方法論記事

ゼブラフィッシュ再生の分子機構を研究するためにテトンシステムの利用

10.4K 閲覧数

⸱

DOI：

10.3791/52756

⸱

2015年6月25日

 ,  , 
1Institute for Biochemistry and Molecular Biology, Ulm University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、TetONシステムを使用して、再生する成体のゼブラフィッシュの尾びれに組織特異的な遺伝子発現を達成するためのワークフローを概説します。

要約

ゼブラフィッシュは、脊椎動物の発達、生理学、病気、および組織再生を研究するための非常に重要なモデル生物となっています。関与する分子および細胞メカニズムを完全に理解するには、遺伝子発現またはシグナル伝達経路の組織特異的な操作を可能にする実験的ツールが必要です。そこで、私たちや他の人々は最近、テトラフィッシュで使用するためにTetONシステムを採用しました。TetONシステムは、時間的および空間的に制御された遺伝子発現を促進し、最近では、ゼブラフィッシュの尾びれ再生中のWnt/β-カテニンシグナル伝達の組織特異的な機能を調べるためにこのツールを使用しました。ここでは、TetONシステムを使用して、成体の再生ゼブラフィッシュ尾びれに組織特異的な遺伝子発現を誘導するためのワークフローについて説明します。これには、安定したトランスジェニックTetActivatorおよびTetResponder系統の作製、導入遺伝子の導入、およびフィン再生における組織特異的遺伝子発現の検証技術が含まれます。したがって、このプロトコルは、ゼブラフィッシュに機能的なTetONシステムを設定し、その後の使用、特にヒレの再生を研究するための青写真として機能します。

概要

ゼブラフィッシュは、開発、生理学、疾病、および再生の多くの側面を研究するための十分に確立された脊椎動物のモデル生物です。後胚生物学的プロセスのモデルとしてゼブラフィッシュの成長採用により、遺伝子発現またはシグナル伝達経路の誘導性、組織特異的な操作のための実験的なツールは、ますます重要になってきました。特に、成人のゼブラフィッシュにおける臓器や付属物の再生への研究は、これらの再生プロセスの間、シグナル伝達経路の時空間的な要件の解剖のためのツールの不足に苦しんでいます。

のCre-lox系、トランスポゾン媒介体形質転換を用いて、熱ショック誘導性導入遺伝子のモザイク発現、及びティシステム1：現在、三つの異なるシステムが成体ゼブラフィッシュの器官の再生の条件、組織特異的遺伝子発現を達成するために使用されています-3。ティトンはテトラサイクリン続きの変種を指します発現は、抗生物質テトラサイクリンまたはその誘導体、 例えば、ドキシサイクリンの存在下で活性化されたロール転写活性化システム。それまで成魚に使用されているようのCre-lox系は、その発現が空間的に組織特異的調節エレメントによって制限されているタモキシフェン制御Creリコンビナーゼ（CreERT2）に依存しています。 STOPカセットのCreドリブン除去は、全ての細胞型1でアクティブであるべきであるプロモーターによって駆動される目的の遺伝子の発現を促進します。モザイク状に発現体細胞導入遺伝子のトランスポゾン媒介性の作成は、個々の細胞系統における誘導性導入遺伝子発現のためのシステムを提供します。一般的にのみ再生臓器2の離散的な細胞系統に導入遺伝子を有するキメラ個体においてヒートショックプロモーター結果の転写制御下に目的の遺伝子を運ぶのTol2トランスポゾンとゼブラフィッシュ胚の注入。両方のシステムは、条件付き組織-SPEを可能にしながら、cific遺伝子発現、のCre-lox系は可逆的ではない、とトランスポゾンクローンの標識を使用しての戦略は、その確率的性質に苦しんでいます。このように、私たちと他の人は最近、時間的に容易に、ゼブラフィッシュで使用するためのトランスジェニックテトン·システム、および添加調整可能と可逆3-5にある空間的に制御された遺伝子発現を適応しています。

