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方法論記事

サイトカインキャプチャシステムを用いた臨床応用のためのサイトメガロウイルス特異的T細胞の自動化された細胞濃縮

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DOI:

10.3791/52808

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2015年10月5日

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1Division of Pediatrics, U.T. MD Anderson Cancer Center, 2Stem Cell Transplantation and Cellular Therapy, U.T. MD Anderson Cancer Center

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルの目標は、閉鎖性サイトカイン捕捉システムを組み込み、専任のスタッフやGMP施設の使用を必要としないベンチトップの自動化された第2世代細胞濃縮デバイスを使用して、病原体特異的な臨床グレードのT細胞を製造することです。作製したサイトメガロウイルスpp65特異的T細胞は、患者に直接投与することができます。

要約

病原体特異的T細胞の養子移入は、同種造血幹細胞移植後に発生するサイトメガロウイルス（CMV）感染症などの日和見感染症を予防および治療するために使用することができます。第三者ドナーを含む同種異系のドナーからのウイルス特異的T細胞は、選択的に、所望のT細胞を増殖するための抗原駆動型の刺激の繰り返しのラウンドを用いて、現在の適正製造基準（cGMPの）に準拠してエクスビボで増殖させることができます。抗原特異的T細胞の同定および単離はまた、γ-インターフェロン（IFN-γ）を分泌するように活性化されたT細胞のサイトカイン捕捉システムに基づいて行うことができます。製造プロセスは、時間がかかり、熟練したオペレータを必要とするが、免疫を回復するのに役立つサイトカイン捕獲システム（CCS）の広範なヒトの適用が制限されています。現在、CliniMACSプロディジーなどの第二世代の細胞濃縮装置の開発自動化され、より少ない労働集約システムを使用してウイルス特異的T細胞を生成するための研究を可能にします。このデバイスは、磁気的、臨床グレードの製品を生成するために、磁気活性化細胞選別技術を用いて、非標識細胞から細胞を分離する標識された、閉じたシステムとして設計され、ベンチトップ上でアクセスして操作することができます。我々は、CMV血清反応陽性ドナーから得られた定常状態のアフェレーシス産物から得られたCMVのpp65特異的T細胞を作製するために、この新しい自動化された細胞濃縮装置の動作を示します。これらの単離されたT細胞は、直接機関と連邦規制監督下で患者に注入することができます。赤血球、T細胞の刺激、抗原特異的T細胞の分離、精製、及び洗浄の除去を含むすべての生物処理工程を完全に自動化されています。このようなデバイスは、ヒト適用のためのT細胞は、専用の適正製造基準（GMPの外で製造することができるという可能性を提起）代わりに、設備やスタッフは、複数の製品を生産するために自動化されたプロトコルを監視することができ、血液銀行施設で製造すること。

概要

造血幹細胞移植（HSCT）1は、移植片対腫瘍効果を改善し、日和見感染2に対する免疫を提供するために、養子T細胞療法と組み合わせることができます。注入のための抗原特異的なドナー由来T細胞の生成は、歴史的に熟練者とGMP準拠している専門の施設の使用を必要としてきました。このようなT細胞の送達は、日和見感染症3の解像度と同様に、基礎となる悪性腫瘍4の治療をもたらしました。最近、研究者は実証されているそのわずか数千のウイルス特異的T細胞の養子移入（〜1×10 4から2.5×10 5細胞 / kgを、レシピエントの体重）が正常に同種HSCT 5-9後の日和見のCMV感染症を治療することができます。関連した製造業者の要件にGMP施設の限られた数および細胞の生産に関連する高いコストは、しかしながら、RESTRを有しT細胞療法10を約束に対する患者のアクセスをicted。抗原特異的T細胞を単離するための一つのアプローチは、CD45およびIFN-γを認識する二重特異性試薬を用いてCCSに基づいています。示されているように、この方法は、自動化された細胞濃縮CCS装置（ 図1B）を用いた臨床グレードのCMV特異的T細胞を生成するために使用することができます。

