ワクチンがどのように機能するかについての知識は全体的に不足しています。ここでは、逆遺伝学と骨髄キメラマウスの併用を提案するとともに、樹状細胞とT細胞免疫に特に焦点を当てて、ワクチンに対する初期の宿主免疫応答についての洞察を得ることを提案します。
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この記事について
サマリー
要約
ワクチンは人類の最大の成果の一つであり、前世紀に何百万人もの命を救ってきました。逆説的ですが、ワクチンに対する免疫反応を媒介する生理学的メカニズムについてはほとんど知られていませんが、これはおそらくワクチン接種の全体的な成功により、ワクチン免疫の分子的および生理学的メカニズムへの関心が低下しているためです。しかし、インフルエンザウイルスを含むいくつかの重要なヒト病原体は、依然としてワクチン接種の課題となっており、免疫ベースの戦略が役立つ可能性があります。
インフルエンザ逆遺伝学は、弱毒生インフルエンザワクチン(LAIV)の生成に成功裏に適用されていますが、ワクチン調製物にトレーサー成分などの分子ツールを追加することで、in vivoでのワクチン接種の動態を追跡することは、まだ取り組まれていません。さらに、動態研究中に白血球の特異的な枯渇を可能にする最新世代のマウスモデルは、ワクチン誘発防御の根底にある基本的な免疫メカニズムを理解する機会の窓を開きました。ここでは、リバースジェネティクスとキメラマウスモデルの組み合わせが、ワクチンが生理学的および分子レベルでどのように機能するかについての新たな洞察を提供するのにどのように役立つかを、例として組換え、寒冷適応、弱毒生インフルエンザワクチン(LAIV)を使用して説明します。細胞トレーサーを保有する実験室で生成されたLAIVと競合する骨髄キメラ(BMC)を利用して、ワクチン免疫の初期動態とワクチン特異的適応免疫の開始に関与する主要な生理学的メカニズムを決定しました。さらに、この手法がワクチンに対する免疫応答中の単一動物における遺伝子機能研究をどのように促進するかを示します。この手法は、インフルエンザ、HIV、マラリア原虫、エボラウイルスなどの出血熱ウイルスなど、緊急の医学的対策が必要な病原体に対する現在の予防戦略を改善するために適用できることを提案します。
概要
疾患の非存在下での免疫記憶の発生を効率的にワクチン接種1の生理学的基礎です。近年、システム生物学に基づくアプローチは、順番に、リードが抗原の活性化を多系列ためにどのような黄熱病ワクチンとして成功したワクチンは、強力な自然免疫応答の誘導および樹状細胞（DC）のいくつかのサブセットの活性化を誘導することを明らかにしました特異的T細胞の2,3。 DCは、抗原特異的ナイーブT細胞4を活性化する能力を持つ唯一の免疫細胞集団であるため、ワクチン接種時にその機能の研究は、ワクチンに対する免疫応答を理解し、挑戦的な病原体に対する今後の戦略を設計することが重要です。
ワクチンに対する免疫応答の間に別のDCのサブセットのトレースはリンパ組織へのDCの遊走の正確な速度を確立するために望ましいであろうため、提供することを可能にするシステムワクチン特異的適応免疫の開始を担う生理学的メカニズムへの洞察。逆遺伝学ベースのアプローチは、この目的に実験的に使用することができる修飾された、生弱毒化ワクチンを生成するための可能性を提供します。インフルエンザ研究に実装するので、プラスミドベースの逆遺伝学は広くLAIVs含む組換えインフルエンザ株を生成するために使用されてきました。組換えインフルエンザウイルスを救出するための標準的なプロトコルは、（マディンダービーイヌ腎臓として許容システムでは8個のインフルエンザウイルスのセグメントと同様に増幅を含む（....
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プロトコル
動物実験は承認されたプロトコルに従って、およびドイツの動物保護法のガイドラインに従って行いました。動物実験を実施するすべてのスタッフは、カテゴリB又は欧州実験動物学連盟のCに応じた研修プログラムに合格しました。
逆遺伝学による組換え弱毒インフルエンザワクチンの1世代
注：逆遺伝学による組換えインフルエンザウイルスを生成するための詳細なプロトコールは、以前の研究5によって説明され、本報告書の範囲外であるされています。簡単に言えば、低温適合性インフルエンザワクチンの救出（CAV）はバイオセーフティーレベル2（BSL2）の封じ込め下バイオセーフティクラスIIキャビネットで行われ、以下に詳述する手順が含まれています。トランスフェクションおよび感染プロトコルは、それを次の マルティネス-Sobrido ら 5。
- 再集合体低温適応性インフルエンザの生成背景として低温適合株A / PR / 8/34（H1N1）株のA /アナーバー/ 60分の6（H2N2）、ならびに赤血球凝集素（HA）および変性ノイラミニダーゼ（NA）を（使用して、ワクチン図1A）。 NA遺伝子における修飾は、ニワトリオボアルブミン（OVA）由来のペプチドSIINFEKL（ 図1B）をコードする短いc....