ここで使用されるティシステムは、ドキシサイクリン（DOX）誘導性転写活性化因子（改善されたリバーステトラサイクリントランスアクチベーター、irtTA、短いたTetA）は、トランスジェニックドライバ行（TetActivator）を含む組織特異的ゲノム調節配列の制御下にあります。 （ 図1A）;第二に、テトラサイクリンオペレーター（TetREのTet応答エレメント）の転写制御下で目的の遺伝子を保有するトランスジェニックレスポンダライン（TetResponder）が必要です。したがって、TetActivatorとTetResponderラインの特定の組み合わせの使用が条件付き組織特異することが可能遺伝子発現のFIC操作。

我々は最近、ゼブラフィッシュテールフィン3を再生成人におけるWnt /β-カテニンシグナル伝達の組織特異的機能を探索するためにテトンシステムを利用してきました。ここで説明したプロトコルでは、フィン再生の研究のために、特に、ゼブラフィッシュにおけるテトンシステムのセットアップおよび使用のための作業の流れを説明します。これは、安定したトランスジェニックTetActivatorとTetResponderラインと胚および成体ゼブラフィッシュにおける導入遺伝子の誘導のためのプロトコルを生成する方法の詳細な手順が含まれています。さらに、我々は、成体ゼブラフィッシュフィンの凍結切片の調製のためのプロトコルを含むフィン再生成における組織特異的遺伝子発現の検証のための技術を説明します。さらに、当社はTetActivator導入遺伝子の設計、遺伝子導入方法の選択、およびTetResponder発現の検出のための考慮事項について説明します。したがって、このプロトコルの全体的な目標は、設計図として機能しますセット·アップ機能ティシステムのゼブラフィッシュの関心の任意の組織に適用することができる条件組織特異的遺伝子発現を達成するために。

我々は、（エンハンサー断片;ワイディンガーラボのプラスミドデータベースはありません1247; 図1B）の短いゲノム調節配列を用いて、安定したTetActivatorラインのI-SceIでまたはTol2の媒介性の発生を可能にするTetActivatorベクトルを作成しました。この構築物は、単純ヘルペスウイルスのVP16トランス活性化ドメイン誘導体3F [irtTAM2（3F）]と融合リバースTetリプレッサードメインのM2突然変異体からなるTetActivatorカセットを含みます。それは、同じオープンリーディングフレームからフルオロフォアAmCyanと共発現されているのでTetActivatorエチレンテトラミン（TETA）の発現を容易に監視することができます。 1比5,6：P2Aペプチドは1で別々のタンパク質としてたTetAとAmCyanの産生をもたらすべきであるリボソームスキッピングを媒介します。構築物はまた、Tのpoylinker 5 'を含みます従来のクローニング方法を用いて、対象のゲノム調節配列の挿入を容易にするetActivatorカセット。

、細菌人工染色体（BAC）に再結合することができる（大きなゲノム領域を含む;さらに、我々は、上記のTetActivatorカセットプラスカナマイシン選択カセットからなる構築物（ 図1C。ワイディンガーラボプラスミドデータベースなし1180）作成しました通常発現パターン）導入遺伝子によって模倣される遺伝子の開始コドンに。両方の構築物は、要求に応じてワイディンガーラボから入手可能です。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

