細胞外小胞の単​​離および特徴のための紙ベースのデバイス

Summary

このプロトコルは、わずか10μlの血清サンプルから、細胞外ベシクル（電気自動車）、細胞から放出された小さな膜状粒子を単離する方法を詳しく説明します。このアプローチは、超遠心分離の必要性を回避するアッセイ時間の数分しか必要とし、限られた容積のサンプルからのEVの単離を可能にする。

Abstract

細胞外ベシクル（電気自動車）、細胞の様々なタイプから放出された膜状の粒子は、臨床応用のための大きな可能性を保持する。これらは、核酸およびタンパク質貨物を含む、ますます真核生物および原核生物細胞の両方によって利用される細胞間コミュニケーションの手段として認識されている。しかしながら、それらのサイズが小さいため、電気自動車の単離のための現在のプロトコルは、多くの場合、時間がかかり、面倒であり、そのような超遠心分離機のような大量の試料で高価な装置を必要とする。これらの制限に対処するために、我々は、簡単で効率的であり、そして10μlの程度の低いサンプルボリュームを必要とする電気自動車のサブグループを分離するための紙ベースの免疫親和性プラットフォームを開発した。生物学的サンプルは、化学的に特定EV表面マーカーに対して高い親和性を有する捕捉分子で変性された紙テストゾーン上に直接ピペッティングすることができる。我々は、走査電子顕微鏡（SEM）を用いてアッセイを確認、紙ベースの酵素結合immunosorbenトンアッセイ（P-ELISA）、およびトランスクリプトーム解析。これらの紙ベースのデバイスは、健康および疾患におけるEV機能の私達の理解を進める支援する診療所での電気自動車の研究と研究の設定を有効にします。

Introduction

細胞外小胞(EV)は、40 nmから5,000 nmのサイズを持つ不均一な膜状粒子であり、異なる生合成経路^1-9を介して多くの細胞タイプによって活発に放出されます。それらには、親細胞由来のDNA、RNA、タンパク質、および表面マーカーのユニークで選択されたサブセットが含まれています。細胞間コミュニケーション¹⁰、免疫調節¹¹、血管新生¹²、転移¹²、化学療法抵抗^性13、眼疾患の発症9など、さまざまな細胞プロセスへの関与がますます認識され、診断、予後、治療、および基礎生物学の応用におけるそれらの有用性に大きな関心が寄せられています。

EVは、生合成または細胞起源に基づいて、古典的にエクソソーム、微小胞、アポトーシス体、オンコソーム、エクトソーム、微粒子、テレロソーム、プロスタトソーム、カルジオソーム、およびベキソソームなどに分類できます。例えば、エクソソームは多胞体で形成されますが、微小胞は原形質膜から直接出芽して生成され、アポトーシス小胞はアポトーシス細胞または壊死細胞から生成されます。しかし、この命名法は、EVの徹底的な理解と特性評価が不足していることもあり、まだ洗練されていません。EVを精製するためには、超遠心分離¹⁴、限外ろ過¹⁵、磁気ビーズ¹⁶、高分子沈殿^17-19、マイクロ流体技術^20-22など、いくつかの方法が開発されている。EVを精製する最も一般的な手順には、大きな破片やその他の細胞汚染物質を除去するための一連の遠心分離および/またはろ過が含まれ、その後、最終的な高速超遠心分離が行われますが、これは高価で退屈で、非特異的なプロセスです^14,23,24。残念ながら、十分な純度と効率でEVを迅速かつ信頼性の高い分離するという技術的ニーズはまだ満たされていません。

