方法論記事

人間A53T変異αシヌクレインを過剰発現するトランスジェニックマウスの脳における強化ELISAによる疾患関連αシヌクレインの検出

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DOI：

10.3791/52752

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2015年5月30日

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1Neurodegenerative Diseases Unit, ANSES - French Agency for Food, Environmental and Occupational Health & Safety, 2Indicia Production, 3AJ Roboscreen GmbH, 4Epidemiology Unit, ANSES - French Agency for Food, Environmental and Occupational Health & Safety, 5Experimental Facilities, ANSES - French Agency for Food, Environmental and Occupational Health & Safety

この記事について

サマリー

ELISAが新しい定量的アプローチを提供することが説明されています。それは、シヌクレイノパシーのマウスモデル（M83）において、Ser129リン酸化されたα-シヌクレイン（αSD）またはタンパク質のC末端部分に対する抗体を用いて、疾患に関連するα-シヌクレインを特異的に検出します。

要約

ウエスタンブロットのような確立された方法に加えて、新たな方法は、迅速かつ容易にsynucleopathiesの実験モデルにおいて疾患関連αシヌクレイン（αSD）を定量化するために必要とされています。過剰発現しているヒトA53TのαSを自発的に体重減少、衰弱、重度の運動障害などの症状を特徴と年齢の8と22ヶ月の間に劇的な臨床表現型を開発するトランスジェニックマウス系統（M83）は、この研究で使用しました。これらのマウスにおけるαSD（疾患関連αS）の分子解析のために、ELISAは、特に病気のマウスでαSDを定量化するために設計されました。このマウスモデルにおいて、中枢神経系の分析は、主に、尾側脳領域および脊髄におけるαSDの存在を示しました。臨床疾患につながる異なる実験条件、 すなわち間αSD分布の違いはuninoculに、ありませんでしたated、通常トランスジェニックマウスの老化と病気のマウスからの脳抽出物を接種したマウスで。基本的に、ウエスタンブロットおよび免疫組織化学によって得られたものと相関して、ELISAによってSer129リン酸化αSに対する抗体を用いαSD免疫反応性の特異的検出。意外にも、同様の結果がαSのC末端部分に対するいくつかの他の抗体を用いて観察しました。 αSDの伝播は、「プリオン様」メカニズムの関与を示唆し、容易に監視し、ELISA法を用いて、このマウスモデルにおいて定量することができます。

概要

パーキンソン病（PD）のモデル実験における疾患関連のα-シヌクレイン（αSD）を検出する現在の方法のほとんど、例えば免疫組織化学やウェスタンブロットは、時間がかかり定量的ではありません。この神経変性疾患は主に通常は可溶性のシナプス前タンパク質であるαS1,2（ルイ体とルイ小体）が集積した形のα-シヌクレインの蓄積によって特徴づけられます。通常はリン酸化程度はわずかですが、αSはこれらの集積体においてセリン129残基で過剰にリン酸化され3、リン酸化されたSer129αSに特異的に反応する抗体によってモニターできるため、病理の信頼できるマーカーとなります。

最近の研究では、影響を受けた患者の神経系内でのαSの集積の伝播に関与する「プリオン様」のメカニズムが関与している可能性が示唆されています4,5。これらの研究では、αSDを含む脳抽出物をトランスジェニックマウスモデル（M83）に接種することで、A53T変異型のヒトαSタンパク質と関連する重度の運動障害の進行が加速されることが報告されています6（このマウスは年齢とともに進行します）。同様に、同一のM83マウスモデルに再構成αSを脳内注入することで、集積の加速が確認されました5。また、C57Bl/6ワイルドタイプマウスにフィブリル状の再構成αSまたはヒトのDLB患者の脳抽出物を接種することで、リン酸化αSの沈着の誘導も報告されています7,8。Sacino et al.9は最近、フィブリル状のヒトαSを注射した後、M83マウスで広範囲かつ進行性の脳αS集積体形成が誘導できることを指摘しましたが、E46Kトランスジェニックマウスや非トランスジェニックマウスでは誘導されたαS集積体は暫定的で、主に注射部位に限定されていることを示しました。最近の猿の研究では、ヒトに近い種におけるPD由来の抽出物の接種後にαS集積体の伝播が確認されました10。