トランスジェニックTetActivator魚ラインの1世代

  1. TetActivator構築物の生成
    1. 標準的な技術を用いて、ベクトル＃1247でTetActivatorカセットの上流に関心の調節配列を複製します。あるいは、参照詳細コンビニアリングプロトコルの（TetActivatorカセット（ベクター＃1180）は、標的遺伝子の第一エキソンに挿入され、Tol2の逆方向反復配列は、BACの骨格に導入されるた、BACを生成するための組換え技術を使用し7,8）。
    2. 毒素を含まないプラスミドDNAまたは市販のキットを使用して、BAC DNA調製物を準備します。
  2. トランスジェニックTetActivator魚ラインの生成
    1. 標準的な手順9に記載TetActivator構築物のマイクロインジェクションを実行します。
      1. 一緒TOL2の TRAのためのキャップされたセンスRNAをコードして1細胞期胚に25〜50のプラスミドDNAのPGまたは最大250のPGのBAC DNAを注入トランスポゾン媒介遺伝子導入のための、またはI-SceI制限酵素媒介性の遺伝子導入のためのI-SceI制限酵素タンパク質とnsposase。
        注：遺伝子導入方法の選択の考察は、議論のセクションで見つけることができます。
        注：DNAが細胞質中に送達されていない場合に遺伝子導入の効率が低下するかもしれないので、細胞質ではなく、卵黄に好ましくは注入します。
    2. 成人期に注入G0胚を上げます。必要に応じて、画面G0のAmCyan蛍光のための胚および優先的には、所望の発現パターンを示す胚を成長させます。これはTol2の媒介性の遺伝子導入に特に生殖系列伝達の速度を増加させる可能性があります。
    3. （例を図1Dに示されている）は、蛍光実体顕微鏡を用いて、野生型の魚とF1胚または幼虫における予想される発現パターンのAmCyan蛍光の出現に、個々のG0魚を異系交雑することによって成功した生殖系列の統合を評価します。
    4. 蛍光陽性上げF1胚を成体と安定したF2トランスジェニック魚を得るために、野生型の魚で、それらを結合するように。
    5. 個々の行は、発現レベル、発現パターン、TetResponderライン、漏出を誘導する能力、およびサイレンシングに対する感受性が異なる場合がありますので、上げ、異なるG0の創始魚に由来する少なくとも3つの異なる亜系統を特徴づけます。
      注：確実に胚で発現している多くの導入遺伝子が部分的または完全に後期の幼虫や成魚にサイレンシングされています。ラインは成魚で使用されることを意図している場合したがって、成人期の間にそれらのTetActivatorの発現および機能のために、いくつかの独立した系統を特徴づけます。
      注：私たちは、表1に列挙されている両方の胚および成魚、中TetActivatorの組織特異的発現のためのTetActivator株のパネルを生成したこれらの行は、要求に応じてワイディンガーラボから入手可能です。

トランスジェニックTの2世代etResponder魚ライン

注：私たちはTetResponderリクエストに応じワイディンガーラボから入手可能である、安定したTetResponderラインのI-SceIでまたはTol2の媒介性の発生を可能に構築する生成した（ワイディンガーラボのプラスミドデータベースなし1444; 図1E）。この構築物は、目的の遺伝子とYFP誘導体YPetコード配列のコード配列（CDS）の挿入を容易にするポリリンカー領域に続いてテトラサイクリンオペレーターが含まれています。したがって、構築物はYPetと目的のタンパク質のC末端融合のたTetA媒介発現のために設計されています。タグ融合タンパク質の発現を回避する必要がある場合には、P2AまたはT2Aペプチドは別々のポリペプチドとして、6,10及びYPet関心のタンパク質の同時発現を促進する関心CDSの遺伝子に導入することができます。

