Colocalizational解析による受容体後の内在トラフィッキングにおける薬物誘発性の変更の追跡

Edmund Ong; Catherine Cahill

doi:10.3791/52824

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方法論記事

Colocalizational解析による受容体後の内在トラフィッキングにおける薬物誘発性の変更の追跡

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DOI:

10.3791/52824

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2015年7月3日

Edmund Ong¹^,² , Catherine Cahill¹^,²^,³

¹Department of Anesthesiology and Perioperative Care, University of California Irvine, ²Department of Biomedical and Molecular Sciences, Queen's University, ³Department of Pharmacology, University of California Irvine

この記事について

サマリー

受容体の輸送は、リガンドへのシグナル伝達と細胞応答を調節し、リガンド誘導シグナル伝達を含む細胞条件に応じて、それ自体です。ここでは、定量的に免疫標識とcolocalizational分析を用いて薬剤誘発性受容体の輸送を評価するための強力で柔軟な技術が記載されています。

要約

受容体の細胞内輸送は、複雑で高度に制御されたプロセスの集合体です。受容体輸送は、シグナル伝達とリガンドに対する細胞全体の応答性を調節し、それ自体が、リガンド誘導シグナル伝達を含む細胞内および細胞外の条件の影響を受けます。このプロトコルは、単層めっき培養細胞での使用に最適化されていますが、浮遊組織スライスに拡張可能で、免疫標識および共局在分析を使用して、外因性薬物治療を含む慢性/長期および急性の介入後の細胞内受容体輸送の変化を追跡します。薬物治療後、細胞は受容体と目的の細胞内コンパートメントのマーカーに対して二重免疫標識されます。次に、シーケンシャル共焦点顕微鏡法を使用して、個々の細胞の2チャンネル顕微鏡写真をキャプチャし、コンピューター化された共局在分析を受けて定量的な共局在スコアを算出します。これらのスコアは、統計解析の前に独立した反復をプールできるように正規化されています。代表的な顕微鏡写真は、例示的な図を生成するために処理されることもあります。ここでは、誘導された受容体輸送を定量的に評価するための強力で柔軟な手法について説明します。

概要

受容体、特にGタンパク質共役受容体（GPCR）は、日常的に、細胞表面¹から、細胞内トラフィッキングされます。これらの複雑に画策し、厳密に制御プロセスは、細胞の利用可能な受容体の相補体を決定し、受容体の時間的活動、脱感作、および再感作²調節^{- 4。}重要なことに、これらの方法は、薬物誘発性受容体活性または非アクティブを含む細胞環境に応答します。つまり、受容体におけるリガンドのアクションは、それによって細胞の応答性を変化させること、これらの受容体の細胞内輸送を変更することができます。このように、外部のリガンドも、古典的なメッセンジャーツーエフェクターカスケード^5,6超え、細胞機能にさらにより効果を発揮します。

誘導された受容体の輸送におけるこのような変化を調べることは困難です。すべての利用可能な技術には制限が伴います。ビオチン保護アッセイは、MONIするために使用されていますTOR表面受容体集団。これらの受容体は、ビオチン化され、免疫沈降の時間経過は、時間をかけて、ビオチン化受容体の減少を定量化するために行われます。この技術は、本質的に受容体⁷の初期、標識された、人口の緩やかな低下を監視し、このプロセスの時間のコースを構築する上で非常に有用です。残念ながら、このアッセイは、内在、リサイクル、または新規の受容体などの受容体のオリジナルプールの劣化以外のプロセスを監視することが....