Colocalizational解析による受容体後の内在トラフィッキングにおける薬物誘発性の変更の追跡

Summary

受容体の輸送は、リガンドへのシグナル伝達と細胞応答を調節し、リガンド誘導シグナル伝達を含む細胞条件に応じて、それ自体です。ここでは、定量的に免疫標識とcolocalizational分析を用いて薬剤誘発性受容体の輸送を評価するための強力で柔軟な技術が記載されています。

Abstract

受容体の細胞内輸送は、複雑で高度に制御されたプロセスの集合体です。受容体輸送は、シグナル伝達とリガンドに対する細胞全体の応答性を調節し、それ自体が、リガンド誘導シグナル伝達を含む細胞内および細胞外の条件の影響を受けます。このプロトコルは、単層めっき培養細胞での使用に最適化されていますが、浮遊組織スライスに拡張可能で、免疫標識および共局在分析を使用して、外因性薬物治療を含む慢性/長期および急性の介入後の細胞内受容体輸送の変化を追跡します。薬物治療後、細胞は受容体と目的の細胞内コンパートメントのマーカーに対して二重免疫標識されます。次に、シーケンシャル共焦点顕微鏡法を使用して、個々の細胞の2チャンネル顕微鏡写真をキャプチャし、コンピューター化された共局在分析を受けて定量的な共局在スコアを算出します。これらのスコアは、統計解析の前に独立した反復をプールできるように正規化されています。代表的な顕微鏡写真は、例示的な図を生成するために処理されることもあります。ここでは、誘導された受容体輸送を定量的に評価するための強力で柔軟な手法について説明します。

Introduction

受容体、特にGタンパク質共役受容体（GPCR）は、日常的に、細胞表面¹から、細胞内トラフィッキングされます。これらの複雑に画策し、厳密に制御プロセスは、細胞の利用可能な受容体の相補体を決定し、受容体の時間的活動、脱感作、および再感作²調節^{- 4。}重要なことに、これらの方法は、薬物誘発性受容体活性または非アクティブを含む細胞環境に応答します。つまり、受容体におけるリガンドのアクションは、それによって細胞の応答性を変化させること、これらの受容体の細胞内輸送を変更することができます。このように、外部のリガンドも、古典的なメッセンジャーツーエフェクターカスケード^5,6超え、細胞機能にさらにより効果を発揮します。

誘導された受容体の輸送におけるこのような変化を調べることは困難です。すべての利用可能な技術には制限が伴います。ビオチン保護アッセイは、MONIするために使用されていますTOR表面受容体集団。これらの受容体は、ビオチン化され、免疫沈降の時間経過は、時間をかけて、ビオチン化受容体の減少を定量化するために行われます。この技術は、本質的に受容体⁷の初期、標識された、人口の緩やかな低下を監視し、このプロセスの時間のコースを構築する上で非常に有用です。残念ながら、このアッセイは、内在、リサイクル、または新規の受容体などの受容体のオリジナルプールの劣化以外のプロセスを監視することができません。また、50kDaの範囲の受容体への150kDaの範囲内の抗体の添加は、受容体のトラフィッキング^8,9を変更することができ、この技術は、低発現レベルの受容体で使用することは困難です。

他の手順は、細胞内輸送区画（ 例えば、エンドソームなど）を特定し、目的の受容体との共局在を評価するために様々な方法を使用します。これは、私たちを含みます受容体および区画マーカーの蛍光タンパク質タグ付きキメラ構築物（ 例えば、ラブファミリーGTPアーゼ）を発現する異種系の電子。これは、潜在的に固定および透過処理に関連する問題を除去する、生細胞イメージングの使用を可能にします。複数の生理学的に代表的な細胞型と人身売買の動作と互換性がない上のタグおよび発現レベル効果：強力な一方で、このような戦略は、一般的には、異種システムの同じ制限を受けます。もっと一般に、染料が容易に細胞内区画を標識するために使用される（ 例えば、リソソーム、表向きは^）10。染料は、しかし、（リソソームのための染料の場合には、すべての酸性オルガネラ）の特異性を欠くことができ、他の区画を通じて人身売買を評価しません。さらに、これらの技術は、システムおよび実験条件にわたってかなりの制御を可能にし、以下、本明細書に提示共局在分析方法から利益を得ることができます。