  1. TetResponder構築物の生成
    1. テトラサイクリンオペレーターの「関心3の遺伝子のクローンCDS5 YPetのCDSの 'が標準的な手順に従いました。終止コドンは、関心のCDSの遺伝子から除去されたことを確認してください。
    2. 市販のキットを使用して毒素を含まないプラスミドDNA調製物を準備します。
  2. トランスジェニックTetResponder魚ラインの生成
    1. TetResponderのマイクロインジェクションを行う標準的な手順9に記載の構築物。
      1. トランスポゾン媒介遺伝子導入のための、またはメガヌクレアーゼ支援遺伝子導入のためのI-SceI制限酵素酵素とTOL2トランスポザーゼのためのキャップされたセンスRNAをコードと一緒に1細胞期胚の細胞質へのプラスミドDNAの25〜50頁を注入します。
        注：遺伝子導入方法の選択の考察は、議論のセクションで見つけることができます。
        注：DNAが細胞質中に送達されていない場合に遺伝子導入の効率が低下するかもしれないので、細胞質ではなく、卵黄に好ましくは注入します。
    2. に注入G0胚を上げますdulthood。
    3. F1胚またはF1幼虫のドキシサイクリン処理に続いて、以前に確立TetActivatorラインで個々のG0魚を交配することにより、導入遺伝子の成功した生殖系列の統合と誘導能を評価します。
      注：この行は、胚および成体ではかなりユビキタス発現を駆動するように、機能TetResponderキャリアをスクリーニングするためにエチレンテトラミン（TETA AmCyan 3：irtTAM2（3F）-p2a-AmCyan ulm2、短いユビキチンユビキチン ）通常、我々は、 ユビキチンプロモーター駆動TetActivatorラインを使用します魚、したがっては、関心のある全ての組織でTetResponder誘導能を評価するのに非常に適しています。この行は、要求に応じてワイディンガーラボから入手可能です。
    4. E3胚培地を含む別個の10センチメートルシャーレに各クラッチの胚を収集する（材料表を参照）、28.5℃で皿をインキュベートします。
    5. 個々の番号のタンクに胚が得られた場所のG0の魚（飼育箱を、材料の表を参照）胚は画面されるまでエド。これは、導入遺伝子の生殖系列伝達を示すG0魚の回収を可能にします。
    6. 胚の半分だけがTetActivator導入遺伝子を運ぶことが予想される場合（場合にヘテロ接合TetActivatorキャリアはTetResponderの創設者の魚と交配された）、適切な発達段階でAmCyan蛍光の出現によってTetActivator導入遺伝子を含む胚を選択。
    7. 2.3節で説明したように、ドキシサイクリン（DOX）で胚を処理することによりTetActivator転写活性を誘導します。
    8. YPet蛍光の出現の画面F1胚。それは、クラッチで胚が予想される発現ドメインと個々の胚の間にほとんど変化の中に少しモザイクが表示されるはずである、均質なYPet式を生成ライン（G0魚を）好みます。代表的な例については、図1Fおよび図1Gに矢じりを参照してください。
    9. で同定された誘導性TetResponder導入遺伝子を送信メイトG0の魚野生型の魚とステップ2.2.8および成人期にすべてのF1胚を発生させます。
    10. （セクションを参照するか（2.5節を参照）F2胚およびYPet蛍光の出現のDOX処理を行っTetActivatorラインに個々のF1魚を交配することによって、PCRベースのジェノタイピングのいずれかによって、成人F1トランスジェニック魚を識別します。
    11. 誘導性は、個々の行に異なる場合がありますので、異なるG0の創始魚に由来する少なくとも3つの異なるTetResponderサブラインを確立し、特徴づけます。特定の達成可能な発現レベルのと異なる場合があります応答者が全ての細胞型で活性化することができるかどうか。また、サイレンシングに対する感受性はラインの間異なります。最後に、いくつかの場合には、ドキシサイクリンの非存在下でTetActivatorラインとの組み合わせで製造さ漏出性発現が発達障害または毒性を引き起こすことが予想される場合は特に、目的のタンパク質の中程度の発現レベルを仲介する行を選択することが好ましいかもしれません。
