マウス腸神経系の開発を可視化するために免疫染色

Summary

腸神経系は、腸内で増殖し、移動し、コロニーを形成する神経堤細胞によって形成されます。神経堤細胞は、神経伝達物質の表現型に特異的なマーカーを持つニューロンに分化します。このプロトコルは、腸神経系の神経伝達物質の発現を視覚化するために、マウス胚性胃腸管の解剖、固定、免疫染色を行う技術について説明しています。

Abstract

腸神経系は、腸内で増殖し、移動し、コロニーを形成する神経堤細胞によって形成されます。コロニー形成後、神経堤細胞は、神経伝達物質の表現型に特異的なマーカーを持つニューロンに分化する必要があります。腸管神経系の主要な神経伝達物質表現型であるコリン作動性ニューロンは、アセチルコリンの合成酵素であるコリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)を染色することで同定されます。コリン作動性ニューロンを可視化する歴史的な取り組みは、中枢神経系と末梢神経系のChATに対して異なる特異性を持つ抗体によって妨げられてきました。私たちらは、中枢ChATと末梢ChATの両方を認識する胎盤ChATに対する抗体を用いて、胚性腸内コリン作動性ニューロンの可視化に成功し、この限界を克服しました。さらに、この抗体をChATの遺伝子レポーターと比較し、この抗体が胚発生時により信頼性が高いことを示しました。このプロトコルは、腸神経系の神経伝達物質の発現を視覚化するために、マウス胚性胃腸管の解剖、固定、免疫染色を行う技術について説明しています。

Introduction

運動、栄養吸収、およびローカルの血流を制御する機能腸管神経系（ENS）は、生命¹に不可欠です。 ENSは、それらはニューロンおよびグリア細胞を含む神経節に分化腸を移動し、コロニー形成、増殖、神経堤細胞（NCC）によって形成されます。ヒルシュスプルング病（HSCR、男性でのオンラインメンデル遺伝）、1 4,000で出生の発生率とmultigeneic先天性障害は、破壊されたENSの形成を研究するためのプロトタイプの病気と考えることができます。 HSCRでは、NCCはに移動し、遠位後腸²の変数の長さを植民地化することができません。また、他の一般的な胃腸（GI）は、肛門直腸奇形、腸atresias、および運動障害などの小児集団における発達障害は、基本的なENS機能の障害と関連しており、おそらく微妙な、過小評価、解剖学的変化とで機能的変化と関連していますENS ^3-6。そのため、私たちはENS形成の発達決定要因を理解することを可能にする技術は、病因および小児消化管障害の治療の可能性に光を当てることができます。

移行と植民地化の後、NCCは、それらの神経伝達物質の表現型に特異的なマーカーでニューロンに分化します。コリン作動性ニューロンは、腸溶性ニューロン⁷の約60％を含み、かつコリンアセチルトランスフェラーゼ（チャット）、興奮性神経伝達物質アセチルコリンのための合成酵素を染色することによって検出することができます。歴史的には、コリン作動性ニューロンを可視化する試みは、中枢神経系に対して向けられた抗体の抗原特異性（CNS）は、末梢神経系（PNS）のChAT ^8-10に対してチャット異なるによって混乱しました。しかし、胎盤のChATに対する抗体は、両方の中央と周辺のChAT ^11-13を認識し、我々は最近、visuaを可能にする技術が記載されています高感度のENSのコリン作動性ニューロンのlization以前の開発でチャットレポーター線¹⁴で達成されたよりも。

ここでは、ニューロンにおけるENSの神経伝達物質の発現を可視化するマウス胚GI管の、固定および免疫染色を解剖するための手法を提示します。これらの研究のために、我々は、 チャット-Creマウスを利用しているR26Rと交配：floxSTOP：チャットのCreを生成するためにtdTomato動物を、R26R：floxSTOP：tdTomatoマウス （原稿全体のChAT-CreをtdTomatoと定義されます）。これらの動物は、その後のChAT発現^14を検出する蛍光レポーターの両方を発現するマウスを得るために、ホモ接合のChAT-GFPレポーターマウスと交配させました。これら二つのレポーター動物は、C57BL / 6Jバックグラウンド上にあり、（ジャクソン·ラボラトリーズ、バーハーバー、ME）は、市販されています。