私たちは、EVのサブグループを分離し、特徴付けるためのシンプルで時間とコストを節約しながらも効率的な方法を提供する紙ベースの免疫親和性デバイスを開発しました²²。決められた形状にカットされたセルロースペーパーは、スルーホールが登録された2枚のプラスチックシートを使用して配置およびラミネートできます。疎水性ワックスまたは^{ポリマー25〜27}を印刷することによって紙ベースのデバイスにおける流体境界を定義する一般的な戦略とは対照的に、これらのラミネート紙パターンは、エタノールを含む多くの有機液体に対して耐性がある。ペーパーテストゾーンは、EVサブグループ上の特定の表面マーカーに対して高い親和性を持つ捕捉分子(標的特異的抗体など)を安定して高密度にカバーするように化学的に修飾されています。生物学的サンプルは紙製のテストゾーンに直接ピペットで移動でき、精製されたEVはすすぎステップ後も保持されます。単離されたEVの特性評価は、SEM、ELISA、およびトランスクリプトーム分析によって実行できます。

Protocol

操作手順の概略図を図1に提供されている。倫理的な慣行を使用して、我々は、（健康な被験者から血液サンプルを採取し、IRBのプロトコルを承認し、台湾の下台退役軍人総合病院（TCVGH）、台中を通して患者からの房水のサンプルを得IRB TCVGH号CF11213-1）。

ペーパーデバイスの1の作製

1. 96ウェルマイクロタイタープレートと同じレイアウトを提供するために、直径5mmの円形にクロマトグラフィー紙を切る。登録された貫通孔、及び、積層体二つのポリスチレンシートをこれらの紙片を挟む。
2. 以下に記載の化学コンジュゲーション法を用いて紙のデバイスを変更する^{28ステップ} 。
   1. プラズマチャンバ内で酸素プラズマ（100ミリワット、1％の酸素、30秒）で紙装置を扱う。
      注意：3-メルカプトプロピルトリメトキシシランとN-γ-マレイミドスクシンイミドで作業する場合には、特別な注意が取られなければならないエステル（GMBS）、彼らは両方の水分が敏感と有毒であるため。保護手袋を着用し、吸入または皮膚や眼との接触を避ける。密閉株式ボトルを維持し、それが水の凝縮を避けるために開く前に室温に平衡することができます。また、窒素充填グローブバッグまたはボックス内の株式ボトルを開きます。株式ボトルの頻繁な開口部を避けるために小さなバイアル中にアリコート。
   2. 直ちに30分間、エタノール中の3-メルカプトプロピルトリメトキシシランの4％（v / v）の溶液（200プルーフ）で処理された紙デバイスをインキュベートする。
   3. エタノールで紙のデバイスをすすぎ、15分間、エタノール中で0.01マイクロモル/ mlのGMBSでそれらを培養する。
   4. エタノール（200プルーフ）でリンスし、そして4℃で1時間、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中10μg/ mlのアビジン溶液で紙デバイスをインキュベートする。 4℃で保存する必要に応じて、4週間以内に使用します。
3. 10μlのPBS 1％を含む（w / v）のウシ血清アルブミン（BSAを用いたウェット各紙テストゾーン）3×10分間、3×10分間10μlのビオチン化捕捉分子をスポッティングする前に。 （（）w / vの1％を含有するPBS中に20μg/ mlのBSAおよび0.09％（w / v）のアジ化ナトリウム）、抗CD63抗体を使用するとして、またはアネキシンV（アネキシンV結合緩衝液で1:20、v / v）の捕捉分子。
4. それぞれ、3×1分間の緩衝液を結合BSAまたはアネキシンV（w / v）の1％を含むPBSを対応する10μlのを使用して、未結合抗CD63抗体またはアネキシンV分子を洗い流してください。

2.血清房水サンプル収集と処理

1. 血清コレクション。
   1. 血清分離チューブに静脈穿刺により末梢血の10ミリリットルを収集し、静かにチューブを5回転倒。垂直位置にチューブをセットし、30分間待ちます。
   2. 15分間1200×gで遠心分離する。 30分間3000×gで再びきれいなチューブに最上層から血清を移し、遠心分離機。
   3. 0.8μmのFILを通じて上清を渡すTER。使用するまで-80℃でサンプルを保管してください。
2. 房水コレクション：使用するまで-80℃で直接侵襲的手技や店舗のサンプルを通じて眼科医によって診断された患者からの房水のサンプルを収集。

