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方法論記事

ニコチン誘導性カルシウムシグナリングおよび腹側海馬軸索に沿って神経伝達物質放出のライブイメージング

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DOI:

10.3791/52730

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2015年6月24日

 ,  , 
1Department of Neurobiology and Behavior, Stony Brook University, 2Department of Pharmacological Science, Stony Brook University

この記事について

サマリー

私たちは、ニコチン性アセチルコリン受容体(nAChR)を介したシナプス伝達のシナプス前メカニズムを直接ライブイメージングで分析するための、腹側海馬-側坐回路の遺伝子キメラ製剤をin vitroで開発しました。この調製は、シナプス可塑性のシナプス前およびシナプス後のメカニズムを研究するための有益なアプローチも提供します。

要約

シナプス前ニコチン性アセチルコリン受容体（nAChR）の活性化による軸索シグナル伝達の持続的な増強と神経伝達物質の放出の増加は、アセチルコリン（ACh）による神経調節の重要なメカニズムです。インタクトな軸索内および神経終末におけるシグナル伝達機構をin vitroおよびin vivoで調べることが困難であるため、シナプス可塑性のシナプス前成分の研究は限定的に進んでいます。ここでは、in vitroでシナプス前ニューロンとシナプス後ニューロンの遺伝的プロファイルを選択的に変化させながら、伝達のシナプス前とシナプス後の両方の成分を直接ライブイメージングで分析できる、腹側海馬(vHipp)-側坐(nAcc)回路の遺伝子キメラ調製物を紹介します。シナプス前軸索入力としてのvHippマイクロスライスからの投影が、シナプス後ターゲットであるnAccからの分散ニューロンと複数の信頼性の高いグルタミン酸作動性シナプスを形成することを実証します。nAChRのさまざまなサブタイプのシナプス前局在が検出され、シナプス前ニコチンシグナル伝達を介したシナプス伝達が、電気生理学的記録と生細胞イメージングの同時実行によって監視されます。この調製物は、グルタミン酸作動性シナプス可塑性のシナプス前およびシナプス後メカニズムをin vitroで研究するための有益なアプローチも提供します。

概要

回路の興奮性のコリン作動性調節は、認知機能の基本的な側面に寄与し、変更されたコリン作動性の調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症及び中毒1-4を含む神経変性及び精神神経疾患の特徴です。 CNSにおけるシナプス伝達のコリン作動性促進の確立メカニズムは、シナプス前部位に局在するのnAChRの直接の活性化を介してです。 、間接的に特定のnAChRサブタイプ、および比較的高いカルシウムコンダクタンスの両方に直接起因を介した細胞内シグナル伝達カスケード-これらのシナプス前受容体の活性化は細胞内Ca 2+（[Ca 2+] i） のシナプス前末端での増加につながります図5は 、それによって神経伝達物質の放出を増強します。実際には、シナプス前のnAChRの活性化は、グルタミン酸、GABA、アセチルコリンなどの神経伝達物質の多種多様の放出の変化と関連している、ANDドーパミン6-10。このプロセスは、様々なシナプスにおける電気生理学的方法を用いて、間接的に研究されてきたが、の光学記者の[Ca 2+] iとシナプス小胞のリサイクルは、前シナプス現象のより直接的かつ時間的に正確な測定を可能にします。

nAChR類の前シナプス局在は、電子顕微鏡（EM）レベル11,12でのnAChRの直接の免疫金標識で説得力が実証されています。いくつかの他の技術もまた、培養ニューロン13,14でのnAChR subunit-蛍光タンパク質キメラの位置を検出するなど、間接的のnAChR局在に対処するために使用されている、シナプス端子15,16でのnAChR電流の電気生理学的記録、[内のCaニコチン誘発変化を監視しますによるシナプスターミナルでのライブセルイメージング17、及び神経伝達物質の放出を間接的に監視することにより、シナプス神経終末における2+] i のスチリル両親媒性FM色素（FM1-43とFM4-64）お​​よび/またはsynapto-pHluorinによって、そのようなグルタミン酸のためのAChとiGluSnFrためCNiFERsなどの特定の神経伝達物質の蛍光の記者、によって見シナプス小胞のエキソサイトーシスを含む蛍光指示薬と生細胞イメージング技術、 18-20。全体的に、nAChR類の前シナプス局在を同定するため、これらの現在の手法は複雑であり、信頼性の高い同定とプレシナプス活性の生理学的モニタリングを可能にするために、特別なシステム及び技術を必要とします。

