高解像度を使用した脳切片における軸索のローカライズされたmRNAの検出その場でのハイブリダイゼーション

サマリー

RNA in situハイブリダイゼーション(ISH)は、細胞や組織内のRNAの可視化を可能にします。ここでは、RNAscope ISHと免疫組織化学または組織学的色素との組み合わせを使用して、マウスおよびヒトの脳切片の軸索に局在するmRNAを成功裏に検出する方法を示します。

要約

mRNAはしばしば、脊椎動物軸索に局在していると、地元の翻訳は、軸索の経路探索やpostdevelopmental期間中、開発中の分岐やメンテナンスのため、修理または神経変性のために必要とされます。ハイスループット分析は最近、軸索は、以前に予想以上にダイナミックで複雑なトランスクリプトームを持っていることを明らかにしました。これらの分析は、しかし、主に軸索はsomato樹状コンパートメントから単離することができる培養神経細胞で行われてきました。これは、in vivoでの組織全体でそのような分離を達成することは事実上不可能です。したがって、mRNAの採用や、動物全体におけるそれらの機能的関連性を検証するために、トランスクリプトーム解析は、理想的には、 その場でのmRNAの可視化を可能にする技術と組み合わせる必要があります。最近では、単一分子レベルでのRNAを検出する新規なISH技術が開発されています。 mRNAの細胞内局在を分析する際に特に重要です、ローカライズされたRNAは、典型的には、低レベルで見出されているからです。ここでは、新規の超RNA ISH技術を使用して、軸索に局在するmRNAの検出のための2つのプロトコルを記述します。我々は、成熟したマウスとヒトの脳におけるin vivoでの軸索にATF4 mRNAの募集を検証するために、蛍光免疫組織化学または組織学的染料を使用して軸索対比でRNAscope ISHを組み合わせています。

概要

軸索のmRNAの募集とローカル翻訳は、時間的および空間的に急性様式¹に細胞外刺激に応答する軸索を可能にします。イントラ軸索タンパク質合成は、最良の軸索は^、9-11を経路探索し、逆行^{12,13シグナリング} 、それは成長円錐の動作^2-8において重要な役割を果たしている神経発達の文脈で理解されています。軸索のmRNAとリボソームのレベルが大幅に^14,15に減少している場合にははるかに少ないが、ポスト発達神経細胞における軸索タンパク質合成の機能的意義について知られています。成熟した脊椎動物の軸索は、長い¹⁶翻訳不活性であると考えられてきました。しかし、最近の研究では、地元の翻訳は、病理学的条件の下で成熟した軸索に再活性化されることを示しています。例えば、mRNAのサブセットは、神経損傷およびイントラ軸索タンパク質合成は、これらの軸索¹⁷の正確な再生のために必要とされる以下の再生軸索に補充されます。さらに、当社グループヘクタールSは、特定のmRNAがアルツハイマー病ペプチド_Aβ1-42へのローカルの暴露後に軸索に動員されることを実証し、転写因子ATF4のローカル翻訳は軸索のニューロンの細胞体¹⁸への_Aβ1-42の神経変性作用を伝播するために必要です。最後に、ハイスループット分析は、成熟した軸索は、特に病理学的条件下で^、18-21予想以上に複雑で動的なトランスクリプトームを持っていることを明らかにしました。これらの研究に照らして、成体の神経系において軸索局在化するmRNAを検出するための高感度かつ特異的な方法が必要とされています。