CMV特異的T細胞は、CMV血清反応陽性ドナーからの白血球搬出総核細胞（TNC）でのCMVのpp65抗原のオーバーラップペプチドをインキュベートすることにより生成されます。ヒト白血球抗原（HLA）との関連で表示されるこれらのペプチドは、IFN-γを分泌するTNC内のCMVのpp65特異的T細胞を活性化します。これらのT細胞は、その後、「捕捉される」ことと、磁気的に分離することができます。第一世代の細胞濃縮装置の動作（ 図1A）は、複数のを行うことGMP条件下で細胞培養での人材を必要とし、スタッフのコーディネート「捕捉された」製品を生成するために必要なTEPS。

手順は、通常、連続運転の10〜12時間を必要とするため、担当者はおそらく、GMP施設で2シフト上で動作する必要があります。これらの制約は、現在（ 図1Bに示される）第二世代のデバイスの実装によって回避されます。このデバイスは、最初の生成装置と同等の磁気濃縮を、引き受けるが、unbreachedアプローチで、CCSの他の側面を自動化します。ステップのほとんどは、スタッフが無人達成することができるので、これはかなりのGMPチームの負担を軽減します。デバイスは、閉鎖系として動作するので、さらに、抗原特異的T細胞が捕捉され、機器を起動する前に、白血球搬出単離および材料の製造に含まれる工程を除いて、ベンチトップ上で処理することができます。この第二世代の細胞濃縮装置の完全な計測および機能の詳細については、パブされています11 lished。

ここでは、自動化された細胞濃縮CCSシステムを使用して、定常状態のアフェレーシス産物からのCMVのpp65特異的T細胞を濃縮するための手順について説明します。一旦単離されると、これらのCMV特異的T細胞は、直ちに患者に注入することができます。

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プロトコル

無菌条件下での材料の作製（材料および装置表を参照してください）

  1. （w / v）の最終濃度0.5％までのヒト血清アルブミン（HSA）を補充したPBS / EDTA緩衝液の3 Lを準備します。
  2. 臨床グレードの0.9％塩化ナトリウム（NaCl）溶液の1リットルバッグ及びGMPグレードの細胞培養培地の2リットルを調製します。
  3. 滅菌水8mlでのCMVのpp65の1バイアルを再構成することによりCMV特異的ペプチド抗原カクテルの60ナノモルを準備します。
  4. ルアー/スパイクインターコネクタを使用して、50ミリリットルの容量冷凍袋にのCMVのpp65ペプチドカクテルを移し、チューブセットにカクテルのその後の配布を回避するために鉗子をロックで固定します。無菌条件下でのオープンセル濃縮管セット（TS 500）。
  5. 滅菌管溶接機を使用して、この時点では、ペプチドカクテルバッグクランプを開けないでくださいチューブセットのバルブ2 TS 500用のチューブ接続にペプチドカクテル凍結バッグを接続します。
  6. 1×10 9 Tを削除しますNC細胞産物を開始してから、50mlの総体積2.5％HSAを含有するPBS / EDTA緩衝液に懸濁します。 150ミリリットルのトランスファーバッグに携帯製品を注入します。

