メカニカルストレッチ中のライブセルイメージング

サマリー

新しいイメージングプロトコルは、カスタムモーター駆動の機械式アクチュエータを使用して開発され、生細胞の機械的ひずみに対するリアルタイムの応答の測定を可能にしました。メカノバイオロジーに関連して、このシステムは最大20%のひずみを適用でき、共焦点顕微鏡または原子間力顕微鏡によるほぼリアルタイムのイメージングを可能にします。

要約

現在、細胞や組織が機械的刺激にどのように反応するかを理解することに大きな関心が寄せられていますが、現在のアプローチは、生細胞や生存組織での反応をリアルタイムで測定する能力に限界があります。プロトコルは、細胞アクチュエータを使用して、共焦点顕微鏡および原子間力顕微鏡(AFM)でイメージングしながら、弾性基板上に成長した生細胞または弾性基板に付着した組織を膨張させるために開発されました。予備的な研究では、ヒト気管支上皮細胞の強直性伸張がミトコンドリアスーパーオキシドの産生の有意な増加を引き起こしたことが示されています。さらに、このプロトコルを使用して、肺胞上皮細胞を伸ばして画像化し、in vitroで肺損傷の1つの形態をシミュレートする過剰膨張による上皮細胞への直接的な損傷を示しました。また、伸ばした細胞上でAFMナノインデンテーションを行うためのプロトコールも提供されています。

概要

細胞は、多くの組織における機械的負荷にさらされ、この機械的刺激は、遺伝子発現、増殖因子の放出、サイトカイン、または細胞外マトリックスと細胞骨格のリモデリング^1-4のパターンの変化を促進することが示されています。このような機械的刺激から形質細胞内シグナルは、メカノ^5-7のプロセスを経て起こります。呼吸器系では、メカノの一つの結果は、活性酸素種（ROS）の環状の引張歪みの存在下での肺上皮細胞における^8,9およびプロ炎症性サイトカイン¹⁰の増加です。強力な証拠も過度の引張歪みがセル^11-14の生化学的応答に加えて、肺胞上皮の損傷を導くにつながることを示唆しています。ここでの焦点は、機械的変形に肺細胞の応答に主であるが、メカノによって誘発される経路は、BASにおいて重要な役割を果たし血管緊張¹⁵の調節および成長板¹⁶の開発など、人体の多くの組織のIC機能。

メカノへの関心の高まりは、培養細胞や組織への生理学的に関連する機械的負荷の適用のための多数のデバイスの開発をもたらしました。具体的には、組織が ​​経験する機械的負荷の一般的な形態である引っ張り歪を適用するデバイスは、人気^11,17-19あります。しかし、利用可能なデバイスの多くは、いずれかの組織工学アプリケーションのためのバイオリアクターとして設計やストレッチでリアルタイムイメージングに資するものではありません。このように、メカノの経路の調査を容易にするために、張力の細胞及び組織を視覚化することができるツールおよび方法を開発する必要があります。

ここで、面内の機械的延伸装置が設計され、プロトコルは、Mを適用するために開発されましたultiple組織への株の形態および細胞リアルタイム（ 図1A-D）における生化学的および機械的応答のイメージングを可能にします。デバイスは、可撓性膜をつかみ、約20％（ 図1B）に面内、ラジアル膨満アップを適用するために円周方向に配置された6つの等間隔のクランプを使用しています。モータ（ 図1C）がインキュベータの外 ​​部に配置され、モータ供給業者によって提供される独自のソフトウェアによって制御される作動装置は、長期間の細胞培養インキュベーターに置くことができます。モータは、緊張と弛緩中に均一6ストレッ​​チャクランプを駆動する、内部カムを回転させるリニアドライバに接続されています。

機械装置に加えて、カスタマイズされた柔軟な膜は、機械的なシステムで使用される市販の細胞培養準備膜から作成されました。およその直径そして円形壁（28ミリメートル）を作製し、細胞にのみ十分に記載ひずみプロフィールのこの領域中で培養することができるように、可撓性膜上に付着させました。作動装置内のこれらの膜の配置は、可撓性膜の中心部に均一で等方性の歪みを提供するかどうかを決定するために、有限要素解析は、市販のソフトウェア（ 図1E-F）を用いて行きました。フレキシブル膜は、対称境界条件でモデル化し、メッシュのすべての四角形要素を利用しました。 図1Fに示す最大主ひずみの等高線図に見られる同心リングは、歪みの等方性の分布を示しています。