成熟した軸索におけるmRNA動員およびローカル翻訳の作業の多くは培養ニューロンに行われています。特殊な培養方法はsomato樹状区画^18-20からの軸索の単離を可能にする存在するため、トランスクリプトーム解析のために、これは特にそうです。このような研究は、貴重なインを与えているが、成熟した軸索の現地翻訳の役割にIGHTは、培養神経細胞を忠実に生体内でまたはmRNAの募集は、培養条件への軸索の適応応答である場合は、状況を表しているかどうかの質問はまだ開いています。いくつかの研究は、in vivoで軸索を成熟mRNAの動員の証拠を提供しました。例えば、嗅覚マーカータンパク質をコードする転写物は、成人の感覚ニューロンにおける軸索²²で検出されています。 βアクチンのmRNAの3 'UTRを含む導入遺伝子は、マウスにおいて、末梢および中枢神経系ニューロンにおける軸索に輸送され、局所的に発達期間²³の後に翻訳されます。ラミンB2 mRNAはXenopuesにおける網膜軸索に局在しているオタマジャクシをアフリカツメガエル、その枯渇は軸索の開発²¹た後、軸索の維持に影響を与えます。チトクロームCオキシダーゼIVをコードするmRNAの軸索輸送との干渉は、マウスの動作^24を変化させます。最後に、ATF4 mRNAが成人aで発見されました_Aβ1-42との関連で、マウスとヒトの脳のxonsは、神経変性^18を誘発しました。

ハイスループットのトランスクリプトーム分析は、 インビトロで 、単離された軸索中のmRNAプロファイルを同定するために有用であることが証明さが、全体の組織の軸索における以降のインビボ研究は単独で見つからないが、神経細胞体、グリア細胞および他の細胞型と混在んために限界があるています。したがって、このような分析は、mRNAの細胞内局在を確認する画像技術と組み合わせされなければなりません。 in situハイブリダイゼーション （RNA ISH） における RNAは、細胞および組織中の特定のRNA配列の検出および視覚化を可能にします。ただし、元のRNA ISHアッセイは、まれにしか軸索ローカライズされたmRNAのためのケースではありません非常に豊富RNAを²⁵の同定に適していました。努力を増加させる最後の数十年のために、単一分子レベルでのmRNAの検出を可能にする新たな技術の開発に置かれています ^{25,26。例えば、歌手らは5蛍光非重複50マーを（詳細は27を参照）、標識されたことからなる、単一細胞でのmRNAを検出するためのISHプローブを開発しました。上記の技術と、ここで説明したものとの主な違いは、後者は20ダブルZ-構造（ないリニア）は、典型的には、関心を保証する特異性と低いバックグラウンドレベルのRNAの約1 kbの領域を標的プローブを使用していることです。プローブは、最終的に蛍光標識または発色反応を可能にする酵素と結合しているプリアンプやアンプの配列とハイブリダイズさせます。これらの増幅ステップは、他のISH技術28に比べて、信号対雑音比を改善します。ここでは、蛍光免疫細胞化学または軸索対比を可能にする組織学的染料のいずれかを組み合わせRNAscopeを使用して2つのプロトコルを記述します。両方のプロトコルは、大人のMOにATF4 mRNAの軸索の局在を可視化するのに適しています使用して、人間の脳。}

プロトコル

すべての動物の手順はコロンビア大学のIACUCによって承認されたと実験動物の管理と使用に適用可能なガイドラインに従いました。注：RNaseフリーまたはDEPC処理水でISH手順に使用されるすべてのバッファを準備します。この推奨は、ISHが完了した後に厳密には必要ではないが、それは、バッファがまだオートクレーブ再蒸留水中で調製および/または濾過により滅菌されていることが示唆されています。