αSの変化とパーキンソン病との関連性は、αSDがパーキンソン病の潜在的なバイオマーカーであることを示唆しています11。最近の研究では、ヒトの脳脊髄液（CSF）および血漿におけるα-シヌクレインのオリゴマー性可溶性集積体の検出が、αSを捕捉および検出するのに同じ抗体を使用する従来のサンドイッチシステムELISAに基づいて、パーキンソン病の潜在的なバイオマーカーであることが示されました12。この同じ方法に基づき、脳を含む生体サンプルにおいて多量体タンパク質が認識されました。なぜなら、組み立てられた形態に多数のエピトープが存在するからです13。ごく最近、ルイ小体病理が証明された患者のCSFにおける病理的αSが、αSD（5G4）に対する高特異性抗体を使用したELISAキットと免疫沈降アッセイの両方を用いて検出されました14。これらの方法は、PD/DLB患者を他の種類の認知症と区別することができます。

αSの「プリオン様」の集積の伝播は、αSDを特に識別するように設計されたELISAアプローチを使用して、トランスジェニックマウスモデルM83でさらに研究されました15。この研究では、αSDを定量的に検出するために使用された詳細なELISAプロトコルについて報告します。これは、αSD（αSDがαSDに感染したM83マウスから接種されたかどうかにかかわらず）に感染したマウスや、このM83トランスジェニックマウスモデルにおいて病理学的プロセスが特に標的とする脳領域で使用されます4。

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プロトコル

動物に関わるすべての手順およびプロトコルは、EC指令609分の86 / EECに従ったと動物実験（プロトコル11から0043）に倫理の検討のために来る、フランスの国家委員会によって批准します。動物が収容され、ANSESの中に世話したリヨン（承認B 69387 0801）の実験施設を承認しました。

マウスの作製

  1. ペントバルビタールナトリウムの致死量を腹腔内注射によりマウスを安楽死させます。
  2. マウスの頭蓋骨から脳全体を取得し、抽出するまで氷上に35ミリメートルのプラスチックシャーレに入れてください。
  3. 頸髄を抽出します。
    注 ：矢状切片後、または表1に記載した実験の後に利用可能な解剖マウスの脳、のいずれかから脳の半分のいずれかからαSを抽出します。
ExperimenT マウス
接種材料（脳相当） 		生存期間
（DPI） 		中央値/最大生存
（日齢） 		ELISAによるαSdを検出
/ WB / IHC
1 未接種のマウス 441±166 736分の419 8/8
2 接種したマウス（0.2 mg）を 150±52 241分の140 9/9

M83マウスで実施した実験の表1のリスト。接種をした後、病気のマウス（グルコース5％の1％重量/容量）の脳ホモジネート20μlのstriato皮質領域での実験2のための6週間で実施しました3％イソフルラン吸入による6週齢ホモ接合M83マウスの麻酔。解像度：日後inoculエーション。

脳を半減2.αS抽出

  1. 矢状は二つの部分を取得するために脳をカット。粉砕ボールを含むribolysisチューブに各半分を計量。
  2. 50 mMトリス - 塩酸、pHが7.5、750のNaCl、5mMのEDTA、1mMのDTT、1％ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む高塩（HS）のバッファを準備します。 20％（重量/体積）ホモジネートを得るために、脳の半分に、高塩緩衝液を追加します。
  3. 脳からサンプルを調製二回23秒間6.0メートル/秒で機械的ホモジナイザーを用いて半分になります。最初の23秒の均質化の後、第二の23秒サイクルの前に2分間氷上でホモジネートを含むチューブを配置します。
  4. 5分間の未粉砕脳断片を除去するために1000×gで試料を遠心。 200μlのアリコートに分割し、その後のELISA分析のために-80℃でそれらを保つ、上清を回復します。

