円筒試験の古典前肢非対称性解析を日常脳損傷や脳卒中後のラットにおける行動障害を評価するために使用されます。しかし、マウスでは、一貫した障害を検出することができません。この研究は、足·ドラッグ動作を定量化することは、マウスにおける脳損傷の、より敏感な分析であることを示しています。
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この記事について
サマリー
要約
シリンダテストを日常げっ歯類における前肢運動皮質に限局性虚血損傷を予測するために使用されます。シリンダー内に置かれたとき、げっ歯類は飼育や姿勢をサポートするためのそれらの前肢の足とシリンダーの壁に触れて探ります。前肢感覚運動皮質への虚血性損傷後、ラットは、前肢の非対称性と呼ばれ、その影響を受けた足と少ないタッチで得られた姿勢をサポートするために、その影響を受けない前肢の足に、より大きく依存しています。これとは対照的に、マウスの脳内の焦点虚血性損傷は前肢の非対称性において同等一貫した赤字をもたらすことができません。前肢非対称性の欠損が頻繁に観察されるが、マウスは「足 - ドラッグ」と呼ばれる新たな行動脳卒中後を実証ありません。足-ドラッグは4本足のスタンスに後方から取り外す際に直接壁からプッシュオフではなく、シリンダ壁に沿って、その影響を受けた足をドラッグするマウスのための傾向です。我々は以前に実証されていること足-ドラッグ動作が前肢の運動野に小さな皮質虚血性傷害に非常に敏感です。ここでは、足-ドラッグ分析のための詳細なプロトコルを提供します。私たちは、足ドラッグが何であるかを定義し、足-ドラッグ行動を定量化する方法を示します。シリンダテストは、管理するための簡単で安価なテストであり、事前にトレーニングや食品の剥奪戦略を必要としません。小さい焦点傷害を人気で増え続けると生成された2つのモデル - シリンダテストで足-ドラッグ分析を使用して、このような光血栓やエンドセリン-1（ET-1）誘発性虚血のような皮質の虚血性傷害を予測するためのニッチを埋めます中大脳動脈閉塞より。最後に、円筒試験で足-ドラッグの挙動を測定することは、以前の前肢非対称性分析は一貫性欠損を検出するために失敗したトランスジェニックマウス系統の広いコホートを用いて皮質損傷後の機能回復の研究を可能にします。
概要
神経再生戦略の目標は、組織修復及び機能回復の両方を実証することです。機能回復は、典型的には、特定の脳領域への損傷と関連している運動能力を含む、この場合、機能障害を測定する行動試験を用いて評価されます。外傷性脳損傷または皮質の感覚前肢領域の虚血性損傷は、行動試験の数で示すことができます。そのような試験は、シリンダテストは、前肢活性1における機能障害を評価するために、ラットに広く使用されています。テストでは、透明のトップを持つ唯一のシリンダー、カメラとテーブルを必要とする低セットアップ費用を持っています。それは、げっ歯類の自然探索行動に基づいているので、事前にトレーニングや食品剥奪や報酬が必要とされないように管理することは容易です。これらの多くの利点にもかかわらず、シリンダテストは、前肢のに焦点傷害後のマウスに前肢の赤字を評価するために、下に、利用されています我々は円筒試験におけるマウスの行動の分析に属性皮質を、ensorimotor。前肢非対称性は、シリンダテストの分析の古典的な尺度です。シリンダー内に置かれたとき、げっ歯類が自然に後肢に飼育し、姿勢のバランスのための彼らの前肢の足とシリンダー壁に触れることにより、シリンダの壁を探ります。各前肢と壁と足のタッチの数を容易にシリンダのこの探査中にげっ歯類を撮影することによって定量化されます。影響を受けた前肢の足は影響を受けない前肢の足よりも壁に少ないタッチを行い、反対側の感覚運動皮質への損傷の指標であるとき前肢非対称性が発生します。血管収縮剤のラット、内皮質注射では、エンドセリン（ET-1）は、前肢感覚運動皮質に反対前肢で行動障害をもたらす焦点虚血性病変を引き起こします。対側前肢使用の欠損を容易にFの変化として検出されますラット1-3の円筒試験に非対称性をorelimb。しかし、ラットは対照的に、前肢の非対称性の変化は、変数と同等のET-1注射4-6後のマウスではあまり一致しています。ここでは、シリンダテストで前肢の行動の新規解析を実証 - 足 - ドラッグ挙動の分析を。我々は以前その足-ドラッグ解析は、古典的な前肢非対称性分析より、マウスにおける前肢感覚運動皮質への損傷のより敏感な尺度であるため、焦点の皮質損傷モデルの様々に適用可能であることを示しています。
