは、例えばで8.0に調整した場合EDTAが完全に溶解し、NaOHでpH8.0）に使用前に、このソリューションの50倍に希釈。
  2. アガロース1gを秤量し、100mlの1×TAE緩衝液中でそれを溶解し、1〜2分間電子レンジで加熱。アガロースを沸騰との接触を避けるために、ゴーグルと保護具を着用します。
  3. （：変異原注意）、アガロースゲル走行装置にそれを注ぐ約50℃まで溶液を冷却、5μlの臭化エチジウムを追加します。コー​​ムを挿入します。
  4. （;典型的には、DNAサンプルの10〜20μlのがロードされ、6X実行染料と混合して視覚化し、ロードを容易にするために、ボリュームが櫛サイズに依存）の溶液が固化するまで待って、ゲル上でTAE緩衝液を注ぎ、サンプルをロードします。
  5. 色素がゲル（150 Vで、例えば 、45分）の約2/3の長さを移行するまで、ゲルを実行します。 UV光下でDNAバンドを可視化します。

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結果

dGuoは8-オキソdGuoが約6.4分（ 図2AおよびB）の保持時間を有していたのに対し、4.7分の保持時間を有することが観察されました。 図2Cに見られるように、2つの分析物のピーク高さの約1000倍の差が存在します。 8-オキソdGuoとdGuoためボルタモグラムは8-オキソdGuoのための最適な作動電位が+ 0.5Vであることが決定された0.2から1.1 Vの範囲で作動電位で基準を実行することによって得られ、0.9ましたdGuoのためのV（ 図3）。これらの電位は、文献14,15に記載されている他のガラス状炭素電極と一致しています。検出および8-オキソdGuoとdGuo電気化学的検出のダイナミックレンジの限界は、それぞれ8,9、フェムトモルとナノモル範囲であることが報告されています。 dGuoと8-オキソdGuoのための標準曲線は、適切な濃度範囲にわたって線形検出を確実にするために、毎日実行し、適切な実行する必要があります楽器のンス（

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ディスカッション

8-オキソdGuoがDNA酸化の有用なバイオマーカーとして報告されているが、その信頼性の定量化は、チャレンジを提起することができます。いくつか公開された方法が存在するが、それらの研究室での方法を展開する研究者を可能にするプロトコルの包括的、説明的な概要が必要とされています。ここでは、8オキソdGuoの検出および定量化のための効果的な方法を確立するために新しいユーザーを可能にするHPLCベースのプロトコルの詳細な概要を提示します。

8-オキソdGuoの定量のために記載されている三つの主要な方法。これらには、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）は、本明細書に記載されるような9の他の場所に記載し、HPLC-EDの方法、クロマトグラフィー/質量分析（MS）法（ 例えば、液体の市販キット19を 、ベース含む。ELISA法は、干渉を受ける可能性が生物学的試料19中の特定の化合物と、一般に、結果がchromatogr用いて得られましたaphic技術は、ELISAに基づく方法20と比較し...

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開示事項

利益相反または競合する金銭的利益は宣言されていません。

謝辞

この研究は、カナダ保健省ゲノミクス研究開発イニシアティブ（GRDI）とバイオテクノロジーのためのカナダの規制戦略（CRSB）によって資金を供給されました。著者らは、利害の競合を持っていません。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
8-oxo-dGuo standardCayman Chemical Company89320不適切に「8-ヒドロキシ-2'-デオキシグアノシン」と呼ばれています。詳細についてはFig. 1およびテキストを参照してください。
アルカリホスファターゼSigma-AldrichP5931E. coli
Chelex 100Sigma-AldrichC7901キレート重金属
デスフェロキサミンメシル酸塩Sigma-AldrichD9533
dGuo 標準Sigma-AldrichD7145
二塩基性リン酸ナトリウムSigma-AldrichS9390
サケ精子由来DNASigma-AldrichD1626ナトリウム塩
DNase ISigma-AldrichD4527TypeII, ウシ膵臓由来
DNAzolInvitrogen10503-27
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物 (EDTA)Sigma-AldrichE4884溶液のpHを8.0に調整するまで、化合物は完全には溶解しません (例えば with NaOH)
F12-K 担体ATCC30-2004
ウシ胎児血清ATCC30-2020
ガードカラムクロマトグラフィースペシャリティYBA 99S03 0204GCコーラムを汚染から保護し、圧力上昇にもつながる可能性がある
塩化マグネシウムSigma-AldrichM8266
一塩基性リン酸ナトリウムSigma-AldrichS9638
Penicillin-StreptomycinInvitrogen15140-122
リン酸緩衝生理食塩水Invitrogen15190-250
ホスホジエステラーゼI酵素 Sigma-AldrichP3243Type II from Crotalus adamaneus venom
テフロンホモジナイザートーマス・サイエンティフィ7724T-1 または 7724T-5 それぞれ 1 mL または 5 mL容量 (保持能力) は、処理するサンプルの量によって異なります。
TrypsinInvitrogen15050-065
YMC-BASICカラム、球状シリカChromatographic SpecialtiesYBA 99S03 1546WT
ック 結合

参考文献

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