解剖脳の領域から3αS抽出

  1. 解剖します両端海馬を解剖する場合を除いて一緒に保持されている2つのforcepsの複数形を用いて低電力拡大鏡（8X倍率）と氷上で35ミリのプラスチックシャーレ内の全脳。脳の整合性を保持するために10分を超えないようにしてください。脳の右側を上に配置し、このためには、以下の脳領域を検索します：
    1. ちょうど球の後ろに配置鉗子を使用して、2つの嗅球の1を分離します。下方に移動することにより、脳からそれを取り外します。第二の電球のため、この操作を繰り返します。
    2. ゆっくり2皮質の間に鉗子を楔二皮質の解離を促進するために前方に移動します。 1鉗子で所定の位置に脳を維持し、海馬から大脳皮質を分離するために別のものを使用しています。
    3. 2ミリメートル皮質下の鉗子の位置を調整します。海馬のトップが表示されるまで、鉗子で穏やかな圧力を維持します。皮質の最初の部分を剥がし、第2の部分で繰り返します。 2皮質を分離するために鉗子を使用して、海馬で開始し、脳の前部に向かって移動します。
    4. 海馬の周りに開いた鉗子を置きます。海馬の一番下に鉗子を閉じて、その後静かに可能な限りの回収は、それを削除します。第海馬のための手順を繰り返します。
    5. 線条体の1以下に開いた鉗子を置き、ゆっくりと脳から分離。線条体から残りの皮質を除去するために鉗子を使用してください。第二線条体について、この手順を繰り返します。
    6. 静かに脳から小脳の分離を容易にするために2ミリメートル小脳の輪郭によって押下する鉗子を使用してください。ただ小脳後ろ鉗子を置き、前方に鉗子を移動させることによって、それを削除します。
    7. それは脳幹に参加する場所をはっきりと見るために脳を高めるために鉗子の広い部分を使用してください。接合部に縦切開を行い、次いで脳幹を削除します。
    8. 脳の後ろに鉗子を置き、どのI4丸みを帯びた構造からなります。■。脳が完全に残りの脳から分離されるまで垂直に切開。
  2. 利用可能な組織の量に応じて、HSバッファ変数％（重量/体積）のホモジネートを調製し、 すなわち、5％の10と30mgの間の重量のためにホモジネート、30及び80 mgの間の重量で10％、および20％ 80ミリグラム以上の重量のために。
    1. ホモジネートの期待％を取得するために解剖した脳領域にHSバッファの適切な量を追加します。
    2. 渦と組織が完全にHS緩衝液に浸漬されていることを確認してください。
    3. 解剖した脳領域または頸髄ホウケイ酸ガラス管からなる組織グラインダーと二乳棒、AおよびBから調製したサンプルをホモジナイズ
    4. チューブに直接破砕されるべき各脳領域を注ぎます。チューブに乳棒Aを挿入し、それを撤回。組織を解離するために、この運動を10回程度繰り返します。次にCに乳棒Bを使用さらに20の動きで組織を粉砕ontinue。 1ミリリットルの転送ピペットで1.5mlチューブにホモジネートを転送します。
  3. 任意の未粉砕脳断片を除去するために4℃で5分間、1000×gでサンプルを遠心。 、上清を取り出し、200μlのアリコートにそれらを分割し、その後のELISA分析のために-80℃で保管してください。