識別し、シナプス伝達のシナプス前および後の両方の成分を分析するための直接アクセスを提供し、側坐核（NACC）回路-ここでは、腹側海馬（vHipp） の in vitro共培養システムのためのプロトコルおよび装置が記載されています。我々は、シナプス前のnAChRの局在およびCa 2+シグナル伝達と神経伝達物質の放出ALO媒介のnAChRのライブセルイメージングの例を示しますNG vHipp軸索。ここで紹介するプロトコルの自然（と簡単な）拡張は、異なる遺伝子型からの神経細胞からなる前と後シナプスの接点の製造です。このように、変調の前および/または後シナプスメカニズムの特定の遺伝子産物の寄与を直接評価することができます。

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プロトコル

全ての動物実験は、実験動物の管理と使用に関する健康ガイドの国立研究所に従って行った（NIH出版番号80から23は、2012年改訂）し、研究は施設内動物実験によって承認されたとストーニーの研究委員会のために使用しますブルック大学（＃1618と＃1792）。

1. vHipp-NACCシナプス共培養

  1. 犠牲マウス（生後0日-野生型（WT）またはα7nAChR類トランスジェニックマウスラインから3）CO 2を。各子犬の首をはねると事後遺伝子型決定のための1.5ミリリットル遠心管に尾を保存します。滅菌フードで次の手順を実行します。
  2. 脳全体を露出させるためにハサミやピンセットで頭蓋骨の上部を取り外します。互いに尾側からの大脳皮質の部分の接合部から開始して、解剖顕微鏡下vHipp 5,21を含む後部皮質が含まれている冠状断面を得ます。
  3. Vを分析発展途上のマウス脳アトラス22（ 図1A）によればCA1-海馬台領域を含むヒップ組織片。 （100ミクロンmicroslices×100ミクロン程度）の小さな薄いスライスにカット冷培地（4℃）を含む35mmの培養皿に移します。
  4. 37℃のインキュベーター内に少なくとも30分間、培地（〜500μl）を、24​​ウェル組織培養プレートの内側12ミリメートルポリ-D-リジン/ラミニン被覆カバーガラスをプレインキュベートします。 microslicesをメッキする前にメディアを取り出します。
  5. 外植片の付着を容易にするために（microslicesの〜20個を含む〜50μL、）メディアの最小量でカバースリップの中央に火造りパスツールピペットでプレート。 1匹の動物に由来するプレートvHippのmicroslices（どちらか+ / +または - / - トランスジェニックα7ラインの​​遺伝子型）各カバースリップ上。
  6. 外植片がカバースリップ上に沈降した後、静かに目によって追加メディア（〜100μl）を追加電子壁メディアのレベルは完全に周囲の外植片ではなく、カバースリップの中央にそれらをカバーするのに十分に高いようにします。
  7. 37℃でO / Nインキュベートした後、5％CO 2インキュベーター、生後1日目WTマウスに胚日18からNACCニューロンを分散させ、外植片に加えます。
    1. 発展途上のマウス脳アトラス20（ 図1B）に応じてNACC組織を解剖。
    2. （500ミクロンmicroslices×500ミクロン程度）を小片に切断し、15 mlチューブに移します。
    3. 37℃で15分間、0.25％トリプシン（2ml）で処理します。冷培地で1回洗浄（5 mlで4°C）、続いて冷洗浄培地（5 mlで4°C）での洗浄組織塊三回。サスペンションは、各洗浄工程における5分間の休憩、その後、上清を慎重に取り除くことを可能にします。
    4. 軽くファイアーポリッシュパスツールピペットで培養培地2mlに優しい粉砕して細胞を解離します。
    5. トランス5分間、2,000 X rpmでさらに15 mlチューブと遠心分離機に細胞懸濁液FER。上清を除去し、6子犬ごとに1 mlの培養培地で細胞を再懸濁します。穏やかファイアーポリッシュパスツールピペットで培地で数回ピペッティングして細胞を分散。
    6. vHipp移植片と各カバースリップに分散NACC細胞の0.25ミリリットルを追加します。
    7. 加湿37℃、5％CO 2インキュベーター内で培養を維持します。機械的にシナプス形成を促進する、湿度を安定して維持するために、湿らせた滅菌ガーゼパッド上に培養プレートを置きます。

