方法論記事

牛にエフェクターおよびメモリーT細胞応答を評価するための長期培養インターフェロンγ酵素結合免疫アッセイの応用

DOI：

10.3791/52833

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2015年7月11日

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1Infectious Bacterial Diseases Research Unit, National Animal Disease Center, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, 2Department of Veterinary Pathology, College of Veterinary Medicine, Iowa State University, 3UK Veterinary Laboratories Agency, 4Visual Services, National Centers for Animal Health, Animal and Plant Health Inspection Service, United States Department of Agriculture

この記事について

サマリー

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長期培養インターフェロンγ酵素結合免疫アッセイは、中央メモリー応答の尺度として用い、保護抗マイコバクテリアワクチン応答と相関されます。このアッセイでは、末梢血単核細胞を、分化、中央メモリーT細胞の拡大を可能にする、14日間マイコバクテリア抗原およびインターロイキン2で刺激します。

要約

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エフェクターおよびメモリーT細胞は、抗原認識以下のナイーブ細胞の発達プログラミングにより生成されます。感染は、拡張期の間に生成さT細胞の95％までに制御されている場合は除去される（ すなわち 、収縮期）およびメモリーT細胞は、時々一生残ります。ヒトでは、メモリーT細胞の機能的に異なる2つのサブセットは、リンパ節ホーミング受容体の発現に基づいて説明してきました。セントラルメモリーT細胞は、CCケモカイン受容体7、CD45ROを発現し、主に二次リンパ器官のT細胞領域に配置されています。エフェクターメモリーT細胞は、CD45ROを発現する末梢または炎症組織へのリンパ球ホーミングに関連するCCR7とディスプレイの受容体を欠いています。エフェクターT細胞はCCR7またはCD45ROが、このようなインターフェロンγなどの抗原の生産のエフェクターサイトカイン、との出会いの際にどちらかを発現しません。インターフェロンγ放出アッセイは、ウシおよびヒトの結核の診断のために使用され主にエフェクターとエフェクターメモリーT細胞応答を検出します。非ヒト霊長類、マウスにおける結核、およびヒトにおけるマラリアのサル免疫不全ウイルス感染に示されたようにワクチン接種にCD4 + T細胞によるセントラルメモリーT細胞応答が、一方、ワクチンの有効性を予測するために使用することができます。マウス及びヒトならびに家畜上の未発表のデータにいくつかの研究は、インターフェロンγELISPOTアッセイは、中央メモリーT細胞応答を測定することを実証しました。このアッセイでは、末梢血単核細胞を、10〜14日（長期間培養）のための抗原の濃度を減少させるエフェクター応答がピークと衰退させることで培養します。文化の中で区別し、拡大するために中央メモリーT細胞を容易にします。

概要

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エフェクターおよびメモリーT細胞は、抗原認識後のナイーブCD4 + T細胞の発達プログラミングにより生成されます。サイトカイン産生細胞へのナイーブCD4 + T細胞の分化は、先天性免疫細胞、T細胞共刺激偏サイトカイン産生を生じる転写変化の抗原提示による病原体の認識を必要とします。たとえば、抗原提示細胞は、一緒に抗原認識に、シグナル伝達および活性化因子を介したシグナル伝達によりTヘルパーに1（のTh1）細胞1,2 T細胞の分化を促進し、細胞内病原体に応答して、インターロイキン（IL）-12を産生します転写4（STAT4）とTボックスは、細胞活性化、IL-2産生、クローン性増殖およびインターフェロン（IFN）-γ産3,4に至る、T細胞（T-BET）で表されます。感染が制御されている場合は、拡張期の間に生成されたT細胞の最大95％が除去される（ すなわち 、収縮相）及び記憶T細胞は、時々 、寿命5のために、残っています。 Sallusto ら 6、リンパ節ホーミング受容体の発現に基づいて、ヒトにおけるメモリーT細胞の機能的に異なる2つのサブセットを明らかにしました。セントラルメモリーT細胞（TCM）は、CCケモカイン受容体（CCR）-7およびCD45ROを発現し、主に二次リンパ器官のT細胞領域に配置されています。 TCMは、エフェクター機能、低活性化閾値を限定し、高IL-2生産及び増殖能力を保持しています。エフェクターメモリーT細胞（TEM）CD45ROを発現し、末梢または炎症組織へのホーミングのためCCR7とディスプレイの受容体を欠いています。エフェクター細胞は、CCR7またはCD45ROのいずれかを発現するが、速やかに抗原認識時に、IFN-γなどのエフェクターサイトカインを産生しません。

IFN-γ放出アッセイ（IGRA）は、ウシおよびヒト結核7の診断に使用されている。 ウシ結核菌 、ウシ結核（BTB）の主要な薬剤である人間のCAながら結核のSESは、 結核菌によって主に引き起こされます。これらの試験では、全血または末梢血単核細胞（PBMC）は、16〜24時間、マイコバクテリア抗原で刺激し、上清中でIFN-γ産生をELISAによってまたはELISPOT技術を用いてIFN-γを産生する細胞の検出によって測定される。と短い刺激期間（ すなわち 、16〜24時間）、および迅速なサイトカイン産生の結果として、 エクスビボアッセイは、主にエフェクターおよびTEMの応答を検出します。これは、これらの培養物8-10中の細胞集団のフローサイトメトリー分析によって確認されました。