Protocol

ウィスコンシン大学の動物実験委員会は、すべての手順を承認しました。

ソリューションの調製

1. 解剖緩衝液およびリンス液として1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を使用します。
2. ボトルにスクロースおよび場所の30グラムを計量することにより、30％スクロースを準備します。 1×PBS 99 mlを加え、1mlの10％アジ化ナトリウムを追加します。ショ糖の全てが溶解するまで十分に混合します。 4℃で保存、必要になるまで。
3. 1×PBS、3％ウシ血清アルブミン（BSA）および0.1％トリトンX-100を混合して溶液を遮断準備。完全に混合し、必要になるまで冷蔵庫で保管してください。
4. 1×PBS中にPFAの適切な量を秤量することによって1×PBS中の8％パラホルムアルデヒド（PFA）溶液を調製し、それが完全に溶解するまで65℃でインキュベートします。 -20℃の冷凍庫で25ミリリットルの分量を保存が必要になるまで。使用日の1×PBS中の4％PFAに希釈します。

2.胚とガット解剖イオン

1. 制度動物実験委員会によると、タイミング妊娠マウスを安楽死させるし、PBS 1X氷冷を含む60ミリメートルペトリ皿に子宮を転送プロトコルを承認しました。
2. 鋭いハサミを使用して、解剖顕微鏡下で、胚を露出させるオープン子宮壁をカット。子宮から胚を除去し、PBS 1X氷冷を含むクリーンな60ミリメートルペトリ皿に置きます。
3. 氷冷1×PBS中で断頭により各胚を安楽死させます。あなたは、蛍光タンパク質を含むトランスジェニックマウスを使用している場合は、蛍光照明の下で、正のトランスジェニック胚を識別します。
4. 解剖顕微鏡を使用して、各胚から胃腸管を解剖。微細鉗子の使用、左側が上向きにされ、右側には、ペトリ皿の底に反するような胚を方向付けます。内臓を露出させるために胚から上半身の壁を削除します。背側体壁と内臓の間に微細な鉗子を挿入します。クロム胚から内臓を除去するために、はさみ状の切断動作で互いに対して鉗子をOSS。
5. さらに離れて周囲の器官から胃腸管をサブ解剖した後、氷冷1×PBSを含む1.5 mlマイクロチューブに各GI管を配置します。

GI地帯の3固定

1. 氷冷1×PBSで各GI管を3回すすぎ、次いで4％PFAと交換してください。 1.5時間室温でロッキングプラットフォーム上で1.5mlの微小管における消化管を修正しました。 RTで消化管を5分間3回すすぎ、その後、ロッキングプラットフォーム上で1時間。この段階で、必要になるまで、0.1％アジ化ナトリウムを含有する1×PBS中30％スクロースに4℃でGIトラクトを格納します。
   注：別の方法として、組織の完全性に影響することなく、1年まで、30％スクロース中の胚を格納します。 30％スクロース中のサンプルの保管は、免疫染色のために、またはクライオsectioniのため10月にいずれかのサンプルの後の処理を可能にしますNG。あるいは、以下に詳述免疫染色プロトコルを進めます。

