ニコチン誘導性カルシウムシグナリングおよび腹側海馬軸索に沿って神経伝達物質放出のライブイメージング

サマリー

私たちは、ニコチン性アセチルコリン受容体(nAChR)を介したシナプス伝達のシナプス前メカニズムを直接ライブイメージングで分析するための、腹側海馬-側坐回路の遺伝子キメラ製剤をin vitroで開発しました。この調製は、シナプス可塑性のシナプス前およびシナプス後のメカニズムを研究するための有益なアプローチも提供します。

要約

シナプス前ニコチン性アセチルコリン受容体（nAChR）の活性化による軸索シグナル伝達の持続的な増強と神経伝達物質の放出の増加は、アセチルコリン（ACh）による神経調節の重要なメカニズムです。インタクトな軸索内および神経終末におけるシグナル伝達機構をin vitroおよびin vivoで調べることが困難であるため、シナプス可塑性のシナプス前成分の研究は限定的に進んでいます。ここでは、in vitroでシナプス前ニューロンとシナプス後ニューロンの遺伝的プロファイルを選択的に変化させながら、伝達のシナプス前とシナプス後の両方の成分を直接ライブイメージングで分析できる、腹側海馬(vHipp)-側坐(nAcc)回路の遺伝子キメラ調製物を紹介します。シナプス前軸索入力としてのvHippマイクロスライスからの投影が、シナプス後ターゲットであるnAccからの分散ニューロンと複数の信頼性の高いグルタミン酸作動性シナプスを形成することを実証します。nAChRのさまざまなサブタイプのシナプス前局在が検出され、シナプス前ニコチンシグナル伝達を介したシナプス伝達が、電気生理学的記録と生細胞イメージングの同時実行によって監視されます。この調製物は、グルタミン酸作動性シナプス可塑性のシナプス前およびシナプス後メカニズムをin vitroで研究するための有益なアプローチも提供します。

概要

回路の興奮性のコリン作動性調節は、認知機能の基本的な側面に寄与し、変更されたコリン作動性の調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症及び中毒^1-4を含む神経変性及び精神神経疾患の特徴です。 CNSにおけるシナプス伝達のコリン作動性促進の確立メカニズムは、シナプス前部位に局在するのnAChRの直接の活性化を介してです。 、間接的に特定のnAChRサブタイプ、および比較的高いカルシウムコンダクタンスの両方に直接起因を介した細胞内シグナル伝達カスケード-これらのシナプス前受容体の活性化は細胞内Ca ^{2+（[Ca 2+]} i） _のシナプス前末端での増加につながります^図5は 、それによって神経伝達物質の放出を増強します。実際には、シナプス前のnAChRの活性化は、グルタミン酸、GABA、アセチルコリンなどの神経伝達物質の多種多様の放出の変化と関連している、ANDドーパミン^6-10。このプロセスは、様々なシナプスにおける電気生理学的方法を用いて、間接的に研究されてきたが、の光学記者の[Ca ^2+] _iとシナプス小胞のリサイクルは、前シナプス現象のより直接的かつ時間的に正確な測定を可能にします。

nAChR類の前シナプス局在は、電子顕微鏡（EM）レベル^11,12でのnAChRの直接の免疫金標識で説得力が実....

プロトコル

全ての動物実験は、実験動物の管理と使用に関する健康ガイドの国立研究所に従って行った（NIH出版番号80から23は、2012年改訂）し、研究は施設内動物実験によって承認されたとストーニーの研究委員会のために使用しますブルック大学（＃1618と＃1792）。

1. vHipp-NACCシナプス共培養

1. 犠牲マウス（生後0日-野生型（WT）またはα7nAChR類トランスジェニックマウスラインから3）CO ₂を。各子犬の首をはねると事後遺伝子型決定のための1.5ミリリットル遠心管に尾を保存します。滅菌フードで次の手順を実行します。
2. 脳全体を露出させるためにハサミやピンセットで頭蓋骨の上部を取り外します。互いに尾側からの大脳皮質の部分の接合部から開始して、解剖顕微鏡下vHipp ^5,21を含む後部皮質が含まれている冠状断面を得ます。
3. Vを分析発展途上のマウス脳アトラス^22（ 図1A）によればCA1-海馬台領域を含むヒップ組織片。 （100ミクロンmicroslices×100ミクロン程度）の小さな薄いスライスにカット冷培地（4℃）を含む35mmの培養皿に移します。
4. 37℃のインキュベーター内に少なくとも30分間、培地（〜500μl）を、24​​ウェル組織培養プレートの内側12ミリメートルポリ-D-リジン/ラミニン....