免疫組織化学が続くin situハイブリダイゼーション （FISH） の蛍光を用いて、1成体マウスの脳内コリン作動性軸索にATF4 mRNAの局在の検出を

1. パラホルムアルデヒド固定凍結脳切片のためのサンプル調製
   1. 次の例では、固定された冷凍マウスの脳からのスライスを用意します。
      1. 簡単に述べると、ケタミンで麻酔により9ヶ月齢のマウスを屠殺（100mgのキログラム^-1体重）およびキシラジン（10mgの量kg ^-1ボディweigHT）をPBS中の4％パラホルムアルデヒド（pH7.4）中のtranscardial注入しました。
      2. 4 ^O℃で24時間、4％パラホルムアルデヒドで脳とポストフィックスを削除します
      3. 固定後、4 ^O℃で24時間、PBS（pH7.4）中でサンプルを30％スクロースPBSで三回洗浄しcryoprotect
      4. 10月に埋め込む脳をクリオスタット上で20ミクロンでシリアル部、化合物を凍結し、ポリ-D-リジン処理した顕微鏡スライド上にマウントします。使用するまで-20 ^O C ^で脳スライスをしてください。
   2. RTで30分間冷凍庫空気乾燥からパラホルムアルデヒド固定脳スライスを削除します。
   3. 1×PBSで3回洗浄します。
   4. ヒュームフードでは、再修正脳を室温で4％パラホルムアルデヒドで20分をスライス。
      注：注意：4％パラホルムアルデヒドは毒性があり、安全性のプロトコルに従って適切に処理して廃棄しなければなりません。
   5. 1×PBSで3回洗浄します。
   6. 脳スライスを脱水。
      1. 50％、75％および100％の準備エタノール溶液。
      2. RTで5分間、50％エタノールでスライドを浸し。
      3. RTで5分間、75％エタノールでスライドを浸し。
      4. RTで5分間、100％エタノールでスライドを浸し。
      5. 室温で5分間、新鮮な100％エタノールでスライドを浸し。注：また、スライドは1ヶ月までのC ^oを -20℃の100％エタノール中で保存することができます。
2. FISHアッセイは、熱誘導抗原/ RNAのアンマスキングを使用して、免疫組織化学が続きます
   1. 開始する前に必要なすべての材料を準備します。
      1. ^40°Cのへのハイブリダイゼーションオーブンを加熱し、加湿環境を作成するために、オーブンで蒸留水を入れたトレイを置きます。
      2. スライドボックスを取り、内側スライドボックスを加湿するために蒸留水に浸したペーパータオルを置きます。ハイブリダイゼーションオーブンでスライドボックスを配置します。
      3. 冷蔵庫からプローブ（陰性とターゲットプローブの両方）を取り外し、10分間のハイブリダイゼーションオーブンでそれらを加熱します。プローブはダウを冷ましますRTでN。
      4. RTで（蛍光マルチプレックス試薬キットに含まれる）増幅試薬AMP 1-4を平衡化します。
      5. 抗原回復溶液を調製：10mMのクエン酸ナトリウム（pHは6）、0.05％ツイーン20を注：溶液が無期限にRTで保存することができ、将来の染色のために使用されます。
      6. RNaseフリーまたはDEPC処理水に（蛍光マルチプレックス試薬キットに含まれる）50×ストック溶液を希釈し、1×洗浄バッファーを準備します。
         注：1×洗浄緩衝液は、1ヶ月間室温で保存することができ、将来の染色のために使用されます。 50倍の洗浄緩衝液は沈殿することがあります。 10分間^、40°Cの時そうである場合、熱50X洗浄緩衝液1×溶液を調製する前に。
   2. 室温で5分間、100％エタノールと空気乾燥からスライドを削除します。
   3. 抗原回復溶液50 mlを含有するコ​​プリンジャーを準備します。抗原回復溶液中にスライドを浸漬し、電子レンジで10分間、それらを沸騰。
      注：代わりに100ミリメートルに水平にスライドを置きます検索溶液100mlを含有する直径丸いガラス皿。
      1. 蒸留水で1リットルのビーカーを記入し、電子レンジに入れてください。
         注：アンマスキングを行う際に水が熱を「バッファ」になります。
      2. 電子レンジ内部の抗原回復溶液中で​​スライドを配置します。沸騰を5分間高出力で摺動します。サンプルが沸騰停止した直後に、熱が余分に5分間のハイパワーで再びスライドします。