細胞外ベシクルの3.絶縁

1. 5μL/分の速度でそれぞれ紙テストゾーンの上にスポットサンプル。
2. 10μlをそれぞれ、抗CD63抗体またはアネキシンVの分子で官能紙装置3×1分間、緩衝液を結合BSAまたはアネキシンV（w / v）の1％含有PBSを、対応して結合していない電気自動車を洗い流す。次の下流のアッセイを行う。

4.ダウンストリームアッセイ例1：スキャンElectromicrographs

1. 10分間10μlの0.5×カルノフスキーの固定液を使用して官能基化紙テストゾーン上に捕獲EVのを修正。
2. 2×5分間の十分なPBSでサンプルを洗浄します。
3. 脱水する10分間続く35％エタノール、2×10分間、2×10分間、2×10分間、95％エタノール、および4×10分間、100％エタノール、70％エタノール、50％エタノールで試料。
4. ドライ臨界コートをパラジウム/金を有するサンプルをスパッタし、低電子加速電圧（〜5kVの）で操作を走査型電子顕微鏡を用いて調べる。

5.ダウンストリームアッセイ実施例2：紙ベースのELISA

1. 捕獲電気自動車を含む各試験ゾーンにPBSで千希釈：1の抗CD9一次抗体を含む5μlの溶液を加える。 1分待ってください。
2. 30秒間100 rpmで振とう30ミリリットルPBSでサンプルを洗浄します。
3. 西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）を含む5μlの溶液を1で二次抗体を結合型追加：PBS中千希釈し、1分待ちます。
4. 30秒間100 rpmで振とう30ミリリットルPBSでサンプルを洗浄します。
5. 過酸化水素ANの1の体積比：1を含む5μlの発色基質を追加します。dは3,3 '、5,5'-テトラメチルベンジジン（TMB）およびデスクトップスキャナを使用してスキャン。

6.ダウンストリームアッセイ例3：RNAの単離

1. 捕獲電気自動車を溶解するために結合バッファー/ポリビニルピロリドンベースのRNA単離援助35μlのと溶解の265μlのサンプルを浸し。ボルテックス精力的に。
2. 溶解液に分離キットで提供30μlのホモジネートを追加します。激しく混和し、10分間氷上に置いた。
3. 次の手順で説明する酸フェノール - クロロホルム分離を用いてRNAを抽出します。
   1. ボトルの底層からのフェノール - クロロホルム330μLを取り、ホモジネート/溶解液に加える。ボルテックス精力的に。
   2. 5分間万×gで遠心分離する。きれいなチューブに水（上）相を移し、削除音量に注意してください。
4. 前のステップと共同で除去水相の1.25倍の体積である体積の100％エタノールでトータルRNAを沈殿させ95℃に予熱した溶出液中のRNA llect。
5. 濃縮し、さらに、製造業者のプロトコルに従ってRNAクリーンアップキットを用いてRNAを精製する。

Results

EVのサブグループを単離するための紙装置の能力を効率的にEV表面マーカーの高感度かつ特異的な認識に依存する。捕捉分子と紙繊維の安定した修飾は、他の場所^28-30に記載のように、アビジン-ビオチン化学を使用することによって達成される。化学結合および物理吸着法の有効性は、蛍光ベースの読み取り値を使用して評価される。紙試験ゾーンは、捕捉分子は、ステップ1.3で20μg/ mlの蛍光体R-フィコエリトリン結合ビオチン分子（PEビオチン）で置換されている以外は）プロトコル手順1に従って製造される。紙試験ゾーンは、その後、未結合のPEビオチン分子を除去するためにPBSですすぐ。対照的に、1％を含有するPBS中で、10μlの20μg/ mlのPEビオチン（w / v）のBSAおよび0.09％（w / v）のアジ化ナトリウムを直接PBS、続いて3×10分間、紙テストゾーン、上にスポットPEビオチン色素分子の物理吸着を行うためのリンス。化学的に物理吸着と変更された未処理の紙デバイス（「紙」）と一緒に紙デバイス（「紙+架橋剤+染料」）、PE-ビオチン分子（「紙+架橋剤」）の適用せずに、同じプロトコルで修飾された紙装置や紙デバイスPE...