膜によって受ける歪みがローディング（ 図2）を介してマーキングの画像を記録することによって測定した。 図2Dは ​​、半径方向及び軸方向に測定された平均膜株がほぼ直線であったことを示します適用モータに対して20％の最大線形歪みにカウントアップします。バック休止位置へ後退時に測定されたものと比較して膨張時に測定された歪みのレベルの間に有意差はなかったです。次に、カスタム可撓性膜上で培養したヒト気管支上皮細胞（16HBE）及びそれらの核の変位を測定しました。全細胞の変位は、デジタルマイクロスコープを用いて記録位相コントラスト画像を用いて測定したのに対し16HBE細胞の蛍光標識（DAPI）核は、共焦点顕微鏡下で20X対物レンズを用いて画像化しました。 図3に見られるように20％の線形歪み〜まで、核の変位によって測定ひずみは、膜上のマーキングの変位によって測定されたものと同様でした。これは、膜に加わる歪みを接着細胞に伝達されたことを確認します。従来の顕微鏡のカスタムデバイスの使用を記述プロトコルおよび原子間力microscopeは、以下のステップで提供されます。

プロトコル

1。細胞培養培地の保持のためのウェル壁を有する膜の構築（最終製品については、図1Dを参照してください）

1. コラーゲンIでコーティングされたポリジメチルシロキサン（PDMS）のシートを使用して、外科用メスまたはダイを可撓性膜の輪郭をカットします。
2. ストレージのための60ミリメートルペトリ皿に各膜を配置します。
3. 壁の作成：
   1. B（硬化剤）をエラストマーにエラストマーAの1の重量比：10にPDMSを混ぜます。
   2. 50mlチューブに完全に混合PDMSの5ミリリットルを注ぎます。
   3. ハイブリダイゼーションオーブンに水平に未硬化のPDMSを用いて50 mlチューブを置きます。
   4. 硬化時間の間に8回転で被覆するために、チューブの内壁をローター関数を使用します。 RTで、PDMSは、完全に2日間で硬化させることになります。
   5. 滅菌細胞培養フード内管からPDMSを削除します。
   6. 新しいカミソリの刃を使用して、セクションの高さ4ミリメートルにPDMSのシリンダーを分割。
   7. 膜WAとなるセクションを配置壁が折り目を付けになることを可能にすることのないペトリ皿容器にLLS、。
4. ペトリ皿に2を維持しながら、一つの膜の上にPDMSの一方の壁を選択し、中央。
5. 接着剤として使用する壁の外側周囲に：（1比10）静かに未硬化PDMSを配置します。それは、液体を保持することがあるため、壁と膜との間のギャップの形成を防止します。
6. 各ペトリ皿完成膜を含有し、硬化させる24時間70℃のオーブンでカバーを置きます。

キャリブレーションのためのクランプ変位または放射状の成長（図2）とモータ回転2.相関

1. モータを制御するソフトウェアを起動します。
2. モーターソフトウェアの手動設定を使用してデバイスのクランプを移動さ。
3. 距離を測定し、クランプの最小値と最大変位の両方でクランプの対向間のモータカウント位置を記録。
4. Dの変化率（％）を計算しますモーター·カウント（〜0-75kカウント）の関数としてのクランプ間istance。これは、膜上で達成される最大の潜在的なひずみを示します。

