骨馴化培地：調製およびバイオアッセイ

Summary

我々は、骨馴化培地（BCM）を調製し、インビトロでその活性をテストする方法をここで説明します。

Abstract

自家骨移植が広く口腔外科、整形外科、および外傷学で使用されています。自家骨移植が唯一欠けている骨を交換しないで、彼らはまた、骨再生の複雑なプロセスをサポートしています。骨伝導、骨形成、および骨誘導性：自家移植のこの有利な動作は、次の3つの特性に起因します。しかし、他の態様が存在する：骨は、骨再生に関与する間葉細胞を標的とすることができる成長因子、を含む分子、無数の移植片を解放します。骨移植片のパラクリン特性は、骨馴化培地（BCM）を使用してインビトロで研究することができます。ここでは、熱処理または脱塩を受けたネイティブ豚の皮質骨から骨馴化培地を調製する方法に関するプロトコル、および骨を提示します。細胞は、直接BCMにさらされたり、コラーゲン膜、以前BCMに浸したような生体材料上に播種することができます。我々は、in vitroで bioassaの例を与えますTGF-β調節遺伝子の発現に、間葉系細胞とYS。提示されたプロトコルは、さらに、骨再生の際に骨移植片のパラクリン効果を明らかにし、再建手術の幅広い分野でトランスレーショナルリサーチのためのパスを開くことが奨励すべきです。

Introduction

自家骨は広く奇形、resective手術、再建外傷外科手術、および配置^1,2を注入する前の結果として発生した欠陥を埋めるために使用されます。骨移植片は、移植片の統合のプロセスをサポートする方法の生物学的な原理を理解することは自家移植が再建手術におけるゴールドスタンダードであると考えられている理由を理解するための唯一のキーではない、それはまた、代用骨³の改良されたデザインにバイオニックです。それでも、移植片の統合は、より高速な自家骨と骨置換^4,5に比べてです。これにより、骨再生をサポートするので、効果的な自家骨を作る分子および細胞のメカニズムを明らかにすることが不可欠です。

統合プロセス^6,7を支持すると考えられる自家移植片の三教科書特性があります。まず、自家骨が成長するために、新たに形成された骨のためのガイダンスを提供し、骨伝導性であり、欠陥へ。第二に、自家骨は、骨芽細胞に分化することができる⁸間葉細胞を含むことを意味し、骨形成性です。第三に、自家骨は、マトリクス状に埋葬骨形成タンパク質のような成長因子は、軟骨内、あるいは膜内骨形成⁹のプロセスを開始することができるように骨誘導性です。別の側面があります：新たに調製した骨片は「骨馴化培地^」10〜15 を用いたin vitroの観察に基づいて....

Protocol

1. BCMの準備

1. できるだけ新鮮な地元の肉屋から豚の下顎を取得します。しっかりと表面に下顎を置き、骨に接続されているすべての軟組織や骨膜を残さない特別な注意を払って全厚フラップをリリース。流フードの下で働くために必要とすることなく、クリーンな環境で動作します。
2. 全層フラップが解放されると、頬側から骨片を採取するために、骨のスクレーパーを使用しています。骨スクレーパーがシャープにする必要がありますのでご注意ください。しっかりと骨のスクレーパーを処理し、長い運動が骨を収集しています。小さいその1ミリメートルの骨チップを捨てます。
   1. ネイティブの骨チップを維持するために、1％抗生物質およびそれらを乾燥させない抗真菌剤を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で直径10cmのプラスチック皿に直接骨チップを配置します。
   2. 熱処理の影響を評価するために、被験者の骨チップは、80℃で30分間低温殺菌するか、または121℃で20分間オ​​ートクレーブ。
   3. 脱塩の影響を評価するために、4℃で4~6時間、1MのHCLに骨チップを振るし、pHが中性になるまで培養液で繰り返し洗浄します。
3. 10ミリリットルあたりの骨チップ5gの新しいプラスチック皿に1％の抗生物質および抗真菌剤を補充した新鮮なDMEMの合計を配置します。
4. 24時間、37℃の加湿雰囲気中で、プラスチック皿を置きます。そして、収穫BCM。遠心分....

Results

骨馴化培地を、新鮮なブタの骨片から製造されます。 BCMを準備し、BCMと組み合わせて生体材料を使用するプロセスの概要をそれぞれ図1および図2に示されています。 BCMの準備中に、最終的なBCMの品質に影響を与えることができ、短い運動または非常に小さな骨チップ限り動きに大きな骨チップを得ることが重要です。 ADM、PTX3、IL11、IL33、PRG4のNox4と（ 図3）：BCMの品質BCM標的遺伝子の遺伝子発現を解析することによって制御することができます。 ADMとPTX3は0.4倍にまでダウンレギュレートされ、200倍にアップレギュレートさIL11、IL33、Nox4はとPRG4をすることができます。経口線維芽細胞を示すレベルでBCM標的遺伝子を発現しない場合は、4のディスプレイを図口腔線維芽細胞におけるBCMの標的遺伝子の発現の典型的な結果は、コラーゲンバリア膜上に播種された細胞の健康状態を確認するか、新しい下顎から新しいBCMを準備。低温殺菌骨チップからの馴化.......

Discussion

骨馴化培地は、骨再生の初期段階の間に骨移植片の解放の活動を反映しています。ここで説明するプロトコルは、骨再生に関与する細胞の異なるタイプの応答を研究するために適合させることができます。さらに、プロトコルは、処理骨または骨充填剤からの馴化培地を調製するために用いることができます。様々な天然および処理骨から放出因子：方法は実行し、シンプルなコンセプトに依拠するのは簡単です。 BCMは、間葉系細胞にどのように影響するかを理解することは、移植片の統合と骨自家移植片の特性についての詳細を学ぶのを助けることができます。この考え方に基づき、我々は、3つの主要な系統への間葉系細胞の遺伝子発現にだけでなく、増殖、移動、および分化の^11,15ネイティブおよび処理骨^14,20から得られたBCMの影響に関する知識を蓄積してきました。骨芽細胞、脂肪細胞および軟骨細胞^11。 BCMはまた、TAの能力を調べました破骨細胞形成¹³の変調に関しては、例えば、造血細胞を目標確認。多くの潜在的な標的細胞がin vitroで BCMに応答するために待っている、ここで紹介す.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
豚の下顎骨ローカル	ブッチャー
ボーンスクレー	パーHu-Friedy PPBUSE2	/ 36
抗生物質&Antimicotics	All life Technologies	15240-062
コラーゲン膜(バイオガイド)	Geistlich
Fetal Calf Serum	Invitrogen Corporation	16030074
DMEM	Invitrogen Corporation	21885-025
High Pure RNA Isolation Kit	Roche	11828665001
Transcriptor FirstストランドcDNA合成キット	ロシュ	4379012001
プライマー	マイクロシンセ
SYBR グリーン (Q-RT-PCR用)	ロシュ	4673484001
PBS	ロシュ	11666789001