ヒト好中球における細胞外DNAのリリースおよび定量NET形成のハイスループット測定インビトロ

サマリー

ハイスループットアッセイが提示され、組み合わせてヒト好中球からのNET放出を定量するための優れたツールを提供します。

要約

好中球顆粒球は、ヒトの血液中で最も豊富な白血球です。好中球は、感染部位に最初に到着します。好中球は、食作用、脱顆粒、好中球細胞外トラップ(NET)の形成など、いくつかの抗菌メカニズムを発達させました。NETは、ヒストンで装飾されたDNAスキャフォールドと、ミエロペルオキシダーゼ(MPO)やヒト好中球エラスターゼ(HNE)などのいくつかの顆粒マーカーで構成されています。NET放出は、好中球の特徴的な形態学的変化が関与する活発なプロセスであり、好中球のDNAが細胞外空間に排出されます。NETsは微生物と戦うために不可欠ですが、NETsの制御されていない放出はいくつかの障害と関連しています。NET形成の臨床的関連性とメカニズムについて詳しく知るには、NET定量が可能な信頼性の高いツールが必要です。

ここでは、in vitroでヒト好中球からのNET放出を評価できる3つの方法が紹介されています。1つ目は、膜不透過性DNA結合色素を用いてヒト好中球からの細胞外DNA放出を測定するハイスループットアッセイです。さらに、NET特異的なMPO-DNAおよびHNE-DNA複合体のレベルを測定することによりNET形成を定量できる他の2つの方法が記載されている。これらのマイクロプレートベースの方法を組み合わせることで、ヒト好中球のNET形成のメカニズムと制御を効率的に研究するための優れたツールが提供されます。

概要

NET形成は、好中球が病原体と戦うための新しいメカニズムです。¹ NETsの中核は核DNAです。¹ このDNAネットワークは、好中球顆粒タンパク質およびヒストンと関連しています。¹ NET形成の主な形態は、クロマチンの脱縮合、顆粒膜および核膜の消失、好中球エラスターゼの核への転座、ヒストンのシトルリン化、そして最終的にはDNAベースのNETの流出を特徴とする好中球の死を必要とします。² NETは、さまざまな微生物を捕捉して殺すため、自然免疫兵器のレパートリーに欠かせない存在です。しかし、制御されていないNET形成は、多くの自己炎症性疾患に関連しています。^3,4 NETリリースの関連性がますます確立されているにもかかわらず、NETリリースのメカニズムと規制についてはほとんど知られていません。

NETを放出して死ぬ好中球は、アポトーシスまたは壊死性の好中球とは異なります。^3、5 NET放出好中球は、NET形成に特徴的ないくつかの特徴を示します。顆粒成分はNETのDNAと関連しています。¹ ミエロペルオキシダーゼ(MPO)とヒト好中球エラスターゼ(HNE)は、どちらも静止細胞の初代顆粒に見られますが、NETのDNAに結合するために核に転座します。¹ MPO-DNAおよびHNE-DNA複合体はNETに特異的であり、アポトーシスまたは壊死性の好中球では発生しません。^1,3,5 クロマチンの縮合もNETosisの特徴です。² NETのリリースには、ペプチジルアミニダーゼ4(PAD4)によるヒストンのシトルリン化も必要です。⁶ シトルリン化ヒストンは、NET放出を受けた好中球の特徴です。⁶

ここでは、高スループットスケールでNETを定量するための優れたツールを提供する3つの方法を紹介します。最初のアッセイは、さまざまな変更を加えてフィールドで使用され、マイクロプレート形式で細胞外DNAの放出を定量します。2番目と3番目のアッセイでは、NET特異的なMPO-DNAおよびHNE-DNA複合体を測定することにより、NETを確認します。

プロトコル

ジョージア大学の治験審査委員会は、健康なボランティア（UGAの＃2012-10769-06）から末梢血を収集するために、ヒト対象の研究を承認した^。5,7,8ボランティアは、採血前に必要なインフォームドコンセントフォームに署名しました。この記事で行った研究は、ヘルシンキ宣言のヒトを対象とする医学研究のための倫理ガイドラインに準拠しています。