      注：テト胚において確実に誘導されているレスポンダ線が部分的または完全に後期の幼虫や成魚にサイレンシングすることができます。ラインは成魚で使用されることを意図している場合したがって、いくつかの独立した系統は、成人における誘導能について特徴付けされるべきです。目的の遺伝子の誘導はさらなる発展と互換性がある場合は、胚におけるGOIの発現を誘導するために、最も堅牢で少なくともモザイクを示す個体だけを選択し、高めるために、二重トランスジェニック胚（TetActivatorがTetResponderをX）を作成するのに有用であることが証明されました誘導。
    12. ）を維持し、2.5節で説明したように確立されたTetResponder株、遺伝子型の成魚を伝播します。
  3. 胚のドキシサイクリン処理
    1. 2,000xドキシサイクリン（DOX）の株式を準備します。を50mg / mlの（97ミリモル）の濃度を達成するために、50％EtOHにDOXを解きます。店舗DOXストックを-20℃で光から保護します。
    2. 胚からE3媒体の大部分をデカントし、それを置き換えます25 / mlのDOX（50ミリリットルE3あたり2,000x DOXの株式の2.5μL）の最終濃度でDOXを含むE3胚媒体。 Dechorionationは必要ありません。
    3. YPet蛍光の出現によって、目的のタグ付けされた遺伝子の発現を評価する前に、6時間の最低28.5℃に胚を返します。
    4. 溶媒のみEtOHで胚を処理することによりTetActivator / TetResponderの組み合わせの漏出を評価します。
      注：TetResponderのmRNAを検出するためのin situハイブリダイゼーション （ISH）、またはRT-PCR では 、目的のタグ付けされた遺伝子の蛍光よりも漏出のより敏感な尺度として使用することができます。漏出の程度は、特定のTetActivator / TetResponderラインの組み合わせに依存し、それが組織や発達段階の間でも異なる場合があります。
  4. 大人のゼブラフィッシュの麻酔
    1. 直径10cmのペトリ皿または1 mg / mlのトリカイン（エチル3-アミノベンゾエートmethanesuを含む魚系の水で満たされた小さなビーカーを準備lfonate、MS-222）。
    2. 麻酔薬を含む容器に魚を移し、完全な平衡の損失（魚は、その側にある）、ない動きや11にタッチすることに応答なしで示したように、それは麻酔のレベル4になるまで待ちます。
    3. 慎重に（セクション3.2を参照）、スライドガラス上にプラスチックシャーレ、またはアガロースでコーティングされたシャーレの蓋をピンセットを用いて、魚やスプーンを転送し、フィン切断または撮影を行います。
    4. 鮮魚システム大量の水を容器に魚を戻し、それを監視します。鰓の動きが3分以内に再開されない場合は、プラスチック製のトランスファーピペットを用いて鰓に水を吹き付けてアシスト。
  5. TetResponder魚のPCRベースのジェノタイピング
    1. テールフィン12の部分的な切断を実行します。個々の、番号付きタンクに魚を置き（飼育箱、 材料の表を参照）。これが成功したジェノタイピング以下、トランスジェニック魚の回収を可能にします。
    2. トラ96ウェルPCRプレートは、ゲノムDNA 13の単離のための20μlのDNアーゼを含まない水を予め充填された個々のウェルにフィン組織nsfer。
      1. 各ウェルに120μlの1 MのNaOHを添加し、サーマルサイクラーを用いて95℃で20分間サンプルをインキュベートします。
      2. 4°Cまでチル試料を、各ウェルに1 MのTris-HCl（pH8.0）を14μlを添加し、短時間ボルテックスサンプル。 16,000×gで5分間遠心サンプルは、細胞破片をペレット化します。必要になるまで4℃でゲノムDNAを保管してください。
    3. 設計プライマーは特にTetResponder導入遺伝子の断片を増幅しました。標準的なPCR反応で単離されたDNAの2μLを使用し、アガロースゲルでPCR産物を分析します。