4.免疫染色プロトコル

1. サンプルは30％スクロース中で保存されている場合は、ロッキングプラットフォーム上で、それらを1×PBSで20分間3回洗浄します。
2. RTで1時間のためのロッキングプラットフォーム上でブロッキング溶液中に消化管を配置します。
3. ブロッキング溶液を除去し、ロッキングプラットフォーム上で4℃でRTまたはO / Nで4時間のいずれかのためのブロッキング溶液中で希釈した一次抗体の適切な量の消化管をインキュベートします。 （患者から得られた血清）ヒト抗胡抗体1000希釈、1：ニワトリ抗緑色蛍光タンパク質（GFP）抗体1000希釈および1：ヤギ抗ChATの抗体の100倍希釈1を使用してください。
   注：私たちは、患者から局所的に得られたヒト抗胡抗体を利用したが、抗胡抗体は、例えば、市販されており、マウス抗胡、（1での使用：500希釈）。
4. 1×PBS中の消化管をすすぎます3回5分間、その後、ロッキングプラットフォーム上で室温で1時間。
5. 4℃でのRTまたはO / Nで4時間のいずれかのためのロッキングプラットフォーム上のブロッキング溶液中で1：500に希釈した二次抗体を用いて1×PBSを交換してください。このようなDylight、ロバ抗ニワトリCy2とし、ロバ抗ヤギCy5のようなロバ抗ヒトアミン反応性染料を使用してください。ロバ抗マウスアミン反応性染料405：500希釈のマウス抗胡抗体を用いた場合は、1を使用します。
   注：内因性GFPとtdTomato発現および発達年齢とともに増加して免疫染色を明確にする強さ。我々は、一般的に使用される抗体の量を低減し、また、組織の効率的な染色を確実にするために、染色溶液の150μlを、0.2 mlチューブ中に個別に胚勇気を免疫染色します。
6. 1×PBS中の消化管に5分間、3回洗浄し、その後、ロッキングプラットフォーム上で室温で1時間。
7. スライドガラス上にDAPIで蛍光封入剤を数滴を置きます。 GI TRAを浸します蛍光マウンティング培地中にCTと組織の上に直接カバーガラスを追加します。媒体-Gを取り付ける蛍光は半永久的なシールを提供する水溶性の化合物です。
   注：このようなベクタシールドなどを使用し、蛍光封入フェージングおよび抗体の光退色防止媒体を装着するベースグリセロールです。これらの製品はいずれも、組織は4℃で長期間保存することを可能にします。
8. 共焦点顕微鏡を用いて蛍光体のそれぞれの画像をキャプチャします。 表3に示す蛍光団および使用するフィルタの励起波長を使用してください。
9. 画像をキャプチャするために使用される共焦点の種類に応じて、適切なソフトウェアを使用して、コンピュータ支援画像解析を実行します。

Results

我々は以前のChAT発現^14を検出GFPおよびtdTomato蛍光レポーターの両方を発現するマウスの生成を記載しています。簡単に説明すると、 チャットCreマウスは、R26Rと交配させた：floxSTOP：チャットのCreを生成するためにtdTomato動物; R26R：floxSTOP：（チャット-CreをtdTomatoと呼ばれる）tdTomatoマウスを。これらの動物は、その後、ホモ接合のChAT-GFPレポーターマウスと交配させました。胚を単離し、組織が ​​固定される前に切開し、 表1に記載の抗体を用いて、上記のように免疫染色した。遠位小腸（SI）および近位結腸E11、E13.5およびE16.5で解析しました。

E11では、胡陽性ニューロンは、遠位SI内に存在しているが、NCCはまだ近位結腸（ 図1）に達していません。この時...

Discussion

私たちの研究室等はHSCR腸内の欠陥があっても神経節の小腸^5,15,16に、無神経節結腸に限らず、近位に延長されていないことを示しています。これらの変化はENS神経密度と神経伝達物質表現型の変化を含み、HSCRを有する患者において観察された運動障害を説明することができます。私たちは、ENS形成の決定要因を理解するための努力で上記の技術を利用しています。具体的には、これらの技術は、神経型一酸化窒素合成酵素（のnNOS）ニューロン、血管作動性腸管ポリペプチドニューロン（VIP）、ならびにコリンアセチルトランスフェラーゼ（ChATの）ニューロン（ 表^{2）5 を}可視化するために使用されてきました。この技術の重要な利点は、免疫染色のために、または埋め込み、凍結切片のいずれかのために、後の処理のために、30％スクロース中のサンプルを保存する機能です。

腸のNCCの定着が進ん波面fとして発生しますE14.5にロムE9.5。ニューロンを識別するフー、免疫染色では、上述したように、コンピュータ支援画像...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
リン酸緩衝生理食塩水	オキソイド	BR0014G
ショ	糖 フィッシャー	S2
アジ化ナトリウム	フィッシャー	BP9221
ウシ血清アルブミン	フィッシャー	BP1605
トリトン X-100	シグマ	X100
パラホルムアルデヒド	グ	マ
60 mmペトリ皿	フィッシャー	FB0875713A
蛍光顕微鏡	ニコン	SMZ-18 立体視鏡
解剖顕微鏡	ニコン	SMZ-18 立体鏡
ファイン フォーセプス	ファイン サイエンス ツール	11252-20
1.5 ml エッペンドルフ チューブ	VWR	20170-038
フルオロマウント-G	サザンバイオテック、アラバマ州バーミンガム	0100-01
スライドガラス	フィッシャー	12-550-15
カバーガラス	VWR	16004-330
共焦点顕微鏡	ニコン	ニコン A1
ニコンエレメント	ニコン