2.自動細胞分離システムの製造および使用（材料および装置表を参照してください）

  1. 細胞濃縮システム（ 図1B）に切り替えて、プログラム「CCS_IFN-γ充実」を選択してください。手順を介してオペレータを案内する指示や写真で画面を示すユーザインタフェースを確認します。
  2. パラメータの 「オペレーター」と「 チューブセットP / Nなし」と入力します 。次に、対話型のモニタ画面に表示される指示に従って自動化された細胞濃縮装置にチューブセット500をインストールしてください。
  3. デバイスにメディアやバッファを接続するために画面に表示されるステップバイステップのインストラクションに従ってください。レコードカタログ番号とCONNECTIN前試薬のロット番号楽器にグラム。
  4. チューブセットの最終チェック後、ペプチドカクテルバッグのクランプを開きます。ミディアムバッグを開き、チューブセットの自動プライミングを開始します。
  5. プライミング工程が完了した後、滅菌管溶接機の助けを借りて、貯蔵バッグ（200 mL）中のNaCl緩衝液中にHSA（2.5％）を補足します。滅菌管溶接機を使用して、「アプリケーション・バッグ」に始まる細胞産物を転送します。
  6. アダプタを介して各チューブにCCS（IFNγ）の試薬を接続します。濃縮プロセスの前に細胞物質の画分を回収するために好ましい時間を入力します。入力されたすべてのデータ/パラメータの精度を確認し、確認してください。プロセスを開始します。
  7. 自動細胞濃縮プロセスを開始する前に、品質管理バッグ（QCBは、元の画分（ORI）は、PBS / EDTA緩衝液で希釈した100ミリリットル室コンテンツのうち、約1.3ミリリットルが含まれています）を取り外します。 QCBを密封、重さ、そして4℃で保存します。
  8. enrichmeを開始NTプロセス。プロセスの終わりには、標的細胞は、貯蔵バッグから溶出緩衝液の概算体積で溶出されます。
  9. 非ターゲットセルバッグ（NTCB、陰性分画= NEG）と標的細胞バッグ（TCB、陽性画分= POS）を密封し、各バッグの重量を量ります。重みは、後に細胞数の計算に使用されます。
  10. すぐに濃縮手順後にフローサイトメトリー分析のために端数ごとに2つのアリコートを収集し、4℃でのサンプルの残りの部分を格納します。細胞数の決意と濃縮パフォーマンス分析（ 表1）のために他の試料アリコートのための1つの試料アリコートを使用してください。
  11. 細胞濃縮器からチューブセットを削除します。将来の使用のためにUSBドライブにログファイルを転送します。
    注：すべての試薬は、滅菌条件下で調製されるべきです。バイオセーフティII型フードの使用を強くお勧めします。健康から分離された定常状態のアフェレーシス細胞産物（非動員が）を使用しCMV血清陽性ドナーがCMV抗原特異的T細胞を豊かにします。唯一のFDAは、HSAを使用する必要がありますライセンス。細胞調製のためのバッファが低減純度および標的細胞の収率低下をもたらす低いまたは高い周囲温度として25℃まで19℃に維持されるべきです。

3.セル数の決意

  1. 表1に示すように、細胞数のためのQCB、NTCB及びTCBのアリコートを取る。各アリコート（力価1時11分）にCD45-VoBlueを追加し、4℃で10分間、暗所でインキュベートします。
  2. 元の画分および陰性画分を、陽性画分を450μlの新たに調製した赤血球細胞溶解液に1.5 mlの新たに調製した赤血球溶解液（1×）を加え、そして室温で15分間、全ての画分をインキュベートします。
  3. 直前の分析、を1μg/ mlの最終濃度になるようにヨウ化プロピジウムを添加（1：100μg/ mlの100希釈）。細胞数およびVIを決定するために、自動細胞カウンターを使用してください能力。フローサイトメトリー分析のために細胞計数デバイス推奨ソフトウェアを使用してください。 、元の負と正の分画用白血球の絶対数を決定します。
    注：細胞計数分析のために採取した試料1mlあたり生存白血球の細胞数は、細胞分析装置推奨されるソフトウェアを用いて決定されます。
  4. 図2（領域5、生存可能な白血球）に示すように地域を設定します。細胞数を決定するには、次のゲーティング戦略を使用してください。元の画分中の生存白血球は、図2に示されています。
  5. 次のように示した領域（ 図2、1-6）は、階層的に以下のとおりです。
    1：タイムゲート→2：→3シングル細胞：CD45 +細胞 →4：白血球（残骸を除く）→5：実行可能な白血球→6：生存リンパ球
  6. ネガティブとポジティブ画分について細胞数を決定するために、同じ手順を繰り返します。全画分の細胞数を計算しますサンプル画分（ 表2）の総体積の希釈係数を考慮することによって。