アダルトリジェネゼブラフィッシュテールフィンにおける導入遺伝子発現の3組織特異的誘導

  1. TetActivatorの確立;二重トランスジェニック魚TetResponder
    1. TetResponder CARRIでTetActivatorキャリアメイトERS。
    2. TetActivatorカセットを駆動する調節要素がアクティブなときに発生段階でTetActivator導入遺伝子を保有する選択した胚。トランスジェニック胚は容易に立体蛍光顕微鏡を用いてAmCyan蛍光の出現によって同定することができます。
      注：TetActivator導入遺伝子陽性の魚は、あるいは、例えば、麻酔した魚の撮像によって、成人期に識別することができます。尾びれの切断と再生成中AmCyan蛍光の出現以下。
    3. 成人期に選択した胚を上げます。
    4. 目的の組織にTetResponderの発現を誘導する能力によって、PCRベースのジェノタイピングまたは（好ましくは）によって（TetActivatorに加えてTetResponderを運ぶ魚）ダブルトランスジェニック成魚を特定します。再生テールフィンでTetResponder誘導および検出のためのプロトコルは、セクション2.3とセクション4に記載されています。
      注：一過TetResponder式に互換性がある場合さらに、胚または幼虫の発育と、それは上記のように、胚発生の間DOX処理後TetActivatorとTetResponder導入遺伝子を保有する二重トランスジェニック胚を同定するのに有用である（2.3節、 図1H）。二重陽性胚はAmCyanとYPet蛍光を表示します。成人期に正の胚を上げます。
  2. ゼブラフィッシュテールフィンの切断と再生フィンにおける導入遺伝子発現の誘導
    1. 麻酔魚の尾びれの部分的な切断を行う12（2.4節を参照）。 DOXのいずれかすぐに魚を治療または魚ハウジングシステムに戻します。
    2. 飼育箱の準備（ 図2A;材料の表を参照）（魚のシステム水1リットルに2,000x 50 mg / mlのストックの500μlを添加する）を25μg/ mlのDOXを含む魚系水1Lを充填しました。
      注：すぐに切断した後、導入遺伝子発現の誘導は、を可能にします再生時の初期の事象に影響sessment、3日目の誘導後に切断（3 DPA）は、回生成長中に導入遺伝子の発現または機能を評価するために使用されるべきです。
    3. 魚が逃げることができないように蓋（ 図2A）で飼育箱やクローズボックスに10以前に切断し、二重トランスジェニック魚まで移します。
    4. ストレスを軽減するために暗いに飼育箱を置きます。私たちは通常、一定の暗さと温度を確保するために28.5℃の空気インキュベーターにボックスを配置します。
    5. エタノールのみ（1L魚系の水あたり250μl）を用いて、陰性対照二重トランスジェニック魚を扱います。
      注：私たちは、フィンの再生にここで使用されるDOXの用量の影響を観察したことがありませんが、DOXで処理されたシングルトランスジェニックまたは野生型の魚は、追加の陰性対照として使用することができます。
    6. 湿ったアガロースでコーティングされたペトリにセクション2.4と転送ピンセットを使用して魚やスプーンで説明したように魚を麻酔皿。慎重にピンセットを使用して、尾びれを広げます。
    7. 蛍光立体顕微鏡を使用して再生成内YPetの出現のためのスクリーンの魚（ 図2B）。
      注：通常、TetResponder駆動型蛍光が確実にDOX処置の6時間後に観察することができます。しかし、生成された各ラインについてTetResponder発現のダイナミクスを特徴づけることをお勧めします。
    8. TetResponder導入遺伝子誘導を終了したり、治療を継続する魚ハウジングシステムに魚を返します。
      注：処置は> 24時間（長期治療）のために、水を交換し、徹底的に毎日の飼育箱をきれいにすることが不可欠です。
    9. 長期治療中に、供給した後、飼育箱に戻す前に、新鮮な魚系水できれいな容器に魚を転送することにより、2〜3日ごとに魚を食べます。

フィン再生成でTetResponder発現の4キャラクタリゼーション

T ">注：私達は通常3 DPAで凍結切片の蛍光イメージングを使用して、フィン再生尾部に組織特異的な遺伝子発現を確認し、この時点で再生成の異なる組織区画を形成していると明らかに組織切片上で識別することができます。および凍結切片は、再生の後の段階でより単純である。 図2Cは、再生成に区別することができる組織のドメインを示し、これらのドメインのためのいくつかの分子マーカーを示しています。以下のプロトコルは、直接イメージングまたは免疫染色のために縦または横凍結切片の調製を記載します。