足-ドラッグ4 -前肢感覚運動皮質への虚血性損傷後どのように前足コンタクトシリンダー壁の検査は、マウスにおける新規の挙動を明らかにしました。マウスがシリンダ壁を探索し、その後方の足で立っているときに足ドラッグが発生し、その中線に向かって、または壁しばらくダウンシリンダ壁に沿って、その影響を受けた（コントラ病変）足をドラッグその影響を受けない前足は壁に対して姿勢をサポートしています。めったにので足ドラッグの外観は前肢感覚運動皮質4の損傷の正の指標である無傷のマウスでは発生しない足-ドラッグ。我々は以前前肢感覚運動皮質へのET-1の虚血性損傷後のマウスにおける足-ドラッグ挙動を定量化しており、脳卒中後4 2週間までマウスで持続足-ドラッグの挙動を示しました。ここでは、足、ドラッグ動作が脳卒中後4週間まで維持されることを示しています。足-ドラッグ挙動の分析は、マウスの前肢感覚運動皮質に焦点虚血性損傷を評価するための新規かつ敏感なツールを提供しています。その安価なセットアップ、管理のしやすさと、この急速にマウスで前肢行動欠陥を評価するための、シンプルでありながら便利なツールとなって得点。
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プロトコル
倫理文：全ての実験は、動物ケアのカナダの協議会のガイドラインに従ってニューファンドランドの動物ケア倫理委員会の記念大学によって承認されました。
1.マウス
- 成体マウスを使用。本研究では、2~4ヶ月の間に成人男性FVBNのマウス（n = 10）を使用しました。 12時12分時間の家のマウスは、明暗サイクルを逆転させ、標準的なげっ歯類固形飼料および水を自由に提供します。
シリンダーテストに必要2.材料
- 円筒試験をフィルムに透明なトップのテーブルを取得します。表の寸法は、上部がプレキシガラス又はガラスでなければならず、表の下のミラーを配置するのに十分なスペースがなければならない、無関係です。マウスを下からビデオテープに録画するためにこれが可能になります。シリンダーを介して画像を反映するように、テーブルの下に鏡を使用してください。利用可能な場合は別の方法として、逆さまカメラを使用しています。このプロトコルで使用される表の寸法は54のx 56のx 651のx 51センチメートルトップ（WXL）で6.5センチメートル（wxlxh）。
- ミラーを取得します。このプロトコルで使用されるミラーの寸法は34のx 58センチメートル（WXL）です。
- マウスがで実行するための透明/プレキシガラスのシリンダーを入手します。このプロトコルで使用されるシリンダーの寸法は高17.5センチメートル、8.8センチメートルID、0.35センチメートルの壁の厚さと9.5センチメートルODです。背の高い円筒は、より活性のマウス系統のために必要とされてもよいです。
- 卓上にシリンダーを置き、以下のミラーで反射を撮影。
- ビデオカメラと三脚が必要です。約気筒ビデオの5分ごとに190Mbさ約650Kb / sでの録音のビデオ、。カメラはシリンダが視野全体を包含することを確実にするためにズーム機能があることを確認してください。
注：このプロトコルで使用されるビデオカメラソニーDCR-SR42、40倍光学ズーム、標準的な定義を使用しています2,000xデジタルズーム、680kpix、NTSCインターレースビデオです）。 - 分析のためのソフトウェアを入手 - メディアのPLビデオのサポートと再生速度調節とアヤ。このプロトコルで使用されるメディアプレーヤーはVLCメディアプレーヤーv2.1.2です。
- メディアプレーヤーとモニタを実行できるオペレーティングシステムとコンピュータを入手します。
- 動画の電子記憶装置が必要とされます。外付けハードドライブに動画をダウンロードするか、長期保存のためのDVDにコピーします。
注：ビデオあたり190Mbで、84のセッションが16ギガバイトのSDカードに収まると168のセッションが32ギガバイトのSDカードにフィットします。によるSDメディアの比較的安価、およびいくつかのマウスは20後部を完了するために必要などのくらいの時間の不確実性には、32 GBのカードをお勧めします。現在の研究では、ビデオは2TB外付けハードドライブにカメラからコピーされたし、バックアップとしてDVDに再コピー。