分離性能の検討4。

  1. 予備冷却し、PBS / EDTAバッファー/ 0.5％AB血清でQCB、NTCBおよびTCB分数細胞のアリコートを洗います。 4℃で5分間、300×gで細胞を遠心分離し、上清を吸引します。
  2. 含む100μlの抗体 - 蛍光色素染色混合物中に再懸濁細胞：CD3-FITC、CD4-APC、CD8-APC-Vio770、CD14-PerCPを、CD20-PerCPを、CD45-VioBlueにおよび抗IFNγ-PE（力価1:11）と4℃で10分間、暗所でインキュベートします。
  3. 1 mlの新たに調製した赤血球溶解液（1×）を加え、室温で15分間インキュベートします。 4℃で5分間、300×gで遠心分離し、上清を吸引除去します。 PBS / EDTAバッファ/ 0.5％AB血清の適切な量で細胞を再懸濁します。
  4. 100 diluti：1 / mlの直前分析（1の最終濃度にヨウ化プロピジウムを追加）100μg/ mlのの上。試料の純度を評価するために、フローサイトメトリー分析を実行します。
  5. CCS濃縮処理後の陽性画分に示されているCD3 + T細胞を決定するための実行可能な白血球ゲーティング戦略のCD3 + T細胞を計算するには、次のゲーティング戦略を使用してください。次のように示した領域（ 図3Aおよび3B、1-6）は、階層的にリンクされます。
    1：タイムゲート→2：→3シングル細胞：CD45 +細胞 →4：細胞（残骸を除く）→5：実行可能な白血球→6：生存CD3 +細胞集団
  6. CD4 +、CD8 +、CD4 + IFN-γ+およびCD8 + IFN-γ+ CCS濃縮処理後のT細胞（ 表2）の頻度を決定します。
  7. Fの下に示すCD4 +、CD8 +、CD4 + IFN-γ+およびCD8 + IFN-γ+ T細胞の頻度を決定するためのゲーティング戦略を使用してまたはCCS処理後の元と濃縮された（取り込まれ）陽性画分。示された領域は、階層的にリンクされ、次のように名前が付けられています。
    1：タイムゲート→2：→3シングル細胞：CD45 +細胞 →4：細胞（残骸を除く）→5：実行可能な白血球→6：生存CD3 +細胞→7：CD4 +細胞→7A：CD4 + IFN-γ+細胞（ボックス）→8：CD8 +細胞→8A：CD8 + IFN-γ+細胞 （ボックス）

注：階層リンクの最初の6示した領域は、（1-6）を、図3と同様であり、最後の2つの領域は 、図4（6-8a）に示されています。

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結果

本研究では、自動化された細胞の濃縮CCSシステムは、CMVのpp65特異的T細胞の自動化生産のために使用しました。 CMV特異的T細胞は、3つの細胞アフェレーシス産物から濃縮しました。定常状態のアフェレーシス産物は、CMV血清陽性ドナーから2時間かけて回収し、10 10合計核細胞（TNC）を生成しました。 10 9 TNCは、その後4時間のCMVのpp65由来ペプチド（60ナノモル）で活性化し、IFN-γを分泌するT細胞を、自動細胞濃縮装置でCCSを用いて単離しました。オペレータは、すべての試薬およびチューブセットをロードするために、実験の開始時に必要でした。デバイスを開始する最初の開梱からシステムのセットアップは約60〜120分を要しました。マシンは、試薬およびチューブセットは（夜間など）無人で動作するマシンを可能にすることにより、ロードされた後に起動するようにプログラムすることができ、注意してください。オペレータはの特徴付けを行うために15時間後に再び必要とされました細胞の純度および生存のために最終製品。濃縮した後、細胞上清をマイコプラズマおよびエンドトキシンの存在についてスクリーニングし...

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ディスカッション

養子T細胞療法は、B細胞悪性腫瘍4を処置するための実行可能な選択肢として浮上しています。その治療可能性は、複製の老化2を欠く標的抗原特異的T細胞の所望の数の注入に依存します。これは、現在の適正製造基準に準拠して増殖したT細胞の抗原特異的T細胞の純粋な集団を選別することによって達成することができます。二つのソート手順が広く、すなわち、蛍光活性化セルソーティング（FACS）、使用されていると我々は最近5検討したように、磁気活性化細胞選別（MACS）は、CMV抗原特異的T細胞を生成します。他の上の1つの戦略を使用することの利点は、 表5に概説されている。MACS技術は、FACS技術に比べ安く、より高速な方法で最も高い細胞濃縮純度を提供しています。細胞濃縮のための使い捨てカラムおよび試薬の添加の使用法では完全にそれを作る試料汚染にサンプルを防ぎます簡単に臨床現場に適用します。半自動化された細胞濃縮装置は、労働集約的で時間自動化された細胞濃縮装置のように開発を消費している臨床需要を供給する必要がありました。