  1. 大人のテールフィンの凍結切片
    1. そのテールフィンのセクション3.2で説明したようにDOXと3 DPAまで2 DPAから切断された魚を扱います
    2. 2.4節で説明したように魚を麻酔
    3. 優しくプラスチックシャーレの蓋の上に魚を転送するためにスプーンやピンセットを使用してください。
    4. 約4-5骨セグメントでフィン再生成を再切断しますSメスを使用して初期切断面に近接し、新鮮な魚のシステム水に魚を戻します。
    5. 慎重転送は1Xリン酸緩衝生理食塩水で4％（w / v）のパラホルムアルデヒド（PFA）を含む小さなペトリ皿（ 例えば、35ミリメートル）で再生する（PBS;材料の表を参照）、微細ピンセットを用いて。再生成が、組織の唯一の切り株部分には触れないでください。
    6. シャーレの底に平らな組織を置き、4℃でO / Nを固定します。
    7. 洗浄は、PFAを除去し、骨基質を脱灰するO / N 0.5 M EDTA-PBS（pH7.5）を4℃で再生成をインキュベートし、0.1％のTween（PBT）を含む1×PBSで2回再生します。
    8. 10％スクロースのPBS、20％スクロースのPBS、30％スクロースのPBSおよび30％RTで再生成をインキュベートスクロース-PBS：1での組織凍結培地：1の比率、30分ごとに（TFM材料の表を参照）。続いて、組織凍結培地中> 2時間、4℃でフィンをインキュベートします。
    9. 顕微鏡スライド上cryomoldsを置き、フィル組織凍結培地でM。気泡を導入することは避けてください。
    10. 転送は、フィン再生成（ 図2D）の縦または横方向のセクションを得るために適切にcryomoldsオリエント組織に再生します。その再生成を確認切片容易にする、直線状です。
    11. 転送は、凍結プロセス（ 図2D）を開始するためにドライアイスのベッドの上に位置する金属ラックに顕微鏡用スライドと一緒にcryomolds。
    12. 組織凍結培地が固体になった後、ベンチにcryomold置き、培地を凍結組織は、プラスチック媒体の界面で解凍するように、数分間室温で放置します。
    13. cryomoldから凍結ブロックをプッシュするペンまたは同様のを使用してください。組織切片まで-80℃でのボックスに保管してcryoblocks。
    14. （材料の表を参照）クライオミクロトームを用いて、10〜14ミクロンの厚さの凍結切片を作成し、接着顕微鏡スライド上のセクションを収集します。 NEまで-20℃で保存スライドeded。
  2. YPet蛍光に基づいて、フィン切片上TetResponder発現の特徴
    1. PBTで室温で2回洗浄し、PBSで1回洗浄、それぞれ5分間、続いて顕微鏡スライドへの付着を改善するために、-20℃に冷却し、100％のMeOHで30分間フィンのセクションを扱います。
    2. 2回の洗浄を10分間PBS中でそれぞれが続く：PBS中の4で10分 '、6-ジアミジノ-2- phenylinodole（DAPI）（5000 1）インキュベートするセクションによって核を可視化。
    3. 75％のグリセロール、PBSまたは市販の抗退色マウントでマウントセクション、カバースライドでカバーしています。
    4. 画像YPetおよび共焦点または広視野蛍光顕微鏡下でAmCyan蛍光（ 図1E）。
      注：一緒に、抗GFP（YPetと反応するが、AmCyanない）抗体を用いて、細胞型特異的抗原に対する抗体でYPet、免疫蛍光法または免疫組織化学を発現する細胞タイプの明確な同定を容易にするために行うことができます。代替的に、弱いYPet発現の検出を容易にするために、YPet RNAに対するin situハイブリダイゼーション RNAのいずれかの全体マウントフィン又はフィンのパラフィン切片上で行うことができます。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

組織特異的な誘導性遺伝子発現、トランスジェニックTetActivatorとTetResponderラインのための機能テトンシステムを確立するために生成された（ 図1A）する必要があります。初期のゼブラフィッシュ胚およびその後の生殖系列の統合に構築またはTetResponder（ 図1E） -これはTetActivator（C図1B）を微量注入することによって達成されます。機能TetActivator構築物のいずれか、または目的の遺伝子（ 図1C）の調節エレメントを含むBACにTetActivatorカセットを再結合することによってTetActivatorカセット（ 図1B）の上流の短い調節配列（エンハンサーエレメント）をクローニングすることによって生成することができます。 TetActivator構築物の生殖細胞系列の統合は、個人が予想される発現パターン（ 図1D）にG0魚とF1胚におけるAmCyan蛍光の出現を注入異系交雑することによ...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

大人のゼブラフィッシュは、正常に多くの内臓や付属を再生する驚くべき能力を持っています。関与する分子·細胞メカニズムの完全な理解は、遺伝子の機能とシグナル伝達経路の組織特異的な分析が必要です。この方に、ティトンシステムは、胚および成体ゼブラフィッシュにおける時空間的制御遺伝子発現のための効率的なツールを提供します。この原稿に記載されテトン·システムの構成および方法論は成功し、我々の研究室3の最近の研究で使用されてきました。テトンシステムを確立するときに、次の追加の問題を考慮する必要があります。

TetActivator導入遺伝子の設計上の考慮事項

我々は以前、私は、単純ヘルペスウイルスのVP16トランス活性化ドメイン誘導体3F [irtTAM2（3F）と融合させ、逆TetリプレッサードメインのM2突然変異体からなるその単一の誘導性TetActivatorを示していますnは短いたTetA-M2]効率的な誘導を付与するが、低表示することができ、測定可能な漏出はいえ、それがドキシサイクリン

