機械的性質と細胞外マトリックスの微細構造は強く、細胞の3D移行に影響。 インビトロ方法は、集団及び個々の細胞レベルの両方での生物物理学的に可変環境における時空間細胞移動の挙動を研究するために、記載されている。
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この記事について
サマリー
要約
遊走する細胞の能力は、腫瘍および癌転移に胚発生及び創傷治癒から一生を通じて細胞機能のさまざまな重要である。熱心な研究の努力にもかかわらず、細胞遊走の基本的な生化学的および生物物理学的な原理は、まだ完全には特に、生理学的に関連する3次元（3D）の微小環境において、理解されていない。ここでは、三次元細胞遊走挙動の定量的検査を可能にするように設計されたインビトロアッセイを記載する。この方法は、以前に占有されていない細胞外マトリックス（ECM）の中に移動する細胞のmechanosensing能力や傾向を利用する。我々は、モデル系としてコラーゲンゲルにおける高浸潤性乳癌細胞の浸潤、MDA-MB-231を使用する。培養の数週間にわたる細胞集団の広がりと個々の細胞の遊走ダイナミクス生細胞イメージングを用いてモニターし、時空間的に分解されたデータを抽出するために分析することができる。さらに、したがって、この方法は、細胞遊走に微小環境における生物物理学的因子の役割を調査するため、シンプルでありながら強力な方法を提供し、多様な細胞外マトリックスのために容易に適応可能である。
概要
細胞の遊走は、胚発生、止血、および免疫応答ならびに、血管疾患、炎症、および癌の1のような病理学的プロセスにおける様々な生理学的応答において重要な役割を果たしている。細胞遊走の基礎となる生化学的および生物物理学的な因子を解剖する細胞機能の基本的な原理を理解するだけでなく、そのような組織工学、抗転移および抗炎症薬の開発のように、様々な生物医学的用途を前進させるだけではなく、したがって基本的に重要である。 in vivoでの観察が技術的に困難であるため、多くの努力は、細胞遊走のインビトロ要約が注目されている。
細胞遊走を研究するためのインビトロ法に大きく、最も顕著なのは、2次元（2D）表面上にアッセイのために傷を設計またはアッセイ2創傷治癒されている。このようなアッセイは、簡単な実験装置を提供し、容易なの生細胞イメージング、および細胞遊走の基礎となる様々な生化学的機構に有用な洞察を提供する。しかし、これらのアッセイは、in vivoの移行で理解する上での重要な側面である細胞外マトリックス（ECM）アーキテクチャと改造、を考慮していない。最近、ますます三次元培養モデルは、多くの場合、コラーゲンベースのマトリックス3において、優れたin vivoでの状況に似ているプラットフォームを提供すること....
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プロトコル
1.細胞の回収
- 37℃、5％CO 2インキュベーターからMD-MBA-231細胞を得る。 0.5％トリプシン-EDTA溶液を用いて組織培養プレートから細胞を剥離。 T25フラスコで培養した細胞のためのトリプシン-EDTA溶液1mlを使用してください。
- 4分間200×gでの遠心分離により15ミリリットルコニカルチューブ中の細胞をペレット化し、上清を吸引し、そして培養培地の5ミリリットル中に細胞を再懸濁。
- 血球計数器を使用して、ρ、細胞密度をカウントします。
注：細胞播種インナーゲルを調製するために、細胞懸濁液は、後に最終的な細胞播種密度に達するために10倍に希釈される。したがって、10倍濃縮細胞懸濁液が必要とされる。 - 10×細胞濃度を達成するために必要な媒体の体積を計算する。
注：最終細胞播種密度を、 最後の C、約2の15; 10 6細胞/ mlのMD-MBA-231細胞に推奨されており、このプロトコルで使用されている。他の播種密度は、他の細胞型のため....