末梢ヒト血液からの好中球の1の単離（図1）

注：末梢血から好中球を分離する方法はいくつかあります。以下のプロトコルは、一つの可能​​性を提供します。このプロトコルは、外部刺激によりネットを放出することができる非活性化ヒト好​​中球を大量に得られます。 40ミリリットル静脈穿刺することにより、健康なボランティアから得た全血を使用してください^。7,9

1. 2 50mlコニカルチューブに小分けし20ミリリットルの血液。 10ミリリットル6％デキストランを追加します。穏やかに混合します。
2. 20分には、白血球RICを転送した後、きれいな50mlコニカルチューブに任意のペレット化赤血球を取り、滅菌PBSでそれを埋めることなく、時間上相。
3. 400×gで10分で遠心分離します。 4ミリリットル滅菌PBSで再懸濁ペレット。
4. コニカルチューブと各勾配の上の層2ミリリットルの白血球サスペンション2 15mlに85％-80％-75％-70％-65％の5段階パーコール勾配を準備します。
5. ブレーキをオフにした状態で30分間遠心分離800×gで。
6. 80分の75％〜70％/ 75％の界面で層内のすべてのセル（好中球）を収集します。
7. （350×gで、10分、RT）PBSで2回細胞を洗浄し、血球計数器を用いて細胞数を計測します。

マイクロプレート蛍光光度計を用いて細胞外DNA放出動態の2.測定

注：この方法は、96ウェルマイクロプレート形式でのDNAの放出（ 図2）を示し、膜不透過性DNA結合色素の蛍光の変化を測定することができます。

1. アッセイ培地中で好中球の懸濁液を調製（HBSS +2×10 ⁶細胞/ mlの濃度で1％（v / v）の自己血清+ 5mMグルコース）。
2. 膜不透過性DNA結合色素の5マイクロモル/ Lを追加します。穏やかに混合します。
3. 小分けしたヒト好中球（50μL/ウェル）を96ウェル黒色、透明底の上にマイクロプレート。アッセイ培地は、ウェルの底部全体を覆っていることを確認してください。ない場合は、サイドを軽くプレートをタップします。
4. 37℃で10分間、好中球を含むプレートをウォームアップ。
5. その間に（37°C暖かいアッセイ培地中で）使用するそれらの最終濃度の二重で刺激の溶液を調製します。ポジティブNETコントロールは最大NETの放出を誘発するために4時間100nMのホルボールミリステートアセテート（PMA）でヒト好中球を使用するように自発的なNET形成が低い^5,8をまま。4時間^5,8 PMA刺激は、最大NETのリリースを保証します。
6. 測定用のマイクロプレート蛍光光度計（4時間、37℃、励起および発光のための590 nmの530 nm）を準備します。
7. 50μlの好中球懸濁液に50μlの刺激溶液を添加することによって、好中球を刺激します。最大のDNA解除信号を測定するための1つのウェル中の0​​.5μg/ mlのサポニンを使用してください。
8. リーダーにプレートを置きなしに振盪しながら、2分毎に4時間蛍光の変化を測定します。
9. データ解析のために、経時的な蛍光の正規化された増加を計算します。
   1. サポニンを含むすべてのウェルのエンドポイント値から減算基準蛍光（ 図2A、B）。サポニン蛍光の上昇が最も高い信号でなければなりません。これは、「最大のDNAの放出」（ 図2A）と呼ばれます。
   2. 最大のDNAの放出により、未知の試料の蛍光の増加を分割することによって、未知の試料中のDNAの放出の割合を計算します。
   3. 反復試験の平均結果とは、「最大のDNA放出の％」（ 図2C）としてそれらを提示します。

NETフォームの3定量MPO-DNAとHNE-DNA ELISAアッセイによってエーション

注：私たちの研究室でこれらの修飾されたアッセイ（MPO-DNA）または（HNE-DNA）を設立は、MPO-DNAとHNE-DNA複合体のレベルを測定することにより、NET形成を定量^5。