w法ここで本eは共局在によって受容体輸送の追跡を洗練します。適切なマーカーを標識するために免疫細胞化学（ICC）を使用して、複数の異なる細胞内区画を同定することが可能です。これはまた、異種システムの代わりに、生理的に関連の初代細胞培養物を使用することができます。このICCプロトコルは、標識の前に目的の細胞を固定することを含みます。これは、薬物治療（単数または複数）は、以下の特定の時点での標識を可能にします。これは、その時点でグローバル受容コンパートメントアソシエーションの「スナップショット」を作成します。複数の時点では、トラフィッキングの変化の時間経過をも構成することができます。

簡単に述べると、細胞を、受容体および興味のある細胞内区画のために標識された薬剤処理し、共焦点画像化され、そして顕微鏡写真は、数学的に、受容体コンパートメント¹¹の共局在化を定量するために分析されています。私達の使用では、Raが、受容体の共局在を調べましたB5、Rab11が、リソソーム関連膜タンパク質1（LAMP1）。これらのマーカーは、それぞれ、初期エンドソーム、リサイクルエンドソーム、およびリソソームを識別します。これらの共局在化対策は内在、リサイクル、分解¹²の包括的なプロセスのためのプロキシとして機能します。

すべての技術と同様に、いくつかの制限が考慮されるべきです。によるすべての個々のニューロンが解析された画像へのニーズに、この技術は、関連する条件および時点の数に応じて、非常に労働集約的になることができます。すべての免疫標識はまた、固定および透過性¹³によって引き起こされる細胞の超微細構造、タンパク質の局在化、およびエピトープのアクセシビリティへの影響に対応しなければなりません。

もともと一次感覚ニューロンの初代培養物での使用に最適化しますが、この方法は、他の単層メッキ培養モデルと広く互換性があります。

数学的に定量化さmeasurの使用共局在のeは特に、はるかに方法論的に、多くの場合、視覚的に検査し、マルチチャネルのオーバーレイ¹⁴のような漠然とした、主観的な措置に依存してきた受容体輸送の変化を評価するために使用される従来の技術よりも厳格です。

この技術は、（前の初代培養の世代に）in vivoでの介入（培養増殖中）、in vitroでの介入との幅広い互換性のために特に有用であり、種々の標識は^15を対象と^しています。このように、多くの異なった研究課題に適合させることができます。

Protocol

注：このプロトコルは、様々な単層メッキ細胞/組織培養モデル、薬物治療計画、およびラベリングの対象と広く互換性があります。したがって、実際の使用では、多くの特定のパラメータは、実験計画に基づいて変化します。ここでは、これらのユーザ定義パラメータへの参照は、一般的なものです。代表的な結果を得るために使用される例示的条件は、イタリック体に含まれています。

1.ソリューション

1. 0.1Mトリス緩衝高張（300 mM）の生理食塩水および0.05％ポリソルベート20を混合することにより、洗浄用緩衝液を調製します。 RTでpHを7.4。
2. ブロッキングバッファーを準備します。 0.05 Mトリス緩衝高張（300 mM）の生理食塩水、0.05％ポリソルベート20、3％ウシ血清アルブミン（BSA）および0.1％冷魚皮ゼラチンを追加し、室温でpHを7.4に調整します。
3. 0.05 Mトリス緩衝高張（300 mM）の生理食塩水に0.05％ポリソルベート20、1％BSA、0.1％冷魚皮ゼラチンを添加することにより、抗体希釈液を調製し、4 ^O℃でpHを7.4に調整
   注：トリス緩衝液のpHは温度依存性です。つまり、温度変化は、溶液のpHが変化し、あります。一貫性を保つため、これらのバッファは常に、それらが使用される温度でpH調整すべきです。

2.細胞培養

注：適切な細胞培養プロトコルが使用される細胞型（単数または複数）に基づいて変化します。これらの手順は、個別に最適化する必要があります。詳細な細胞培養方法は^、16を含め、容易に入手可能です。同様の手順は、顕著な違いで、代表的な結果を得るために使用しました。