シリンダー試験の3実験のセットアップ
- 卓上に45度の角度でテーブルの下に鏡を固定します。 supporにテーブル脚に取り付けられ、この使用して二つの支持ブラケットを行いますミラーの上下T、それぞれ。ブラケットの位置は、テーブルの側面図（ 図1A）と顔の表のビュー（ 図1B）に記載されています。
- テーブルの中央にシリンダーを置きます。シリンダは黒のマーカー（シャーピー）シリンダが持ち上げられ、同じ位置に戻すことができるように（ 図2）を使用してテーブルに座っている4等距離線を描画します。透明天板の下側にそれらを描画すると、卓上には、マーカーのインクを溶解することなく、動物試験の間に洗浄することができます。
- カメラと三脚を取り付けます。画像は、シリンダのバレルを介して直接見ているように、ミラーにカメラを目指しています。シリンダーの完全な内壁がベース（ 図3）により可視および障害物がないことを確認してください。 （ 図4A）の上からやから、カメラとミラーのセットアップの相対角度を含む、サイドオン設定のビューを参照してくださいマウスの飼育（ 図4B）を含むテーブルのレベル。
- 撮影の前に、各マウスを識別するために、キュー·カードを準備します。カードは、典型的には、各マウスの識別番号、テストの時点（ 例えば 、3日後）と、撮影セッションの日付が含まれていることを確認してください。実験者が盲目にされていることを確認するためにキューカード上の治療群を含めないでください。
- この光のレベルのような標準的な屋内照明条件のフィルムは、明らかに、シリンダ周りのマウスの動きを見るために必要とされます。
注：十分である赤色光カメラで暗所での撮影可能な場合は、しかし、一つは最初の足のタッチとの薬物が明確に定量化することも可能であるかどうかをテストする必要があります。
4.実行
- 撮影を開始します。カメラレンズの前に適切なマウスキューカードを表示します。
- すぐにキューカードを撮影した後に開いた上部からシリンダ内にマウスを下げます。
- マウスを撮影し始めます。びっくりした場合、マウスは探検に興味を失う可能性がありますように、この期間中のノイズを最小限に抑えます。
- シリンダーを探索するマウスの背面を確認します。マウスが20後部の最小値を実行するまでの映像をキャプチャします。
注：両方の前足が床との接触を失い、マウスが後ろ足で立っているときにリアが発生します。 - サニタイズとマウスの香りを除去するために、各マウスの間の適切な洗浄液で卓上とシリンダーを拭きます。
- マウスは探検停止し、静かに、約5分間、四つんばいになって座ったまま際に凍結があります。 20後部が発生する前にマウスがフリーズした場合は、試験を再開する前に10〜20分間シリンダーからそれらを削除する必要があるかもしれません。マウスは20後部を実行しない場合、それらは試験から除外されています。
注：我々の経験では、マウスが原因で、シリンダを探索する失敗に除外されるために必要なことがありません。
ポウ·ドラッグを使用してシリンダー試験の5評価解析
- マウスは、シリンダを探るどのように迅速に応じて0.25X間0.67x標準速度の速度でビデオを再生します。遅い再生速度を提供していますメディアプレーヤーを使用してください。
- 足タッチの総数を定量。ときにマウスの後部（ 図5A）足のタッチが発生し、その後、同時に足（ 図5C）およびランド（ 図5D）の両方でディスマウントし、シリンダ（ 図5B）の側面に触れます。足は、フル手のひらでシリンダー壁に接触してもしなくてもよいが、シリンダ壁といくつかの接触が発生しなければなりません。背面の間にその後肢の上に立っている間にマウスのいずれかまたは両方の前足とシリンダ壁との接触（どのように簡単に関係なく）を行う回数をカウントすることにより、足のタッチを評価します。
（注）マウスが後方位置にある場合、シリンダ壁との接触が唯一の "足タッチ」または「足ドラッグ」としてカウントされる - 立っ卓上のオフ両方の前足との後肢に。卓上に後肢と1前足の両方を、無料の足で壁に触れないように進む - - マウスは3点姿勢のままである場合、これは足のタッチとしてカウントされません。マウスは、リアすることができ、単一の前足とシリンダー壁に触れ、これは足のタッチとしてカウントされます。注：マウスはまた、以上の2つの接点を作り、後部の間にシリンダの周りにその体を移動させることができます。各左前肢タッチ用と各右前足touch用の1 - これらの接点は、集計されています。 - 足-の薬物の数を定量化します。ポウ·ドラッグ動作は、通常の足のタッチと区別されます。