ELISAによるαS4.検出

  1. 0.01 ng / mlでのコーティング抗体を希釈します。 50 mMののNa 2 CO 3 / NaHCO 3で緩衝液（pH 9.6）中の抗αSウサギポリクローナルまたはモノクローナルクローン42抗体のいずれかを使用してください。
  2. コー​​ト96ウェルマイクロプレートこの塗布液のウェルあたり100μlで、4°CO / Nに出発。検出抗体をsyn514を使用してのELISA用塗布液、クローン42、LB509、AS11、4D6または8A5で抗αSウサギポリクローナル抗体を使用してください。塗布液のような抗αSモノクローナル抗体クローン42を使用して抗pSer129αS検出抗体との組み合わせで。
    注 ：必要に応じてELISAを行う前に、プレートを、一週間、4℃に保持することができます。
  3. ウェル当たり0.05％のTween 20（PBST）でプレートをリン酸緩衝生理食塩水300μlので5回洗浄するためにプレートウォッシャーを使用してください。以降、このステップから、インキュベーションは室温です。
  4. ウェルあたりブロッキングバッファーT20200μlのPBSを追加します。 150rpmで1時間振とうします。 PBSTでプレートを5回洗浄します。
  5. （20％ホモジネートの100を、10％ホモジネート1:50及び1％BSA PBST中の5％ホモジネートの1：25希釈物1）、および各ウェルに100μlを添加する脳ホモジネートを希釈します。 150 rpmで振とうしながら2時間インキュベートします。 PBSTでプレートを5回洗浄します。
  6. 物質一覧に記載された希釈で1％BSAを含むPBSTで異なるαS検出抗体を追加します。 150rpmで1時間インキュベートします。 PBSTでプレートを5回洗浄します。
  7. アンチのいずれかを追加150rpmで振とうしながら1時間、1％BSAを補充したPBSTで8,000：-mouseまたは抗ウサギIgG HRPコンジュゲートの1に希釈しました。 PBSTでプレートを5回洗浄します。
  8. 150rpmで振とうしながら、3,3 '、5,5'-テトラメチルベンジジン（TMB）を100μlを各ウェルに溶液を加え、暗所で15分間インキュベートします。
  9. その後、マイクロプレートリーダーで450 nmの吸光度を測定し、ウェル当たり1 NのHClを100μl加えて反応を停止します。
  10. データ分析のために、分析試料のそれぞれについて測定したOD値から任意のマウス脳試料（ブランクウェル）を除くすべての試薬を用いてウェル中で得られたOD値を減算します。

5.エピトープマッピング

  1. オスマン16に記載の方法に従って、エピトープマッピングを行います。簡単に言えば、10アミノ酸重複でニトロセルロース上の12個のアミノ酸を含むヒトαシヌクレインの配列のスポットペプチド。
  2. 50mMトリス/ 150mMのNaCl緩衝液pH 1にブロック0 0.05％のTween 20および5％粉乳を含みます。 2-10°CO / Nで1mlあたり2μgの抗体の濃度でブロッキング溶液中の抗体をインキュベートします。
  3. メンブレンを50mMのヤギ抗マウスIgG HRPコンジュゲートで、0.05％のTween 20を含有するインキュベートトリス/ 150mMのNaCl緩衝液pH 10を用いて3回洗浄します。同じバッファを使用して別の5回は、その後、ウエスタンブロットTMB染色キットを用いて染色した膜を洗浄してください。

6.統計分析

  1. ODをモデル化するために混合効果回帰を実行するために、Rソフトウェアとnlmeパッケージを使用します。それぞれの比較のために、混合効果回帰モデルを実行します。無症候性の基から症候区別するために一定の効果を使用してください。
  2. 与えられたマウスのための繰り返しの変動を反映するために、ランダムな効果を使用します。残差を調べることにより等分散性を確認し、必要に応じて、ピニェイロとベイツ1に合わせて群内誤差の分散構造をモデル化するために、分散機能を使用します7。Pの有意性閾値として0.05を設定します。

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結果

本研究では、ELISAは病気のM83マウスからの高塩緩衝液中で調製脳ホモジネート中で具体的に特定疾患関連αS（αSD）を使用しました。具体的にはpSer129αSた（p = 0.0074）を認識する抗体を用い、ELISAは容易に若い（2-5ヶ月齢）、健康なM83マウス（ 図1）から（> 8ヶ月齢）古い、病気のマウスを区別します。いくつかの他の抗体は、病気のマウスからの脳ホモジネート中で同様に高い信号（> 0.6 OD）を示しました。これは、4D6（P = 0.01）、LB509（P = 0.0047）と異なるタンパク質（124から134まで、115から122のC末端部分の配列、および129から140に対する8A5た（p <0.001）の場合でありますそれぞれ）と、はるかに少ない程度に、タンパク質（P =​​ 0.0003）のN末端（2-12）に対するsyn514。さらに、C57BL / 6S（B6のαS-ヌル）の免疫化後のヒト線維性組換えαS18に対して我々の研究室で作製し、AS11モノクローナル抗体19α-SYN遺伝子...