      3. 室温でスライドをクールダウン。
         注：重要なステップ：沸騰時間および手順は、マイクロ波の特性に応じて、ユーザによって決定されるべきです。速く沸騰が高い溶液の蒸発の可能性を開始します。この場合には、サンプルは10分間2回の合計アンマスキング時間を完了するために、より多くのより短い期間で煮沸することをお勧めします。加熱が中または低電力で行われた場合、逆に、マスク解除を10分間一回行うことができます。しかし、場合にサンプルがcontinuouslを沸騰しません約10分の合計yが、これは、検出されるべき標的RNAとタンパク質の両方の部分的なアンマスキングをもたらすかもしれません。
   4. 洗浄は、1×PBSで3回スライドさせます。
   5. バックグラウンド染色を評価するために使用されるものの脳切片に設定のdapBプローブの3滴（約100μl）を- 2を加えます。注： のdapBのプローブセットは、細菌の遺伝子を標的とし、任意の哺乳動物のRNAを認識すべきではありません。
   6. 関心のあるRNAを検出するために使用されるもの脳切片に設定ターゲッティングプローブの3滴 - 2を加えます。注：残基20ターゲッティングプローブセット-マウスATF4のmRNAの1381は、この例で使用されます。
   7. パラフィルムでカバースライドを、プローブの蒸発を防ぐため、ハイブリダイゼーションオーブン内の加湿スライドボックスに置き、2時間40 ^O C ^でそれらをインキュベートします。
      注：オプション：追加の脳切片は、マウスPolr2Aを標的プローブセットとハイブリダイズし、ポジティブコントロールとして使用することができます。
   8. ウォッシュSLIデ回室温で2分間、1×洗浄緩衝液で。
   9. 、各脳スライスに増幅試薬AMPの3滴1-FLパラフィルムでスライドをカバーし、スライドボックスでそれらを配置し、ハイブリダイゼーションオーブンで30分間^、40°Cのでインキュベート- 2を追加します。
   10. 洗浄は、室温で2分間の1×洗浄緩衝液で2回スライドします。
   11. 、各脳スライスに増幅試薬AMP 3滴の2-FLパラフィルムでスライドをカバーし、スライドボックスでそれらを配置し、ハイブリダイゼーションオーブンで15分間^40°Cのでインキュベート- 2を追加します。
   12. 洗浄は、室温で2分間の1×洗浄緩衝液で2回スライドします。
   13. 、各脳スライスに増幅試薬AMP 3滴の3-FLパラフィルムでスライドをカバーし、スライドボックスでそれらを配置し、ハイブリダイゼーションオーブンで30分間^、40°Cのでインキュベート- 2を追加します。
   14. 洗浄は、室温で2分間の1×洗浄緩衝液で2回スライドします。
   15. 2追加 - 各脳スライスに増幅試薬AMP 4-FLの3滴を、それらを配置し、パラフィルムでスライドをカバースライドボックスとは、ハイブリダイゼーションオーブンで15分間^40°Cのインキュベート。
   16. 洗浄は、再度1×PBSでRTとで2分間の1×洗浄緩衝液で2回スライドします。
   17. 100追加 - スライドに3 mg / mlのBSA、100mMのグリシンおよび0.25％トリトンX-100 PBS中液（pH7.4）を含有するブロッキング溶液を（完全にスライスをカバーするか、十分な体積）200μLを、パラフィルムでそれらをカバーしRTで30分間インキュベートします。
   18. 、スライドに溶液（1/100）をブロックに希釈した抗のChAT抗体200μlのパラフィルムでそれらをカバーし、4 ^O℃で2日間インキュベート- 100を追加します。脳切片が乾燥しないことを確認します。必要に応じて、24時間インキュベーションした後の脳切片に対する抗のChAT抗体溶液を再適用します。
   19. 洗浄は、室温で5分間、1×PBSで3回スライドします。
   20. 100追加-適切なアレクサ結合二次抗体を200μlを（ 例えば 、この特定の例のためのAlexa-594ロバ抗ヤギ）のスライドには、パラフィルムおよびincubでカバーRTで1時間食べました。
   21. 洗浄は、室温で5分間、1×PBSで3回スライドします。
   22. 洗浄を蒸留水で1回スライドします。
   23. マウントは、DAPI含有マウント培地で摺動します。
   24. 蛍光顕微鏡下で脳切片を視覚化。