1. 成体動物由来の培養後根神経節ニューロン^12を説明したように。細胞を培養するために、成体ニューロンの増殖培地を使用してください。むしろグルタミン酸よりも、プレプレーティングによってグリア細胞密度を減らします。これは、少なくとも30〜60プレートあたりのニューロンとapproximatに成長に伴うグリア細胞と12ラウンドのガラスカバースリップ上で増殖させた混合ニューロン - グリア培養をもたらしますエリー40％の密集度。これは、初代培養神経細胞は複製されないことに留意すべきであるとグリアを過剰増殖させる場合、共培養グリアによってプレートから離れてプッシュされます。ニューロンへの影響を回避するために、グリア数の物理的減少は、化学的/薬理学的方法に好適です。
   注：このプロトコルの目的のために、私たちは目的の細胞は、それらの実験的に所望の状態と単層メッキに成長していることを前提としています。我々は、24ウェルプレートに12ラウンドのガラスカバースリップ上にプレーティングすることは最も便利であることがわかります。記載されているすべてのボリュームおよび手順は、24ウェルプレートの1つのウェル内の1つのカバーガラスに適しています。

培養細胞の3薬物治療

注：複数の連続、または重複は、薬物治療が可能です。薬、用量/濃度、および使用される露光の持続時間は、特定の実験に依存することになります。

1. 元の成長培地^16を削除と選択された濃度（s）で、目的の薬剤（複数可）を含む培地に交換してください。この場合には、モルヒネの10μMの生理食塩水に可溶化またはコントロールとして生理食塩水を使用してください。
   注：これは、それぞれ独立して複製（一般に、単一の24ウェルプレート培養）は、同じ共通の制御条件が含まれていることが重要です。これは、試行間の変動を補正する、反復間でのデータの正規化を可能にします。
2. 48時間¹⁶元の成長条件で細胞をインキュベートします。
3. その後の薬物治療のために、繰り返しがデルトルフィン1μM、SNC80 1μM、または車両と3.1と3.2のステップと60分¹²インキュベートします。水にデルトルフィンIIを可溶化し、40μMのHClおよび超音波処理中に10mMでSNC80を可溶化、水中で1 mMのに希​​釈しました。
   注意：このプロトコルは、それらが選択された増殖培地中で所望の濃度（複数可）に溶解させてもよいことは、薬剤（単数または複数）は、可溶化されているのを前提としています。のための適切な手順このような可溶化は問題の薬物に依存して変化し、個別に最適化する必要があります。
4. 1回の洗浄あたりの洗浄バッファー〜1mlで、静かに3回細胞を洗浄します。 （洗浄緩衝液で、この場合には）必要に応じて、静かに、新鮮な溶液とよく補充、ウェルから液体を吸引し、その後速やかに、そして静かにして、各洗浄を行います。

4.固定および免疫細胞化学

注：特定の標識ターゲットは実験により異なります。説明したように私たちの使用時には、我々は、デルタオピオイド受容体（DOR）とRab5の、ラブ11、およびランプ1のラベル。使用される特定の抗体は特定の実験に依存することになります。最適な標識条件は、（IES）が使用される特定の抗体に依存しています。このトピックの多くのより完全な議論は以下の通りです。