1. コー​​ト96ウェル高結合一晩捕捉抗体（50μL/ウェル）容量ELISAプレートを抗MPO（1：2,000希釈）または抗HNE（1：2,000）。
2. PBSで洗浄ELISAは、プレートを三回（200μL/ウェル）、室温で2時間、5％BSAおよび0.1％ヒト血清アルブミンでそれらをブロックし（200μL/ウェル）。 PBSで3回洗浄します。
3. 種子上で96ウェルマイクロ100μl/ウェルのアッセイ培地中100,000細胞の密度で、好中球、およびNET形成を刺激します。細胞をインキュベート：37°Cで4時間。
4. 好中球の上清に2 U / mlのDNアーゼを添加することにより、限られたDNase消化を行い、それらをよく混ぜます。室温で保管してください。
5. 11μlの25 mMのEGTA（最終濃度2.5 mMの）を添加することによって15分後にDNアーゼを停止します。よく混ぜます。 suコマンドを収集きれいな微量遠心管でpernatants。スピン試料は、室温で5分間、300×gで細胞破片を取り除くために。きれいなマイクロチューブの中にそれらの上清を移します。準備が整うまで氷上で保管してください。
6. 先に調製した「NET標準」のアリコートを使用してください。
   注：NET-標準は、少なくとも5つの異なる、独立したヒトのドナーから採取PMA刺激好中球のDNアーゼ消化上清のミックスです。
   1. 長い間、同じ規格を使用するには、各個々のドナーからの好中球の上清を大量に収集し、分取。例えばPMA刺激好中球のDNアーゼ消化上清の2ミリリットルを収集する200 ELISAプレートのための十分な200アリコート（10μlの各）になります。 NET規格を特徴付けるデータは、 図5に見られます。
   2. 4時間100nMのPMAでヒト好中球を刺激し、ステップ3.4から3.5記載のそれらの上清にDNアーゼダイジェストを適用します。
   3. 収集し、プール、アリコート（10μL）および無料ZE（-20°C）、好中球の上清。
   4. 少なくとも5つの別々のドナーから得られた1つのアリコート/ドナー解凍、「標準NET」を作製するには、それらを混合し、氷上で保管してください。
   5. 解凍したサンプルを破棄し、次の実験のために新鮮なものを使用します。
   6. PBS + EGTAでNET-標準の2連続希釈：1を準備します。
7. DNase1消化サンプル（標準および未知の上清）をPBS + EGTAで20倍に希釈し、捕捉抗体でコーティングしたELISAプレート上に分注し。
8. 4°Cで一晩ELISAプレートをインキュベートし、PBSでそれらを3回洗浄します。
9. 検出抗体溶液を適用し（100μl/ウェル）：ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗DNA抗体（1：500、マウス）。暗所で1時間インキュベートします。
10. 100μl/ウェル、30分：PBSで4回洗浄した後、TMBペルオキシダーゼ基質を追加します。ブルー着色はペルオキシダーゼ活性（現在のNET）の指標です。
11. 100μl/ウェルの1MのHClを加えて反応を停止します。ザ青のソリューションは、黄色（ 図5A）を回します。
12. マイクロプレート光度計を用いて450nmでの吸光度を読みます。
13. データ分析のために、NETの標準と比較して、MPO-DNAまたはHNE-DNA複合体の量を計算します。
    1. すべてのサンプルからのアッセイ培地のバックグラウンド光学密度値を差し引きます。
    2. それらの相対的なネットコンテンツ（Y軸）（ 図5A）に対して希釈標準試料の吸光度値（X軸）のプロット。
    3. この標準曲線の非飽和範囲を使用すると（ 図5A）（使用したソフトウェアから最良指数フィットを使用）トレンドラインを確立します。このトレンドラインの式はのNETの定量的な量にOD値の変換を決定します。
    4. NET-標準（ 図5A）の割合として未知試料中のNETの量を与えます3.13.3からのトレンドライン式に未知数の測定OD値を挿入します。
    5. 計算複製（三重）の平均値と（ 図5C）「MPO-DNAまたはHNE-DNA複合体（標準の％）の量」として、最終的なデータを提示します。