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開示事項

MDアンダーソンがんセンターと博士はクーパーの両方がZIOPHARMオンコロジー社、およびIntrexon社の金融関心を持っています。 2015年5月7日に、博士はクーパーはZIOPHARM腫瘍学で最高経営責任者（CEO）に任命されました。博士はクーパーは現在、MDアンダーソンでの客員研究員です。博士はクーパーは彼が人工ヌクレアーゼでサンガモバイオサイエンスと特許を持つInCellerate社を設立し、所有しています。彼はTargazyme株式会社（旧アメリカン幹細胞、株式会社）、GEヘルスケア、フェリング医薬品、運命のTherapeutics、ヤンセンファーマ、ブリストル・マイヤーズスクイブ社と協議。彼はセレクティスの科学諮問委員会です。彼は、ミルテニーバイオテク社から謝礼金を受け取ります。

謝辞

評価研究のための試薬とCliniMACS Prodigy機器を提供してくださったドイツのMiltenyi Biotecに感謝します。原稿の校正をしてくださったGeorge T. McNamara氏(MDアンダーソンがんセンター小児科)に感謝します。助成金支援:がんセンターコア助成金(CA16672);RO1(CA124782、CA120956、CA141303;CA141303);R33(CA116127);P01(CA148600);バロウズウェルカムファンド;テキサス州のがん予防研究所;CLLグローバル研究財団;ノエラン・L・バイブラーの邸宅。ギルソン・ロングエンボー財団;ハリー・T・マングリアン・ジュニア、白血病免疫療法基金;個別化がん治療研究所;白血病リンパ腫協会;リンパ腫研究財団;MDACCの姉妹機関ネットワーク基金。ミラー財団;ハーブ・シモンズ氏;ジョー・H・スケールズ夫妻。トーマス・スコット氏;国立がん研究財団;小児がん研究財団;ウィリアム・ローレンスとブランシュ・ヒューズ子供財団。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
CliniMACS PBS/EDTA バッファー 3 L バッグMiltenyi Biotec GmbH700-29
CliniMACS Prodigy チューブセット TS 500Miltenyi Biotec GmbH130-097-182
5 L ゴミ袋Miltenyi Biotec GmbH110-004-067
CliniMACS サイトカイン キャプチャ システム (IFN-γ)Miltenyi Biotec GmbH279-01
アルブミン (ヒト) 25% Grifols58516-5216-2
Luer/Spike InterconnectorMiltenyi Biotec GmbH130-018-701
0.9 % NaCl Solution (1 L)Miltenyi Biotec GmbH
MACS GMP PepTivator HCMV pp65Miltenyi Biotec GmbH170-076-109
Water for injectionsHospira, inc, Lake Forest, ILNDC-0409-4887-10
MILLEX GV フィルターユニット 0.22 μm MilliporeSLGV033RB
TexMACS GMP Medium 2 L bagMiltenyi Biotec GmbH170-076-306
トランスファーバッグ、150 ml (細胞出発物質用)Miltenyi Biotec GmbH130-018-301
CryoMACS Freezing Bag 50Miltenyi Biotec GmbH200-074-400
60 ml シリンジ、滅菌BD、Laagstraat、Temse、ベルギー309653
CMVセロ陽性アフェレーシス製品Key Biologics, LLC, Memphis
Flow Cytometry MaterialsManufacturerカタログ番号
AB Serum, GemCellGemini Bio-Products, West Sacramento, USA100-512
CD3-FITCMiltenyi Biotec GmbH130-080-401
CD4-APCMiltenyi Biotec GmbH130-098-033
CD8-APC-Vio770Miltenyi Biotec GmbH130-098-065
CD14-PerCPMiltenyi Biotec GmbH130-098-072
CD20-PerCPMiltenyi Biotec GmbH130-098-077
CD45-VioBlueMiltenyiBiotec GmbH130-098-136
aIFN-γ-PE, humanMiltenyi Biotec GmbH130-097-940
CD3-PEMiltenyi Biotec GmbH130-091-374
ヨウ化プロピジウム溶液 (100 µg/ml)Miltenyi Biotec GmbH130-093-233
Equipmentメーカーカタログ番号
CliniMACS Prodigy Device Miltenyi Biotec GmbH200-075-301
ソフトウェア V1.0.0.RC
MACSQuant Analyzer 10Miltenyi Biotec GmbH130-096-343
ソフトウェア 2.4
遠心分離機 5415R Eppendorf AG22331
セロメーター K2Nexelom Bioscience, Lawrence, MALB-001-0016
滅菌チューブ溶接機 SCDIIBTerumo Medical Corp., Elkton, MA7811

参考文献

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