1. 37ºCで10分間〜0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水で300μlの4％パラホルムアルデヒドを浸漬することによって細胞を固定。
   注：これは、4％のパラことが重要ですホルムアルデヒドを新たに起因以前に凍結パラホルムアルデヒドの使用によって引き起こされる自家蛍光に調製すること。
2. 3.3で説明したように、1回の洗浄あたりの洗浄バッファー〜1mlで、穏やかに3回細胞を洗浄します。
3. RTで2時間ブロッキング緩衝液300μlの細胞をインキュベートします。
4. 4ºCで48時間、抗体希釈液300μlの中で一次抗体で細胞をインキュベートします。私達の使用において、一次DORに対する抗体（ウサギ抗DOR）との1：Rab5の（マウス抗Rab5の）、ラブ11（マウス抗Rab11が）、およびLAMP1（ヤギ抗LAMP1）。
5. 3.3で説明したように、1回の洗浄あたりの洗浄バッファー〜1mlで、穏やかに3回細胞を洗浄します。
6. 異なる蛍光体にコンジュゲート二次抗体を用いて細胞をインキュベートし、室温で1時間、抗体希釈液300μlの中（下の説明を参照）。この、およびその後のすべての段階では、光から細胞を保護します。代表的な結果を得るためには、緑色発光蛍光団結合抗ウサギとeithを使用ER赤色発光蛍光団結合抗マウスまたは赤色発光蛍光団結合抗ヤギ。
7. 3.3で説明したように、1回の洗浄あたりの洗浄バッファー〜1mlで、穏やかに3回細胞を洗浄します。
8. 〜45°でプレートを保持し、各ウェル中の洗浄バッファー〜1ミリリットルを残して24ウェルプレートから12ラウンドのカバーガラスを外し、細かい鉗子を使用して、井戸床から離れカバースリップをレバー。カバーガラスは、それが簡単に鉗子を使用して除去することができる場所から、ウェル壁に対して休むようになってきます。
9. 退色防止封入剤でスライドする顕微鏡に、カバーガラス、細胞側を下にしてマウントします。

5.顕微鏡の設定

1. 高倍率の対物レンズ（100X）を使用して、最初のエピ蛍光を用いて画像化される代表的なセルを探します。
2. 例えば使用した各蛍光体の検出、488 nmおよび59（ラベル付けされた各チャネルの8ビット非圧縮のTIFF画像を記録する画像キャプチャの設定を行います4 nm）は、各チャンネルを順次画像に（いずれかの行またはフレーム）によって、最終的な画像の平均4〜6スキャンします。最適な画像の解像度は、顕微鏡に固有になりますが、1024×1024は、一般的に良好な結果が得られます。
3. 共焦点イメージング経路に切り替えて、セルの中心を通ってz平面に焦点を当てています。
4. ピンホール（典型的には1エアリー単位）、レーザパワー、および光電子増倍管電圧（ゲイン）を最適化し、各チャンネルのオフセット。これらの設定を記録/保存します。同じ複製内の任意のターゲットのペアのために標識され、すべてのセルを画像化するために同じ顕微鏡の設定を使用します。
   注：このプロセスは、通常、このセルは、解析のために画像化されるべきではないことに十分な光退色になります。

6.イメージング

1. 高倍率の対物レンズ（ 例えば 、100X）を使用して、最初のエピ蛍光を用いて画像化されるべきセルを探します。
2. 共焦点イメージング経路に切り替えて、セルの中心を通ってz平面に焦点を当てています。私利用可能なfは、目的の細胞にスキャン範囲を制限するために、ソフトウェアのズーム/トリミングを使用しています。
3. 以前に確立された設定を使用して、各標識されたチャネルのための画像をキャプチャします。繰り返し、十分なサンプルを確保するために、複製ごとの条件当たり6.1から6.3イメージへの15以上の細胞を繰り返します。

7.共局在解析

1. 一対の画像を開きます（ たとえば 、「グリーン」と「赤」）ImageJの中の細胞の。 RGB画像を生成するには、コマンド...>カラー>チャンネルをマージ画像を使用してください。
2. 目的の細胞の周囲に選択範囲を描画します。選択したセル内のターゲットの共局在を定量化するために、（https://www.cpib.ac.uk/tools-resources/software/psc-colocalization-plugin/から入手できる^11）「PSC共局在を「プラグインのImageJを使用してください。
3. 目的の共局在尺度（典型的には、ピアソンのR ^17）を記録します。繰り返しは、各画像形成されたセルのための7.1から7.3のステップ。