結果

この原稿の図では、好中球の分離、実験手順、およびデータ分析の説明に存在する代表的な結果の方法を説明する。 図1は、ヒト好中球の準備の逐次工程を示しています。このプロトコルは、好中球の分離の唯一の1つの可能な方法を表しています。これは、刺激の際にネットを放出することができる好中球を休んを大量に生み出す。蛍光ベースのDNA放出アッセイがどのように機能するかを図2に示す図 。ヒト好中球におけるDNAリリースの蛍光マイクロプレートリーダー動態は、96ウェルマイクロプレートに続いている使用。 図3は、データ分析の各ステップを説明します。まず、サポニン（ 図3A）で処理された好中球の最大のDNA信号を計算します。蛍光の増加は、常に最高の蛍光値とバックグラウンド蛍光レベル（の間の差として計算されますPで活性化したままに示しています緑膿菌 （PAO1）（ 図3B）...

ディスカッション

ネットは好中球が病原体を殺すことにより、魅力的な新たなメカニズムを表しています^。1のNETの文献は継続的に発見以来、過去10年間にわたって拡大してきたが、生物学、機構及び調節におけるその役割に関連するいくつかの重要な問題は不明のまま。適切な方法論はネット、この非常にユニークな抗菌メカニズムを測定するために開発されなければなりません。この記事では、高スループットの方法でネットを定量するために使用できる方法について説明します。第一のアッセイは、膜不透過性DNA結合色素の蛍光の動態に従います。このアッセイは、好中球からのDNAの放出の傾斜と速度に大量の情報を提供します。この情報は、NET形成につながる早期のシグナル伝達事象を研究調査において非常に重要です。全てのこの情報は、インキュベーションの最後にDNAの放出を測定するエンドポイントアッセイで失われます。外DNA染料ベースのアッセイは、ネットに対して特異的ではありません。それDNAのみのリリースを測定します。ネットを確認するために、広くNET-形成好中球の免疫蛍光を実行し、顆粒マーカー（MPO、HNE）またはヒストンのいずれかを用いたDNAの共局在を示すことが認められて...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
抗ヒト好中球エラスターゼ ウサギAb	Calbiochem	481001	1:2,000x コーティング
された抗ミエロペルオキシダーゼ Ab (ウサギ)	ミリポア	07-496	1:2,000x コーティング
DNase-1	Roche	10-104-159-001	1 µ消化に使用されるg/ml
20 mM EGTA/PBS	Sigma-Aldrich	E3889-25G
2.5 mM EGTA/PBS	Sigma-Aldrich	E3889-25G
細胞死検出 ELISA Anti-DNA POD	Roche	11544675001	1:500x
Eon マイクロプレート分光光度計	Biotek
Gen5 オールインワン マイクロプレート ソフトウェア	Biotek		分析ツール (ELISA)
Sytox orange	Life Technology	S11368	0.2% 最終濃度/容量
1 M Hepes	Cellgro	25-060-Cl	10 mM 最終濃度を使用します。
1 M グルコース	Sigma		5 mM 最終濃度を使用します。
HBSS	Corning	21-023-CM
Varioskan Flash Ver.2.4.3	Thermoscientific
PMA	Sigma	P 8139	100 nM 最終使用
ELISA プレート	Greiner bio-one	655061
コニカルチューブ 15 ml	Thermoscientific	339650
コニカルチューブ 50 ml	Thermoscientific	339652
パーコール(pH 8.5-9.5)	シグマ	P 1644	塩化ナトリウム、シグマ、S7653-250G
デキストラン	スペクトラム	D1004
RPMI 1640 培地	コーニング セルグロ	17-105-CV
96 ウェル アッセイ プレート ブラック プレート クリア ボトム	Costar	3603