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結果
組換え生弱毒化インフルエンザワクチンの生成は、双方向性プロモーター5の制御下でインフルエンザウイルスの8つのセグメントをコードするプラスミドをトランスフェクトすることによって達成することができます。低温適応インフルエンザワクチンは通常、低温適応株と同様に、任意のインフルエンザ株のHAとNA（ 例えば 、H1N1）（ 図1A）の6つのセグメントが含まれています。冷適応の原理は、33°C、マウスとヒト14における上部気道（URT）の温度で、ウイルス制限の複製に基づいています。したがって、ワクチンは、URTである程度複製することができますが、下気道の肺炎を引き起こすことはできません。融合PCR技術を使用して、ウイルスのノイラミニダーゼ（NA）のステムで保存された領域を追跡可能OVA由来ペプチド（SIINFEKL）（ 図1B）に置換しました。
動態研究におけるワクチン特異的応答を追跡するために我々が持っていますワクチン製剤に由来しトレーサブルペプチド.......
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ディスカッション
本研究では、ワクチン誘導免疫の生理学的および分子メカニズムを解明するために利用することができますどのように逆遺伝学およびキメラマウスモデルについて説明します。インフルエンザ逆遺伝学は、多くの研究室で確立され、インフルエンザ発病、複製、および伝送17を理解する上で主な役割を果たしてきました。我々のプロトコルで重要な点は、外来エピトープを発現する寒冷適応インフルエンザワクチンの救助です。ノイラミニダーゼの茎に短いcDNAを導入する戦略は、多くのグループによって説明してきたが、研究者は、追加の突然変異が卵にワクチン製造中に導入されていないことを確認する必要があり、ワクチンが誘導することなく、気道で複製することが可能であること肺炎5,12。ウイルスノイラミニダーゼの茎ならびにNS遺伝子セグメントとPB1セグメントとしてインフルエンザゲノムの他の領域の両方は、外来配列の割り当てを可能にするので、19,20、我々のプロトコルの改変は、例えば、インフルエンザウイルスに対するT細胞免疫応答、合理的なワクチン設計のための重要なポイントの階層を理解するために追加の外来ペプチドを追加するために.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
私たちは、マウス実験の優れた技術サポートを提供してくださったSergio Gómez-Medinaに感謝します。この研究は、ライプニッツ協会とライプニッツ感染センターからの資金提供を受けて行われました。A.L.は、ライプニッツ大学院から博士課程前のフェローシップを受けています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ダルベッコ&急性;Modified Eagle Medium (DMEM 1x) | Gibco RL-Life Technologies | 41965-039 | |
| OptiMEM | Gibco RL-Life Technologies | 31985-047 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen-Life Technologies | 11668-027 | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/ml) | PAA | p11-010 | |
| ウシ血清アルブミン | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| 胚卵 | Valo biomedia Gmbh | ||
| PBS (1x) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 70 μM Nylon Filters | Greiner-Biorad | 542-070 | |
| 赤血球溶解バッファー (RBCL) 10x | BD Bioscience | 555899 | |
| CD16/CD32 マウス BD Fc ブロック (2.4G2) | BD Pharmigen | 553142 | |
| APC-Anti-mouse SIINFEKL-H2kb (25 D1.16) | Biolegend | 141605 | |
| PE-Anti-mouse CD11c (HLA3) | BD Biosciences | 553802 | |
| eFluor 450-抗マウスMHCII (MD/114.15.2) | eBioscience | 48-5321-82 | |
| Pe-Cy7-Anti-mouse CD11b (M1/70) | Biolegend | 101216 | |
| PerCp/Cy5.5-Anti-mouse CD103 (2E7) | Biolegend | 121416 | |
| PE-Anti-mouse CD45.1 (A20) | eBioscience | 12-0453-82 | |
| V500-Anti-mouse CD45.2 (1O4) | BD Bioscience | 562130 | |
| PerCp-eFluor710 -抗マウスCD8a(53-6.7) | eBioscience | 46-0081-80 | |
| APC-Cy7-抗マウスCD3ε(145-2611) | Biolegend | 100325 | |
| eFluor450-Anti-mouse CD4 (GK 1.5) | eBioscience | 48-0041-80 | |
| CFSE Proliferation dye | eBioscience | 65-0850-85 | |
| Baytril 2.5% | Bayer | 65-0850-85 | |
| Dymethil-Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| オボアルブミン | 分子プローブ | O23020 | |
| ジフテリア毒素 (DT) | Sigma-Aldrich | D0564 | |
| Trypsin-TPCK | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| BD FACsCanto II Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo cell analysis software 9.5 | Flowjo inc. | ||
| トリパンブルーステイン(0.4%) | Life technologies | T10282 | |
| Countess Automatic Cell Counter | Invitrogen-Life Technologies | C10227 |
参考文献
- Bevan, M. J. Understand memory, design better vaccines. Nat. Immunol. 12, 463-465 (2011).
- Gaucher, D. Yellow fever vaccine induces integrated multilineage and polyfunctional immune responses. J. Exp. Med. 205, 3119-3131 (2008).
- Querec, T. D.
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