8.データの正規化

1. 各標識条件の各反復の共通の制御条件の記録共局在値の平均を計算します。
   注：例えば、ニューロンの共局在値の平均「48時間の車、60分車「3標識条件（受容体と3区画のそれぞれ）のそれぞれに3つの独立した反復のそれぞれにおける薬物条件。
2. それぞれのオフセットを得るために（-1）を乗算する手段は、各標識状態で複製します。その複製の各共局在値に各ラベリング状態で各反復のオフセットを追加します。
   注：これは一般的な制御条件の平均共局在の尺度は、各標識条件の各反復で0になるようにデータを正規化します。
3. 各標識条件のすべての複製からのデータをプール。
   注：共局在の変化は今複製渡って分析することができます。統計肛門ysisは実験計画に依存するが、一般的に、適切な事後検査（ 例えば 、テューキー）が続く（ANOVA）分散分析を伴います。統計的リソースについては、 例えば ^、18を参照してください。

Results

この技術を使用して、長時間/慢性および急性の薬物治療の両方を、次の受容体内在化後の輸送の変化を定量化することが可能です。薬物治療、固定、および標識した後に、高解像度の2チャンネルの顕微鏡写真は、興味のある各セルの捕捉されます。代表的な画像は、説明の図（ 図1）を生成する偽色の共局在と組み合わせることができます。その後のcolocalizational分析、説明したように、ターゲット·ターゲット共局在化（ 例えば、受容体コンパートメントマーカー）の定量的なスコアが得られます。これらのデータは、薬物治療（S）（ 図2）により誘導される受容体のトラフィッキング、この場合には、変化を比較するために使用することができます。

FALと受容体との区画マーカー標識の図1.代表的な顕微鏡写真

Discussion

我々は、成人の後根神経節ニューロンの初代培養物（一次感覚ニューロン）の分析のためにこのプロトコルを最適化しました。また、広く、単層メッキ培養細胞について、ほとんど、またはまったく変更することなく、使用することができます。 colocalizational分析しかし、薬物治療、および組織固定/製剤成分は適切ではない、組織切片および他のそのような調製物¹¹も可能です。

興味深いのは、ここに提示ICC方法にかかわらず、その後の分析（ 例えば^、19）の、組織切片中の二重標識免疫組織化学を実行するために、適切な固定および組織調製物も使用することができます。

このプロトコルは、異なる標識ターゲットと広く互換性があります。播種した細胞の各カバーガラスは、二重標識されます。通常、これは、目的の受容体および目的の区画のうちの一つのマーカーのためのものです。そこ通常、複数の異なる区画を有する受容体の共局在を調べるために、複数の標識条件となります。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trizma Base	Sigma Aldrich	T1503-500G
塩化ナトリウム	Sigma Aldrich	S9888-500G
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-500
塩酸	Sigma Aldrich	258148
牛血清からのアルブミン	Sigma Aldrich	A7906-100G
冷水魚からのゼラチンスキン	シグマ アルドリッチ	G7041-100G
コーニング コスター 細胞培養プレート: 24 ウェル	フィッシャー サイエンティフィック	720084
12 サークル 顕微鏡カバー ガラス	フィッシャー サイエンティフィック	1254580
アクア/ポリマウント	ポリサイエンス	18606-20
リン酸ナトリウム モノベーシック	シグマ アルドリッチ	S9638-500G
ナトリウムリン酸塩二塩基性	Sigma Aldrich	S9763-500G
パラホルムアルデヒド	Polysciences	00380-1
Dumont #5 鉗子 - スタンダード/デュモクセル	ファイン サイエンス ツール	11251-30
ウサギ抗 DOR 抗体	MyBioSource	MBS316175	1:1,500 マウス
抗 Rab5 抗体	Sigma Aldrich	R7904	1:750 で使用
マウス抗Rab11抗体	ミリポア	05-853	1:500で使用
ヤギ 抗LAMP1抗体	サンタクルス	SC8098	1:750で使用
ロバ 抗ウサギ アレクサ488 標識抗体	ライフテクノロジー	ズ A-21206	1:200〜1:2,000で使用
ヤギ抗マウス アレクサ594標識抗体	ライフテクノロジー	ズ A-11005	1:200〜1:2,000で使用
ロバ抗ヤギ アレクサ594 標識抗体	ライフテクノロジー	ズ A-11058	1:200〜1:2,000で使用