ルクソールファーストブルーとクレシルバイオレット対比が続くin situハイブリダイゼーション （CISH） で発色を用いてヒト脳試料中の軸索にATF4 mRNAの局在の2検出

1. ホルマリン固定パラフィン包埋ヒト脳サンプルのためのサンプル調製
   1. 1時間^60°Cの時の乾燥オーブンで焼くスライス。
   2. ヒュームフード内で脱パラフィン脳切片。
      注：注意：試薬は、毒性であり、適切なセキュリティガイドラインに従って取り扱い、廃棄しなければなりません
      1. 10分間二回キシレン代替クリアリング剤でスライドを浸し。
      2. 1分間、二回、100％エタノール中でスライドを浸し。
      3. AIR乾燥スライスRTで5分。注：別の方法として、サンプルは、RT Oで乾燥されることがあり/ Nが、24時間以内に使用しなければなりません。
2. ジアミノベンジジン（DAB）は、熱誘導およびプロテアーゼ誘発性RNAのアンマスキングを使用して、ルクソールファースト青とクレシルバイオレット染色に続いて発色ISHアッセイをベース
   1. 開始する前に、必要な材料を準備します。
      1. ^40°Cのへのハイブリダイゼーションオーブンを加熱し、加湿環境を作成するために、蒸留水を含有するトレイを置きます。
      2. スライドボックスを取り、内側スライドボックスを加湿するために蒸留水に浸したペーパータオルを置きます。ハイブリダイゼーションオーブンでスライドボックスを配置します。
      3. RNaseフリーまたはDEPC処理水（CISH試薬キットに含まれる）10×ストック溶液を希釈することにより、1×前処理2を準備します。前処理は、ホットプレート上で行われる場合、前処理の場合（皿と熱板との間の接触面を増加させるために直径100mmのガラス皿に前処理溶液100mlを加えます）1.2.3で指定されたコプリンジャーの代わりに使用することができ、マイクロ波中で行われます。 ^100°Cまで^の熱ソリューションは、サンプルを浸漬する前に、もう30分以上沸騰それ ​​を維持しません。
      4. ^40°Cの時の熱負と正のプローブ10分間、室温でクールダウン。
      5. RTで（CISH試薬キットに含まれる）増幅試薬AMP 1-6を平衡化します。
      6. 蒸留水に（CISH試薬キットに含まれる）50×ストック溶液を希釈1×洗浄バッファーを準備します。注：1×洗浄緩衝液は、1ヶ月間室温で保存することができ、将来の染色のために使用されます。
   2. パラフィルムで覆い、室温で10分間インキュベート、各脳スライスに前処理1の〜4滴（〜120μl）を追加します。
   3. 新鮮な蒸留水で3〜5回洗浄します。
   4. 熱によるマスク解除を実行します。
      1. （CISH試薬キットに含まれています）ホット前処理2に転送するスライド溶液に15分間、沸騰。注意：沸騰を確実にホットプレート上で行うことができます連続沸騰または1.2.3で指定された重要なステップを以下の電子レンジで）。
   5. すぐに蒸留水にスライドを転送し、3〜5回洗浄します。
   6. 洗浄は、新鮮な100％エタノールで3~5回スライドします。
   7. 室温で空気乾燥スライス5分。注意：またはスライスは、O / N乾燥させることができます。
   8. プロテアーゼ誘発性脱マスキングを実行します。
      1. （CISH試薬キットに含まれる）前処理3の4滴を追加し、パラフィルムでカバーし、ハイブリダイゼーションオーブンで40 ^O℃で30分間インキュベートします。
   9. 洗浄は、新鮮な蒸留水で3〜5回をスライド。
   10. バックグラウンド染色を評価するために使用されるものの脳切片に設定のdapBプローブの4滴加えます。
   11. 関心のあるRNAを検出するために使用されるもの脳切片に設定ターゲッティングプローブの4滴加えます。
       注：残基15ターゲッティングプローブセット-ヒトATF4のmRNAの1256は、この例で使用されます。オプション：追加の脳スライスはHYBすることができますヒトPPIBを標的プローブセットでridized 正の対照として使用しました。
   12. スライドボックス内にスライドを置き、2時間インキュベートします。ハイブリダイゼーションオーブンで40 ^O C ^で 。