2.免疫細胞化学

  1. 4％パラホルムアルデヒド/ 4％スクロース/ PBS（カバースリップあたり〜500μL、20分、RT）における- （in vitroで 7日5）文化を修正しました。
  2. 0.25％トリトンX-100 / PBSで透過処理培養（〜カバースリップあたり500μL、5分、RT）。
  3. 不格好なやつの前に、PBS中の10％正常ロバ血清（カバースリップあたり〜500μL、30分、RT）でブロック文化Y染色。 4℃でO / N一次抗体でインキュベートします。 、抗小胞性グルタミン酸トランスポーター1（1：250）、抗GAD65（1：100）：;：抗nAChR類（抗α5サブユニット、1 500 500α4 -ECD 1：）以下の一次抗体を使用してください。
  4. PBSで一次抗体を洗浄（カバースリップあたり3回/〜500μL、5分間）した後、アレクサ488（カバースリップあたり〜500μlを、1：500）に結合した二次抗体で培養インキュベートまたはアレクサ594（カバースリップあたり〜500μLを、1：37℃で1時間、500）。
  5. 標識前表面α7*のnAChRのための固定を37℃で45分間：（培地1,000〜カバースリップあたり500μlの、1）のAlexa 594にコンジュゲートαBgTxで培養をインキュベートします。
  6. マウントとシールカバースリップ。
  7. プランアポクロマート対物レンズ（NA 0.8または1.4 NAの63X油で20X）を備えた蛍光顕微鏡とCCDカメラで画像をキャプチャします。

3. FM1-43ベースの水疱性の融合

  1. ディスク共焦点顕微鏡を紡糸上室マウント、撮像チャンバ内に- （in vitroで 7日、5）の文化を維持します。連続RTでHBSカクテル（1ml /分）灌流。
  2. 90秒間の56 mMのK + ACSF（〜500μL）（染色）で10μMのFM1-43で灌流し、負荷の文化を停止、のCa 2+ ADVASEP-7（0.1 mm）を含む無HBSで15分間離れて外部染料を洗います膜結合FM1-43を除去します。
  3. 、120秒（脱色）のためにFM1-43ずに56 mMのK + ACSF（〜500μL）と文化を刺激するのと同じ条件を用いて、FM1-43と文化を再ロード、およびCaで再び洗浄2+のためADVASEP-7を含む無HBS 15分。
  4. （1.4 NA、励起488 nmの発光530 nmのと60X水）プランアポクロマート対物レンズを搭載した回転ディスク共焦点顕微鏡でFM1-43の蛍光画像を取得し、CCDカメラで画像をキャプチャします。
  5. 1分間のベースラインFM1-43蛍光画像（2秒ごとに集めます）プリニコチンコントロールとして; 1分間の急速な灌流（2 ml /分）によってニコチン（1μM）を適用し、アウトHBSカクテルでニコチンを洗います。 5分ごとに2秒の間、およびニコチン適用後に、前にキャプチャタイムラプス画像を保管してください。
  6. （F 染色 ）の前に、各シナプスブートンにおける（F 脱色 ）ニコチン適用後FM1-43の蛍光強度を定量化します。
  7. ニコチンアプリケーション（ΔF= F 染色 -Fの脱色 ）の前と後のFM1-43蛍光強度の差を定量化することによってvHipp軸索に沿って解放可能FM1-43蛍光の総量を計算します。次式を有するニコチン後の蛍光強度の減少の割合を分析：F 減少 ％=ΔF/ F 染色 。

4.カルシウムイメージング

  1. 次に、（5μMのFluo-4のCa 2+指示薬と文化を読み込む、通常のHBSで迅速- （in vitroで 7日5）文化をすすぎますAMエステル）、37℃で30分間、5％CO 2のためにHBSで0.02％プルロニックF-127（2ml）中。
  2. HBSとのFluo-4溶液（3回/ 5分）洗い流します。 （37℃/ 5％CO 2）は、少なくとも30分間インキュベーターに文化を返します。
  3. 同じ撮像チャンバーとFM1-43ベース小胞の融合の項に記載と同様の条件で培養を維持する（ステップ3.1を参照してください）​​。
  4. プランアポクロマート対物レンズ（1.4 NAの60X水、励起488 nmの発光530 nm）をCCDカメラでvHippマイクロスライスから軸索突起のフルオ4蛍光画像を収集します。
  5. 1分間の急速な灌流（2 ml /分）によってニコチン（1μM）を適用、事前ニコチンコントロールとして、ベースラインのFluo-4の蛍光画像（2分10秒ごと）を採取し、アウトHBSカクテルでニコチンを洗います。 30分ごとに10秒の間、およびニコチン適用後に、前にキャプチャタイムラプス画像を保管してください。
  6. 一連の生のfluo-4の蛍光画像、輸出のすべてのフレームを保存さらなる分析のためのTIFF形式の画像。
  7. ニコチン適用前と後のvHipp軸索に沿ってFLUO-4の蛍光の積分強度を収集します。
  8. ΔF/ F F 0は、バックグラウンド補正前ニコチン積分蛍光強度であり、Fは、各時点におけるvHipp軸索に沿って統合された蛍光強度が0 =（FF 0）/ F 0、以下の式を有する集積蛍光強度を正規化ニコチン適用後。正規化された統合された蛍光強度を分析し、プロットします。