- 足の接点全開手のひら（ 図6B）とシリンダー壁なら、それはゆっくりと、多くの場合、わずかな震えで、壁から離れて落下します。動きがのcompletを離れて落ちる前にシリンダー壁のいずれかに対して内側または下方向にドラッグする数字、（ 図6C）で始まりますエリー（ 図6D）。次にマウスを四つんばい（ 図6F）に着陸する前に、その影響を受けていない足（ 図6E）でマウントを解除します。これは、足ドラッグとみなされ、集計にカウントする必要があります。
- 足が完全に開いた手のひらとシリンダ壁に接触しない場合には、シリンダ壁から離れて落下する前に、その桁のシリンダー壁を放牧します。同様に、マウスは、シリンダ壁にその足をドラッグするが、取り外し前にそれを完全に解放しないことがあります。これらは両方の足、ドラッグ、ならびにタッチとみなされ、集計の両方としてカウントする必要があります。
- マウスは、シリンダを探るながら足もシリンダ壁に沿ってドラッグしてもよいです。それは（ 図7E）を取り外す前に、元の位置（ 図7A-D）の左または右を探るように、この場合には、足は、マウスの胴体のねじれに従います。それがランダムに選択マウスに依存するように、これは、足ドラッグを考慮されていません探索すると皮質半球が損傷されたに依存しない方向。
- 足-の薬物は、セッション中に足のタッチの総数あたりの足-ドラッグのパーセンテージとして表されています。個別に各前肢の総足のコンタクトの割合として足-の薬物の数を表現します。
- 足ドラッグをもたらすタッチが足ドラッグすると同時に、タッチとしてカウントされます。マウスが足の足に接触シリンダ壁毎回ドラッグ場合したがって、足、ドラッグ率を100％として表されます。
6.追加の実験計画の提案
- 余分な変数を最小化するには：
- 各試験日の同じ時刻にマウスをテストします。その覚醒サイクルの間にマウスをテストします。 12時間リバースライトサイクルでマウスを維持することは、パフォーマンスを容易にします。
- マウスは、いずれかのノイズや新しい環境によってストレスを受けた場合、シリンダを探索するには消極的であってもよいです。その動物保持室またはそれらがBを持っている部屋でテストしたマウスに慣れEENは、ストレスを軽減します。マウスは前シリンダに入るか、慣れのためにもまれている場合は部屋が、ノイズが多い場合に発生します。
注：試験は、ベースラインの読みとして機能するように、実験操作の前に一度だけ実行する必要があります。それは時間の短い期間にわたってシリンダにエクスポージャーの過剰な数を避けるためにお勧めしても操作の後、試験日は、実験者の裁量です。 - マウスは、シリンダに6-7暴露した後に後方に消極的になることがあります。現在の研究では、マウスは、虚血前および1日目、3、7、14、21、28、術後に、7回の合計シリンダーで試験しました。
注：本研究では、FVBNマウス系統を使用しました。我々は以前にET-1の虚血性損傷後のシリンダと観測された足、ドラッグ動作にC57BL / 6マウスをテストした（データは示さず）。 C57BL / 6マウスを飼育する際FVBNマウスよりも活性であり、頻繁にシリンダーの縁に飛び乗っアウト登る前に。マウスは、ジャンプして脱出しようとすると、背の高いシリンダーを使用する必要があります。
7.エンドセリン-1手術および梗塞体積測定
- 以前に公開されたプロトコル4によるエンドセリン-1手術および梗塞体積測定を行います。 （1.2背腹（DV） - （I）0.7 anteriorposterior（AP）/1.5内側 - 外側（ミリリットル）/：前部前肢運動野を対象とするために、各マウスは、以下の座標で3 ET-1注射を受けるべきですⅱ）0.4 AP / 1.25ミリリットル/ - 1.2 DVおよび（iii）+0.1 AP / 1.75ミリリットル/ -1.2 DV 4。
8.統計分析
- 分散の双方向反復測定分析（ANOVA）は、足-ドラッグ異なるタイムポイントで影響を受け、影響を受けていない足のための割合を分析することをお勧めします。
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結果