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結果
ここに提示同心ゲルアッセイは高度に浸潤性乳癌細胞を用いて実施した、MDA-MB-231、2.4 mg / mlの内側のコラーゲンゲルと、一例として= 2×10 6細胞/ mlの細胞播種密度、を有する。 図2に示すように、典型的には培養の数日後に、細胞を、内外ゲル界面に違反し、外側ゲルに侵入し始めた。細胞集団は、主に半径方向外側に広がる。
外側のゲルの重合条件は、細胞遊走特性にマトリックスの密度および機械的特性の役割を研究するために改変することができる。 図3は 、1.5 mg / mlで、2.4 mg / mlの外ゲル中の個々の細胞の動きを示していおよび4.0 mg / mlのコラーゲンは、pH7.4で重合した。共焦点タイムラプス画像は、8時間の内側と外側のゲルとの境界、3つの異なるコラーゲンconcenのセルの変位で得たtrationsは白矢印で示されている。細胞播種密度及び増殖速度に依存して、〜200の個々のセルの軌道は、一般的に抽出することができ、各試料で分析した。
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ディスカッション
このプロトコルでは、in vivoで遭遇したECMにトポロジー的に類似したマトリックス環境における細胞の3D遊走挙動を研究するためのin vitroアッセイについて説明します。このアッセイには、現在利用可能な他の方法と比較して、3つの主な強みがあります。まず、このアッセイにより、集団レベルと個々の細胞レベルの両方で細胞遊走メカニズムを同時に調べることができます。これにより、これまで主に2Dアッセイ14に限定されてきた集団細胞遊走13を研究すると同時に、集団内の個々の細胞の挙動を観察する可能性が開かれます。グループまたはクラスターで自然に移動しない細胞の場合、アッセイは、多様な局所微小環境を持つ多数の細胞から移動特性を詳細に分析する方法を提供し、移動効率と方向性の持続性の生物物理学的起源に関する重要な洞察を提供することができます7,15。
第二に、内側と外側のゲルのゲル条件を変更することにより、3D細胞の移動挙動に対するマトリックス力学と微細構造の影響を直接研究できます10.......
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開示事項
著者らは、開示することは何もない。
謝辞
著者は批判的な議論のためにW.日とK·ジャンセンに感謝し、シンガポール国立大学でナノバイオメカニクス研究室による支援を認める。 NAKがマリー·キュリーIIFフェローシップによる支援を認めるものです。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 細胞培養インキュベーター | Fisher Scientific Pte Ltd | モデル:371、S/No 318854-6055 | |
| 共焦点顕微鏡 | ニコンA1R | インキュベーターチャンバーを装備した倒立共焦点レーザー走査顕微鏡 | |
| ダルベッコのモディファイドイーグルスメディウム(DMEM) | ライフテクノロジー | 11965-092 | |
| ウシ胎児血清(FBS) | ライフテクノロジー | ズ10082-147 | |
| Fluorescent CellTracker dye CMTMR | Life Technologies | C2927 | |
| ガラス底ディッシュ | IWAKI Cell Biology | 3931-035 | 直径35mmディッシュと直径12mmガラス底ウェル |
| 球計算盤 | iN CYTO | DHC-N01 (Neubauer Improved) | |
| マイクロプロセッサpH計 | Hanna Instruments | pH 211 | |
| NutragenCollagen | Advanced BioMatrix | #5010-D | 酸可溶化ウシコラーゲンI型(ストックpH~2) |
| 対物レンズ | Nikon | CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 20XC, W.D. 8.2-6.9mm, NA 0.45. | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン | ライフテクノロジー | ズ 15140-122 | |
| pH メーター | ザルトリウス | S/No 29153352 | ベーシック pH メーター PB-11 |
| トリプシン-EDTA | ライフ テクノロジー | ズ 15400-054 |
参考文献
- Horwitz, R., Webb, D. Cell migration. Curr Biol. 13 (19), R756-R759 (2003).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
- Provenzano, P. ....
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再版と許可