   13. 洗浄は、室温で2分間の1×洗浄緩衝液で2回スライドします。
   14. 各脳切片にAMP 1試薬の4滴を追加し、パラフィルムでスライドをカバーし、スライドボックスでそれらを配置し、ハイブリダイゼーションオーブンで30分間、40 ^O C ^でインキュベートします。
   15. 洗浄は、室温で2分間の1×洗浄緩衝液で2回スライドします。
   16. 各脳切片にAMP 2試薬の4滴を追加し、パラフィルムでスライドをカバーし、スライドボックスでそれらを配置し、ハイブリダイゼーションオーブンで15分間、40 ^O C ^でインキュベートします。
   17. 洗浄は、室温で2分間の1×洗浄緩衝液で2回スライドします。
   18. 各脳切片にAMP 3試薬の4滴を追加し、パラフィルムでスライドをカバーし、スライドボックスでそれらを配置し、ハイブリダイゼーションオーブンで30分間、40 ^O C ^でインキュベートします。
   19. 洗浄は、1×で二回したスライドします室温で2分間の時間バッファ。
   20. 各脳切片にAMP 4試薬の4滴を追加し、パラフィルムでスライドをカバーし、スライドボックスでそれらを配置し、ハイブリダイゼーションオーブンで15分間、40 ^O C ^でインキュベートします。
   21. 洗浄は、室温で2分間の1×洗浄緩衝液で2回スライドします。
   22. 各脳切片にAMP 5試薬の4滴を追加し、パラフィルムでスライドを覆い、室温で30分間インキュベートします。
   23. 洗浄は、室温で2分間の1×洗浄緩衝液で2回スライドします。
   24. 各脳切片にAMP 6試薬の4滴を追加し、パラフィルムでスライドを覆い、室温で15分間インキュベートします。
   25. 洗浄は、室温で2分間の1×洗浄緩衝液で2回スライドします。
   26. （CISH試薬キットに含まれる）BROWN-1とBROWN-2試薬​​を等量混ぜ、各脳スライスに溶液の〜120μlを添加、パラフィルムで覆い、室温で10分間インキュベートします。
   27. 洗浄は、室温で2分間の1×洗浄緩衝液で2回スライドし、蒸留水で一回洗浄します。
       注：重要なステップ：次の手順は、に重要ですRNA顆粒の存在を隠蔽することなく、最適な軸索対比を得ます。
   28. 明視野顕微鏡下で、目的のmRNAの存在を確認対比実行する前に。対比手順を通して涙点の存在を監視するには、脳試料中の参照領域を定義します。
   29. 60 ^O℃で予熱ルクソールファーストブルー溶液
   30. 場所スライドルクソールファーストブルーで、60 ^O℃で30分間インキュベート
   31. 蒸留水で数回洗浄します。
   32. ディップは、分化を開始するために、0.05％炭酸リチウム溶液に数回スライドさせます。
   33. ディップは、新鮮な75％エタノールで二回スライドします。
   34. 蒸留水ですすいでください。
   35. 明視野顕微鏡下で脳スライスを確認してください。グレーと白質はダークブルー/ブラック涙点として、まだ目に見える区別可能とRNA顆粒であることを開始すべきであることに注意してください。軸索は水色繊維として現れる始めることを確認します。
   36. 繰り返しは2.2.32に2.2.28を繰り返します。 Perfor慎重に対比し、RNA顆粒の存在を監視し、20分の段階、 - 10ルクソールファーストブルー溶液とMのインキュベーション。注意：一般的に、最適な対比が60で取得した-それは、RNA顆粒をルクソールファーストブルー染色（例については、 図2を参照）によってマスクされる可能性があることが疑われる場合に90分（総インキュベーション時間）が、時間を短縮することができます。
   37. RTで10分間クレシルバイオレット溶液でスライドをインキュベートします。
   38. 蒸留水でスライドを洗浄します。
   39. ディップを70％エタノール中で5〜10倍のスライド。
   40. 100％エタノールの3迅速な変化によって脳切片を脱水。
   41. ヒュームフードでは、2分間、室温で5分間、三度目のキシレン代替クリアリング剤で二回インキュベートすることにより明確な脳スライス。
   42. キシレン系永久封入剤でマウント脳切片。
   43. 明視野顕微鏡下でサンプルを分析します。