マウス肺上皮細胞株のストレッチの3.アプリケーション（MLE12）

1. ウェルあたり可撓性膜上の250万細胞（ステップ1）でのシードMLE12細胞は、2日以内にコンフルエントします。播種密度は、異なる細胞タイプについて変化し得ます。
2. 機械式アクチュエータが完全にリラックスした位置にあることを確認します。
   1. 細胞培養培地を除去します。
   2. 6クランプのそれぞれに2つの穴を開け、1.5ミリメートルに生検パンチを使用して膜のタブ（ 図1Dを参照してください）。穴の径方向の配置は、最初にプリテンション膜経験の量を決定します。何の予備張力を希望されない場合、膜のタブで20.5ミリメートルの半径で穴を開ける。
   3. パンチ穴がクランプ内ピンと並んでストレッチャー上の膜の位置を調整します。代わりにトップクランプを配置します。ネジの側面を交互に一つずつを締めます。
   4. 1ミリリットルの細胞培養培地を追加します。
3. 光路を有する膜の中央を中心に顕微鏡ステージ上には置か。
4. （可能な場合）ステージにデバイスを固定するテープや磁石を使用してください。いったん固定、顕微鏡のステージコントローラと機械装置の面内（膜に平行）および垂直（Z方向）を制御します。
5. 手動でモータ回転²⁰の位置や速度を制御することにより、製造業者によって提供されるソフトウェアでストレッチを適用します。

ミトコンドリア活性酸素種の4測定（ROS）

1. 細胞がコンフルエントになったら、直接細胞にミトコンドリアのスーパーオキシドインジケータ（5μM最終濃度）でRT DMEM 1〜2mlのを追加します。
2. 37℃で10分間インキュベートします。
3. 洗浄細胞を穏やかに緩衝液で3回の水浴中で加温し37°C。
4. すぐに直立共焦点顕微鏡下で既に代わりにストレッチャ（ステップ2.2）に柔軟な膜を配置します。
5. フェノールレッドを含まない培地およびHEPES 25mMので1mlのDMEMを追加します。
6. 580分の510 nmの励起/発光フィルターを設定します。
7. 画像の複数のフィールドは、15分ごとには、ミトコンドリアのスーパーオキシド産生の所望の時間経過を作成します。
8. 撮影された画像から、記録蛍光強度は、蛍光強度を定量化することが可能なソフトウェアを使用して、各時間間隔でヒストグラム。

ストレッチや原子間力顕微鏡（AFM）の5.アプリケーション

注：これらの手順は、特定のAFMと光学顕微鏡の組み合わせ（ 図4および物質一覧）のために提供されます。

1. 実験のAFMを準備します。
   1. z方向の最大位置にAFMヘッドの高さを増やします。
   2. AFMの足への増量を入れてサンプルAFMカンチレバーコンタクトれるプレーンを持ち上げます。試料とAFMヘッドは機械装置の高さに対応するために持ち上げられる必要があります。
2. （利用可能な場合）、光学顕微鏡を準備します。
   1. AFMスキャナプレートを取り外します。所望の目的を削除します。
   2. 客観的にスペーサーを追加します。スペーサの高さは、客観的かつ具体的なAFMのセットアップに依存しますが、光学イメージングが所望される場合、観察面がストレッチャーとアダプター高さに等しい量だけz方向にシフト（ 図になりますので、それが必要です図5（a））。 AFMは、通常、デバイス上記光路から低倍率のイメージングを提供することに注意してください。
   3. バックの位置で所望の目的をマウントします。 AFMに戻すにスキャナを配置します。
   4. AFMソフトウェアを起動します。蛍光測定のための光源を含むすべての必要な光源を起動します。
   5. その片持ち梁にチップをマウントします目的の測定に適しています。生細胞の弾性率を測定するとき200 PN / nm以下剛性が好ましいです。
   6. レーザーの位置を合わせ、デバイスに搭載されたガラスカバースリップ上で製造者の指示に従ってカンチレバー剛性を調整します。
3. ステップ1のものが、以下のように変更して膜を準備します。
   1. すぐにストレッチデバイス上に膜を取り付ける前に、高さ約1mmの壁をカット。これは、膜の壁とロードセルとの間に経験する干渉を防止します。
   2. 3.2.1-3.2.3に記載されているように機械装置の膜をマウントします。
   3. 流出の場合にはAFMスキャナへの損傷を防ぐために、細胞培養培地を取り除き。
   4. カップルアダプタ（ 図5A）を持つデバイス。スキャナーのアダプタと機械装置を配置します。
   5. 希望の引張ひずみレベルに膜を伸ばします。
4. 延伸した細胞のナノインデンテーション。
   1. による流出にAFMスキャナや顕微鏡の損傷を避けるために、細胞上のメディアの限定（<0.5 ml）のボリュームを追加します。
   2. 膜と片持ち梁に係合します。
   3. 関心領域をスキャンするために、特定のAFM装置のプロトコルに従ってください。