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結果

採用製剤は、 インビトロで vHipp-NACC回路の遺伝子キメラ共培養物から構成されています。 vHippのmicroslicesから発せられる投影は、前シナプスの軸索の入力として、シナプス後の目標、NACCから分散ニューロンとシナプス接触を行うことができます。ニコチンはvHipp軸索21とシナプス前α7を介しvHipp軸索5に沿ってシグナリング長期化カルシウム*のnAChRにより神経支配NACCニューロンからのグルタミン酸伝達の持続（≥30分）円滑化を誘導しました。

図1は、vHippマイクロスライスから突起がグルタミン酸（VGLUT1正）であることを直接示し、接点がNACC（GAD正、 図1C、D）から分散GABA作動性中型有棘ニューロンで作られています。 α7*と（α4及びα5サブユニットを含む）非α7* nAChR類はvHipp軸索（ 図1E-G）に沿って、具体的に現場で発見された両方ここvHippの突起がN...

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ディスカッション

共培養の準備は、in vitroで前シナプスのnAChRの活性化が強化されたグルタミン酸作動性伝達5、21を誘発することにより、空間的および時間的プロファイルのこの準備を許可比較的簡単で信頼性の高い検査を再降伏し、腹側海馬側坐核回路を説明しました。

共培養は、インビボ様の機能を実証するために、インビトロでの生理学的条件を提供することができる一皿内の異なる特定の細胞型の増殖として定義されます。従来のニューロン - ニューロン共培養物は、異なる細胞型の間のシナプスの相互作用を研究するための神経科学の研究に導入されています。しかしながら、前及びこれらの共培養におけるシナプスの後の部位を同定することは困難です。このmicroslice解離ニューロンの共培養プロトコルは、シナプス前軸索とシナプス後の標的の容易に認識することができます。異なる脳領域からの使用microslices O異なる蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウス、Fラインが、このプロトコルは、軸索、軸索相互作用を研究するために使用することができ...

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開示事項

著者らは、開示することは何もありません。

謝辞

技術サポートを提供してくださったYehui QinさんとMallory Myersさんに感謝します。また、抗α4-ECD抗体を提供してくださったSigismund Huck博士にも感謝します。この研究は、国立衛生研究所の助成金NS22061によって支援されています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1. 培養培地 (50 ml)
神経基礎 GIBCO1088802248 ml
B-27 サプリメントGIBCO0080085-SA1 ml
ペニシリン-ストレプトマイシンGIBCO10908-0100.5 ml
GlutaMAX サプリメントGIBCO35050-0610.5 ml
脳由来神経栄養因子 (BDNF)GIBCO15140-12220 ng/ml
2. 洗浄培地 (HBSS, 100 ml)
HBSS、カルシウム、マグネシウム、フェノールレッドなし GIBCO14175-09599 ml
HEPES ( 1M)GIBCO15630-1301 ml
3.HEPES緩衝生理食塩水 (HBS)  pH=7.3
NaClSigmaS9888 135 mM
KClSigmaP9333 5メートルメートル
MgCl<サブ >2シグマM8266&;1 mM
CaCl2,SigmaC1016 2 mM
HEPESシグマH3375 10 mM
グルコースシグマG0350500 10 mM
4. HBSライブイメージング用カクテル pH=7.3
NaClSigmaS9888 135 mM
KClSigmaP9333 5メートルメートル
MgCl<サブ >2シグマM8266&;1 mM
CaCl2,SigmaC1016 2 mM
HEPESシグマH3375 10 mM
グルコースシグマG0350500 10 mM
テトロドトキシン トクリス10782 & マイクロ;M
bicucullineTocris13110 µM
D-AP-5トクリス10550 & マイクロ;M
CNQXトクリス104520 & マイクロ;M
LY341495Tocris120910 & マイクロ;M
5.カルシウムフリー HBSの  pH=7.3
NaClSigmaS9888 135 mM
KClSigmaP9333 5メートルメートル
MgCl<サブ >2シグマM8266&;1 mM
HEPESシグマH3375 10 mM
グルコースシグマG0350500 10 mM
6. 56 mM カリウム ACSF pH=7.4
NaClΣS9888119 mM
KClΣP933356 mM
MgSO4.7HΣM18801.3 mM
CaCl2σC10162.5 mM
NaH2PO4ΣS82821 mM
NaHCO3σS576126.2 mM
グルコースシグマG0350500 10 mM

参考文献

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