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ディスカッション

ELISAの使用は、特にM83のトランスジェニックマウスモデルにおける疾患の間にマウス脳ホモジネートから直接αSDを検出することが実証されました。確かに、このELISAは、容易に、高塩緩衝液中で唯一の全脳ホモジネートを使用して健康なM83マウス由来の病気のM83マウスを区別することができます。

このELISAを用いて成功した結果を得るために最も重要な手順は次のとおりです。正しく解剖時の損傷を防止するために必要な手先の器用さを開発することにより、マウスの脳の異なる領域を解剖。 HSバッファに排他的にサンプルの希釈を行います。および抗体の選択は、すべての抗体は、ELISA形式で動作しますので。

αSDレベルのいくらかの変動は、それにもかかわらず、別のマウスの間明らかでした。これらの結果は、サーク島の検査で病気のM83マウスで検出された典型的なαSDパターンのウエスタンブロット検出に相当しますSer129に対する抗体で検...

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開示事項

著者には開示すべき競合する利益はありません。

謝辞

著者らは、予防接種のためのダミアン·ガイヤールに感謝し、動物実験のフォローアップしたいと思います。この作品は、ANSES（食品、環境·労働安全衛生のためのフランスの機関）によって、および財団フランスパーキンソンからの助成金によってサポートされていました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
LB509Abcamab27766検出抗体 1/2,000
AS11Ansesで製造検出抗体 1/1,000
4D6Abcamab1903検出抗体 1/2,000
PSer129Abcamab59264検出抗体 1/3,000
PSer129 EP1536YAbcamab51253検出抗体 1/1,000
syn514Abcamab24717検出抗体 1/500
クローンス42BD Biosciences610787コーティングおよび検出抗体（1/2,000）
8A5Anderson博士提供検出抗体 1/2,000
ポリクローナル抗-αsyn抗体MilliporeAB5038Pコーティング抗体
抗マウスIgG HRP共役体Southern Biotech1010-05
抗ウサギIgG HRP共役体Southern Biotech4010-05
ヤギ抗マウスIgG HRP共役体Dianova115-035-164
HSバッファーpH 7.5で調整し、4 °Cで保管
  • Tris-HCl 50 mM
Euromedex26-128-3094-B
  • NaCl 750 mM
Euromedex1112-A
  • EDTA 5 mM
EuromedexEU0007-B
  • DTT 1 mM
Sigma43815
PBSpH 7.5で調整
  • Na2HPO4 1 mM
Euromedex1309
  • KH2PO4 1.5 mM
Euromedex2018
  • NaCl  137 mM
Euromedex1112-A
  • KCl 2.7 mM
EuromedexP017
Tween 20Euromedex2001-C
BSASigmaA7906
DTT 1 mMSigma43815ストック溶液 100 mM、毒性
1% ホスファターゼカクテルPierce78428
1% プロテアーゼ阻害剤カクテルRoche04 693 132 00150倍濃縮
マイクロプレート MaxiSorpTMThermo Scientific442404
炭酸タンポン 50 mM pH 9.6
  • Na2CO3, 10H2O
Sigma713602.86 g/L
  • NaHCO3
Merk63293.36 g/L, pH 9.6
Superblock T20 PBSブロッキングバッファーPierceE6423H10倍濃縮
TMBSigmaT0440ELISAに使用
TMBAnalytik Jena AG847-0104200302エピトープマッピングに使用
HCl 1 NChimie plus40030
RibolyserThermoFast prep FP120このステップでは氷の上に保管
研削チューブBiorad355-1197
プレートウォッシャーTecanColumbus Pro
プレートリーダーBioradModel 680
低倍率拡大鏡 VWR630-10628倍拡大
Forceps Dumont#7WPI14097解剖ステップ用
Transfer pipette 1ml SamsoSamso043231
1.5 mlチューブDutscher033290

参考文献

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