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者らは、開示することは何もありません。

謝辞

著者は、技術支援のためのクリスタハーゼ、ドリス·ウェーバーとブリジットKorteの感謝します。ワイディンガーラボでの仕事はドイツ学術協会WE 4223 / 3-1の補助金によってサポートされ、4223 / 4-1とドイツゲゼルシャフトエリーゼKardiologieオスカー·ラップ·Stipendiumを経由し、クラウス·ゲオルクウント·Sigrid-によりWE Hengstberger-Forschungsstipendium。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ブリーディングボックスアクアシュワルツアクアボックス 1
化合物蛍光顕微鏡(例:ライカ、ツァイス蛍光組織切片を画像化するためにメーカーによって異なります
共焦点顕微鏡(例:ライカ、ツァイス蛍光組織切片を画像化するためにメーカーによって異なります
クライオスタット(例:ライカ、サーモサイエンティフィック)は、クライオセクショニングの
4', 6- ジアミジノ-2-フェニルイノドール (Dapi)Sigma-AldrichD9542核の可視化に PBS
で 1/5,000 を使用
ドキシサイクリンSigma-AldrichD9891のために 50% EtOH で 50 mg/ml (97 mM)
でストックを調製
PBS中の4%(w / v)パラホルムアルデヒド、固定用pH 7.5
1xホスファット緩衝生理食塩水(PBS)1.7 mM KH2PO4、5.2 mM Na2HPO4、150 mM NaCl、 pH 7.5
1x Phosphat-buffer saline + Tween 20 (PBT)1x PBS with 0.1% Tween 20
Superfrost Ultra Plus 接着顕微鏡スライドThermo Scientific 組織切片の収集のための1014356190
実体蛍光顕微鏡(例:ライカ、ツァイス蛍光ベースのジェノタイピングについてはメーカーによって異なります
サーモサイクラー(例:Biorad、Applied Biosystems)、PCRベースのジェノタイピングについてはメーカーによって異なります
組織凍結培地(TFM)Triangel Biomedical SciencesTFM-C埋め込み用サンプル
トリカイン(L-エチル-m-アミノ-安息香酸-メタンスルホン酸/ MS-222)Sigma-AldrichE10521麻酔用
E3胚培地で1 mg / mlで使用
) )は、メーカー TetResponder 誘導パラホルムアルデヒド (PFA) Sigma-Aldrich P6148 します。) は 組織

参考文献

  1. Fang, Y., et al. Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13416-13421 (2013).
  2. Tryon, R. C., Johnson, S. L. Clonal analysis of kit ligand a functional expression reveals lineage-specific competence to promote melanocyte rescue in the mutant regenerating caudal fin. PloS one. 9 (7), e102317(2014).
  3. Wehner, D., et al. Wnt/beta-catenin signaling defines organizing centers that orchestrate growth and differentiation of the regenerating zebrafish caudal fin. Cell Rep. 6 (3), 467-481 (2014).
  4. Huang, C. J., et al. Conditional expression of a myocardium-specific transgene in zebrafish transgenic lines. Dev Dyn. 233 (4), 1294-1303 (2005).
  5. Knopf, F., et al. Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).
  6. Provost, E., Rhee, J., Leach, S. D. Viral 2A peptides allow expression of multiple proteins from a single ORF in transgenic zebrafish embryos. Genesis. 45 (10), 625-629 (2007).
  7. Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nat Protoc. 6 (12), 1998-2021 (2011).
  8. Bussmann, J., Schulte-Merker, S. Rapid BAC selection for tol2-mediated transgenesis in zebrafish. Development. 138 (19), 4327-4332 (2011).
  9. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. (27), (2009).
  10. Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6 (4), e18556(2011).
  11. Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 53 (2), 192-204 (2012).
  12. Hyde, D. R., Godwin, A. R., Thummel, R. In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin. J Vis Exp. (61), (2012).
  13. Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43 (5), 610(2007).
  14. Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
  15. Suster, M. L., Kikuta, H., Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system. Methods Mol Biol. , 56141-56163 (2009).
  16. Grabher, C., Wittbrodt, J. Meganuclease and transposon mediated transgenesis in medaka. Genome Biol. 8, Suppl 1S10. (2007).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

Wnt

関連記事