我々は以前、足、ドラッグ動作が前肢感覚運動皮質に焦点虚血性損傷後、損傷4の正の指標で表示されていることを実証しました。前肢の感覚運動皮質にET-1のイントラ皮質注射は、虚血性病変（ 図8A、B）を誘導するために使用されました。本研究では、足-ドラッグ動作がより長く14日間機能回復を評価するため、その潜在的な使用のために、損傷後を拡張するかどうかを調べました。マウスは、前手術前の時点でのET-1の注射、および1日目、3、7、14、21、28、損傷後日にシリンダー試験で試験しました。各時点で、足に触れると足の薬物の数は、両方の影響を受けると影響を受けていない足のために定量化しました。足のタッチの数に2つの方法で反復測定ANOVAは、有意な主時間の効果[F（6108）= 3.59、P = 0.0028]と被験者[F（18108）= 2.38、P = 0.0032]が、治療のない効果を明らかにしました（表1）。一方で、全足のタッチ対影響を受けた足のタッチを定量化シリンダテスト用の前肢の非対称性の標準的な分析を使用すると、一貫性のない前肢行動欠陥を明らかに...
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ディスカッション
円筒試験で足-ドラッグ挙動を定量化する際確立するための重要なポイントは次のとおりです。i）の数のベースラインを確立するために、脳損傷の前に各足の総足のタッチ対の足は、ドラッグ定量化。 ii）の虚血性損傷後の各足の総足のタッチ対足-の薬物の数を定量化します。およびiii）足ドラッグとマウスの胴体の左右回転時シリンダ壁に沿って足の横方向の動きとを区別。
足-ドラッグは前肢感覚運動皮質の損傷次のように表示され、新規の動作です。足 - ドラッグ動作の外観したがって前肢感覚皮質が損傷された正の指標として用いることができます。代表的な結果は、小ET-1梗塞約2〜4体積のミリ3と足-ドラッグ行動の前肢感覚運動皮質の結果に局在。これは、ASYM前肢とは対照的ですET-1の虚血性皮質傷害4-6以下の全体的なタッチに対する影響を受けた足のタッチのパーセントで一貫性の欠損を検出することができないメトリ分析。足-ドラッグ行動の分析は、したがって、前肢感覚運動皮質への損傷を検出する際に、より敏感です。足·ドラッグは、損傷後4週間まで維持されたのでさらに、それはまた...
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開示事項
著者らは、全く競合する金融利害関係はありません。
謝辞
私たちは、写真やビデオ撮影とその技術的専門知識と支援のためにジョン·クローウェル氏とテリーアプシャルに感謝します。この作品は、ヘルスリサーチおよびニューファンドランドの研究開発株式会社および脳卒中の回復の触媒付与のためのカナダのカナダのパートナーシップのハート＆ストローク財団のカナダの研究所からJLVに動作する補助金によってサポートされていました。 RBRはキース·グリフィスメモリアルハート＆ストローク財団大学院奨学金の受取人でした。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| プレキシガラスシリンダー | 高さ17.5 cm、外径9.5 cm、内径8.8 cm、壁の厚さ0.35 cm(または3.5 mm) | ||
| ビューイングテーブル | 54x56x66.5 cm(幅x長さx高さ)、テーブルの上部はプレキシガラスの51x51 cmのシートです。 | ||
| 34x58 cm ミラー | |||
| ビデオ カメラ | Sony | DCR-SR42 | オンボード ストレージ、SD 機能、40 倍光学ズーム |
| コンピューター | Dell | Optiplex 760 | プロセッサ: Intel、3.0 GHz、メモリ 4.00GB (RAM) |
| コンピュータモニタ | Samsung | S22C350H | |
| Excel (Microsoft Office Professional Plus) | Microsoft | v14.0.7106.5003 | |
| VLC メディアプレーヤー | ビデオ LAN | v2.1.2 | 再生速度変調とビデオサポート付きメディアプレーヤー |
| 外付けハードドライブ | Western Digital | WDBAAU0020HBK-01 | 2 TB |
参考文献
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