Discussion

細胞外ベシクルのサブグループの成功を単離するための最も重要な手順は次のとおりです。紙の1）良い選択。紙の繊維の表面上の捕捉分子の2）安定した高いカバレッジ; 3）サンプルの適切な取扱い。 4）一般的な実験室の衛生の実施を徹底する。

多孔質材料は、多くの安価機器フリーアッセイにおいて利用されている。これらは、調整可能な細孔サイズ、多目的機能、低コスト、流体の受動的なウィッキングを可能にする高い表面対体積比を有することができる。私たちは、主に、その適切な細孔サイズおよび低いタンパク質吸着クロマトグラフィーセルロース紙等級1を選んだ。別の一般的に使用される多孔性材料、ニトロセルロースと比較して、セルロース紙は、非常に低い非特異的タンパク質吸着^34を有している。また、本研究におけるEVの少ない非特異的捕捉を見つける。加えて、その粒子の保持レベル、11ミクロン、で特異的な捕捉を可能にする、電気自動車³⁵のサイズよりも大きいEVの物理的なトラップとは対照的。ここでは、より大きな電気自動車を研究する場合に修正することができるステップを0.8μmフィルタ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
クロマトグラフィー 論文	GE Healthcare Life Sciences	3001-861	Whatman®グレード1セルロース紙
(3-メルカプトプロピル)トリメトキシシラン	シグマアルドリッチ	175617	この化学物質は水と水分と反応するため、窒素を充填したグローブバッグの内側に塗布する必要があります。目や皮膚に触れないようにしてください。煙を吸い込んだり、蒸気を吸い込んだりしないでください。
エタノール	フィッシャーサイエンティフィック	BP2818	アブソリュート、200プルーフ、分子生物学グレードの
ウシ血清アルブミン(BSA)	BioShop Canada Inc.	ALB001	コーン分数Vと呼ばれることが多い。
N-γ-maleimidobutyryloxy succinimide ester (GMBS)	Pierce Biotechnology	22309	GMBSは、アミン-スルフヒドリル架橋剤です。GMBSは湿気に敏感です。
Avidin	Pierce Biotechnology	31000	NeutrAvidinはビオチンの結合部位が4つあり、そのpI値は6.3で、これは天然のアビジンよりも中性
ビオチン化マウス抗ヒト抗CD63	Ancell	215-030	クローンAHN16.1 / 46-4-5
ビオチン化アネキシンV	BD Biosciences	556418	Annxin Vは、ホスファチジルセリン(PS)に対して高い親和性を持っています
抗CD9および二次抗体	System Biosciences	EXOAB-CD9A-1	二次抗体は、西洋ワサビ、ペルオキシダイス標識、
血清分離チューブ、	BD Biosciences	、367991	血清分離のための血栓活性化剤およびゲル
アネキシンV結合バッファー	BD Biosciences、	556454	10倍、使用前に1倍に希釈します。
TMB基質試薬セット	BD Biosciences	555214	過酸化水素と3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)
[header]
RNA分離キット	Life Technologies	AM1560	MirVana RNA分離キット
ポリビニルピロリドンベースのRNA分離助剤	Life Technologies	AM9690	植物RNA単離助剤には、多糖類に結合するポリビニルピロリドン(PVP)が含まれています。
RNAクリーンアップキット	Qiagen Inc.	74004	MinElute RNAクリーンアップキットは、最大45 の精製用に設計されています。μg RNAです。
プラズマチャンバー	マーチインスツルメンツ	PX-250
走査型電子顕微鏡	日立製作所	S-4300
デスクトップスキャナー	レットパッカード社	Photosmart B110	8ビットカラー画像をキャプチャしました。カメラやスマートフォンも使用できます。
画像記録システム	J&H Technology Co	GeneSys G:BOX Chemi-XX8	16ビットフルロセンス画像を撮影しました。フルロセンス顕微鏡も使用できます。