結果

採用製剤は、 インビトロで vHipp-NACC回路の遺伝子キメラ共培養物から構成されています。 vHippのmicroslicesから発せられる投影は、前シナプスの軸索の入力として、シナプス後の目標、NACCから分散ニューロンとシナプス接触を行うことができます。ニコチンはvHipp軸索²¹とシナプス前α7を介しvHipp軸索⁵に沿ってシグナリング長期化カルシウム*のnAChRにより神経支配NACCニューロンからのグルタミン酸伝達の持続（≥30分）円滑化を誘導しました。

図1は、vHippマイクロスライスから突起がグルタミン酸（VGLUT1正）であることを直接示し、接点がNACC（GAD正、 図1C、D）から分散GABA作動性中型有棘ニューロンで作られています。 α7*と（α4及びα5サブユニットを含む）非α7* nAChR類はvHipp軸索（ 図1E-G）に沿って、具体的に現場で発見された両方ここvHippの突起がN.......

ディスカッション

共培養の準備は、in vitroで前シナプスのnAChRの活性化が強化されたグルタミン酸作動性伝達^5、21を誘発することにより、空間的および時間的プロファイルのこの準備を許可比較的簡単で信頼性の高い検査を再降伏し、腹側海馬側坐核回路を説明しました。

共培養は、インビボ様の機能を実証するために、インビトロでの生理学的条件を提供することができる一皿内の異なる特定の細胞型の増殖として定義されます。従来のニューロン - ニューロン共培養物は、異なる細胞型の間のシナプスの相互作用を研究するための神経科学の研究に導入されています。しかしながら、前及びこれらの共培養におけるシナプスの後の部位を同定することは困難です。このmicroslice解離ニューロンの共培養プロトコルは、シナプス前軸索とシナプス後の標的の容易に認識することができます。異なる脳領域からの使用microslices O異なる蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウス、Fラインが、このプロトコルは、軸索、軸索相互作用を研究するために使用することができ.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1. 培養培地 (50 ml)
神経基礎	GIBCO	10888022	48 ml
B-27 サプリメント	GIBCO	0080085-SA	1 ml
ペニシリン-ストレプトマイシン	GIBCO	10908-010	0.5 ml
GlutaMAX サプリメント	GIBCO	35050-061	0.5 ml
脳由来神経栄養因子 (BDNF)	GIBCO	15140-122	20 ng/ml
2. 洗浄培地 (HBSS, 100 ml)
HBSS、カルシウム、マグネシウム、フェノールレッドなし	GIBCO	14175-095	99 ml
HEPES ( 1M)	GIBCO	15630-130	1 ml
3.HEPES緩衝生理食塩水 (HBS)  pH=7.3
NaCl	Sigma	S9888	135 mM
KCl	Sigma	P9333	5メートルメートル
MgCl<サブ >2シ	グマ	M8266&;	1 mM
CaCl2,Sigma		C1016	2 mM
HEPES	シグマ	H3375	10 mM
グルコース	シグマ	G0350500	10 mM
4. HBSライブイメージング用カクテル pH=7.3
NaCl	Sigma	S9888	135 mM
KCl	Sigma	P9333	5メートルメートル
MgCl<サブ >2シ	グマ	M8266&;	1 mM
CaCl2,Sigma		C1016	2 mM
HEPES	シグマ	H3375	10 mM
グルコース	シグマ	G0350500	10 mM
テトロドトキシン	トクリス	1078	2 & マイクロ;M
bicuculline	Tocris	131	10 µM
D-AP-5	トクリス	105	50 & マイクロ;M
CNQX	トクリス	1045	20 & マイクロ;M
LY341495	Tocris	1209	10 & マイクロ;M
5.カルシウムフリー HBSの  pH=7.3
NaCl	Sigma	S9888	135 mM
KCl	Sigma	P9333	5メートルメートル
MgCl<サブ >2シ	グマ	M8266&;	1 mM
HEPES	シグマ	H3375	10 mM
グルコース	シグマ	G0350500	10 mM
6. 56 mM カリウム ACSF pH=7.4
NaCl	Σ	S9888	119 mM
KCl	Σ	P9333	56 mM
MgSO4.7H	Σ	M1880	1.3 mM
CaCl2	σC1016	2.5 mM
NaH2PO4	Σ	S8282	1 mM
NaHCO3		σS5761	26.2 mM
グルコース	シグマ	G0350500	10 mM