結果

上記の手順の概要は図1に示されています。

ATF4 mRNAの最適な検出は、熱誘導アンマスキングを使用して、コリン作動性軸索に顆粒

mRNAの軸索の局在を評価する際には、軸索を識別することができるように、低豊富なRNAを可視化できることが重要です。ここで説明するRNA ISH技術は、単一分子分解能でのRNAの検出を可能にします。プロテアーゼ誘発性及び熱誘導アンマスキング^28：この技術を使用して標準的なプロトコルは、効率的に標的RNAを検出するための2つのアンマスキングの手順の組み合わせを提案します。 ISHは、軸索を識別するために、免疫組織化学と組み合わせた場合しかし、プロテアーゼ誘発性脱マスクは、最適な抗原検出²⁹をもたらさない可能性があります。

使用した抗体は、Cを認識することができなかったので、ここで説明した第一のプロトコルでは、プロテ...

ディスカッション

このレポートでは、軸索ローカライズATF4 mRNAの検出で高解像度のISH技術の使用を記載しています。これらおよび以前発表された研究は、この技術は、組織中の抗体ベースのタンパク質検出、あるいは胚全体³³と互換性があることを示しています。重要なことは、最近³⁴海馬ニューロンの樹状突起内のアークのmRNAの検出のために使用されてきました。また、組織染色のための組織学的染料と組み合わせることができます。最後に、複数の標的のRNA ^28,30,33の同時検出に適しています。これらの知見は、高解像度のRNA ISH技術の汎用性を例示し、元のプロトコルに若干の修正は、この方法の感度を低下させません。

単一分子分解能で組織中の目的のmRNAを検出するためのZ構造のプローブの使用を記載するオリジナルのプロトコルは、mRNAを含むアンマスキングのための2つのステップを示唆する^30,35沸騰プロテアーゼ消化およびサンプル。ここでは、プロテアーゼによって誘発される負アンマスキング...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
マウスAtf4 mRNA (NM_009716)の残基20-1,381を標的とするカスタムプローブ	-
		ヒトATF4 mRNA (NM_001675.2)
の残基15-1,256を標的とするカスタムプローブポジティブコントロールプローブ-マウスPolr2A(オプション)	Advanced Cell Diagnostics	312471	プローブ
ポジティブコントロールプローブ-ヒトPPIB(オプション)	Advanced Cell Diagnostics	313901	プローブ
RNAscope蛍光マルチプレックス試薬キット(蛍光検出用)	Advanced Cell Diagnostics	320850	in situハイブリダイゼーションキット
RNAscope 2.0 HD 試薬キット - BROWN (発色検出用)	Advanced Cell Diagnostics	310035	in situ ハイブリダイゼーションキット
ヤギ ポリクローナル抗ChAT抗体	ミリポア	AB144P
ルクソールFast Blue-Cresyl Echt バイオレットステインキット	American MasterTech	KTLFB
Clearifyクリアリング剤(キシレン代替品)	American MasterTech	CACLEGAL
ProLong Gold 埋込  媒体 DAPI	Life Technologies	P36935
DPX 埋込媒体	Sigma	6522