結果

活性酸素種と変形

以前の研究は、環状のストレッチ²¹に応答して、気道及び肺胞上皮細胞における活性酸素種（ROS）の増加を示しました。活性酸素種は、分子及び脂質、タンパク質、多糖、および核酸^22-24に対して高い反応性を有する分子酸素由来のフリーラジカルを含みます。 ROSは、一般的な細胞内のイオンチャネルの機能を調節するための信号、プロテインキナーゼ/ホスファターゼ活性化、および遺伝子発現としての役割を果たすが、過剰又は無秩序な産生は、アポトーシスおよび壊死性細胞死、神経変性、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、および癌^24,25に寄与することができます。電子は電子伝達鎖から漏れたときにスーパーオキシド、ROSの他の形態のためのプレカーソルは、ミトコンドリア呼吸の副産物として生成することができます。以前の研究では、力学的サイクルのストレッチは、スーパーの産生を刺激したことを示唆しましたNADPHオキシダーゼ系（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸オキシダーゼ）、およびミトコンドリアの電子伝達鎖（...

ディスカッション

メカニカルストレッチ中に生細胞イメージングのためのユニークなデバイスを開発しました。このデバイスは、肺上皮細胞のメカノを研究するためのプロトコルで使用されました。予備研究では、単一の保持されたストレッチは、気管支上皮細胞におけるミトコンドリアのスーパーオキシド産生を刺激することが見出されました。また、機械的な歪みのレベルの増加は、肺胞上皮細胞の単層の完全性に直接的な損傷を引き起こすことが実証されました。

これらの予備実験を行うために、デバイスが最初に較正し、次に、膜株細胞（ 図2-3）に送信されたことが示されました。 図3Eに示されている（膜上のマークによって測定される）は、膜のひずみと（核との間の距離によって測定される）細胞株との間に密接な相関関係によって示されるように、全体的なデバイスは、好調に推移しました。しかし、ストラの間で観察されたいくつかのマイナーな違いがありました図2Dに示すように、アプローチ中膜およびマーカーの戻り曲線に測定しました。これは、装置内のバックラッシュや...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
SmartMotor NEMA 34: 3400 シリーズ	MOOG アニマティクス	SM3416D	統合モーター、コントローラー、アンプ、エンコーダー、通信バス
Flexcell 膜 (コラーゲン I コーティング)	Flexcell International Corp	SM2-1010C	3.5" x 5.25インチ x 0.020"
シルガード184	ダウコーニングコーポレーション		10:1
キスト33342	Sigma-Aldrich	H1399	DAPI染色
MitoSOX	Sigma-Aldrich	M36008
Tiron	Sigma-Aldrich	D7389	ミトコンドリアスーパーオキシド標識
DMEM			スーパーオキシド阻害剤
FBS
HEPES
50mlチューブ	フィッシャーサイエンティフィック	06-443-19	任意の遠心チューブを使用して、イメージング用の領域を作成することができます。
ハイブリダイゼーションオーブン	Bellco Glass
MLE12 Cells	ATCC	CRL-2110	マウス肺上皮細胞
16HBE細胞	ATCC	CRL-2741	ヒト気管支上皮細胞
AFM Indentation Experiments
Cantilever Beams for Nano-indentation	Budget Sensors	Si-Ni30
AFM	アサイラムリサーチ	MFP3D
オリンパスの顕微鏡	オリンパス	IX-71	20倍と40倍の対物レンズを備えた倒立顕微鏡。
AFM レッグエクステンダー	アサイラムリサーチ	利用できません	AFM顕微鏡
Finite Element Analyses
ABAQUS	Simulia	6.12
Software
>ImageJ	NIH
Microscopes
>Digital顕微鏡	Life Technologies	EVOS XL Core	当初は自立型企業でしたが、現在はLife Technologiesが所有しています。
共焦点顕微鏡	Zeiss	LSM 710	2光子直立顕微鏡