エクスビボ IFN-γ応答は、日常的に家畜による応答を評価するために使用されるものを含む、結核ワクチンの免疫応答パネル評価に含まれます。最も効果的な牛結核ワクチンは、特異的IFN-γ応答を誘発するが、IFN-γ応答を誘導しないすべてのワクチンがprotectivですE。また、ワクチン接種によって誘発されるIFN-γのレベルは、感染の前に測定されるように、必ずしも保護と相関しません。例えば、異なるBCG株は、同様の保護レベル11にもかかわらず、 エクスビボでのIFN-γ応答を誘導する異なる能力を有することができます。したがって、ex vivoで IGRAsは結核診断のためのワクチンの免疫原性にアクセスするために価値があります。しかしながら、ワクチンの有効性の予測因子としてのそれらの使用は制限されます。ワクチン接種に対するTCM応答が、一方、ヒト15,16のマウス14及びマラリアにおける結核、非ヒト霊長類12,13におけるサル免疫不全ウイルス（SIV）感染に示されているように、ワクチンの有効性を予測するために使用することができます。

病原体のクリアランスをもたらす効果的な免疫応答の後、TCMが維持され、同じエージェントによって最終的に二次感染に対する保護を提供します。このシナリオに注目すべき例外は、Mです。結核 infe患者が治癒、抗マイコバクテリア療法を受けている人間のction再感染17,18に感受性です。さらに、慢性感染の間に免疫記憶を支配するイベントは、抗原刺激が持続する特徴、ウェル19を理解されていません。例えば、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、結核のように慢性感染症、間に、かなりのTCM応答が良好な転帰（結核とHIVとの不顕性疾患を有する例えば 、待ち時間）20,21と関連しています。マウスとヒトとのいくつかの研究は、長期培養し、IFN-γELISPOTアッセイは、TCM応答16,20-22を測定することを実証しました。このアッセイでは、PBMCをエフェクター応答がピークと衰退することを可能にする、10〜14日間の抗原の濃度を減少させることで培養されます。差別と文化の中で展開してTCMを容易にします。

長期培養したIFN-γELISPOTアッセイはまた、獣医学において使用されています研究、まだ応答細胞の表現型が原因で、重要な試薬の不足、CCR7に特に抗体に評価することは困難でした。効果的な牛結核ワクチン[ 例えば 。 Mの単回投与を使用して、 ボビスカルメット·ゲラン桿菌（BCG）、BCGは、保護（ すなわち 、より低いマイコバクテリア負担と相関ワクチン接種後の長期培養し、IFN-γELISPOT応答を誘発ボビス ΔRD1]。ウイルスベクター化抗原85Aサブユニットワクチン、または弱毒化したMが続き、減少病原性M.とその後のチャレンジに対するTB-関連する病状） ボビス 23,24。また、長期的なPBMC培養物内の抗原特異的IFN-γ分泌細胞の数は12ヶ月で高くなっているが、保護、検出ポストMの程度と相関し、新生児ふくらはぎのBCGワクチン接種後24ヶ月で減少しますボビスチャレンジ 25。このシナリオでは、培養されたIFN-γELISPOTであります高コストの有効性試験のためのワクチン候補の優先順位を決定するための手段を提供し、ワクチンの有効性を予測するためのn個の重要なツール。さらに、培養ELISPOT技術は、異なる研究分野における様々な目的のために、抗原または抗体を改変することによって様々な宿主、病原体およびサイトカインに適合させることができます。

プロトコル

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1.次の解決策を準備

  1. 濃度10％（体積/体積）、グルタミン（2μM）、ピルビン酸ナトリウム（1μM）、非必須アミノ酸（0.1μM）、ペニシリンにウシ胎児血清（FBS）を添加することにより、完全なRPMI（cRMPI）を準備RPMI 1640に-streptomycin（100単位/ mlのペニシリンおよび0.1 mg / mlのストレプトマイシン）及び2-メルカプトエタノール（50 mm）です。
  2. 蒸留水に、クエン酸ナトリウム（77μM）、クエン酸（38μM）、およびデキストロース（122μM）を混合することにより、2×クエン酸デキストロースを準備します。
  3. 準備のCa 2+ Mg 2+を含まないリン酸緩衝生理食塩水（PBS）pHが7.2：塩化ナトリウム（137ミリモル）、塩化カリウム（2.7ミリモル）、のNa 2 HPO 4（二塩基、10 mM）の、KH 2 PO 4（一塩基、2 mM）の蒸留水に。 pHを7.2に調整します。
  4. PBS（体積/重量、PBSの1グラム/ 100mL）にウシ血清アルブミンを添加することによって、PBS 1％（PBS、1％BSA）を準備します。
  5. PBS + 0.05％トゥイーン20を準備しますPBS（容量/容量、ツイーン500μlのPBSの20/1 L）中に0.05％のトゥイーン20を添加することにより（PBST）。
  6. 蒸留水にトリス（100 mM）の、塩酸（0.50 mm）を混合することにより、100 mMトリス塩酸pH8.2の緩衝液を準備します。
  7. （35エチルアルコール/ mlの蒸留水100ml、容積/容積）の蒸留水にエチルアルコール（純度≥99.5％）を希釈して35％のエタノール溶液を調製します。
  8. フィルターはのcRPMI、2×クエン酸デキストロース、PBS、0.22μmのフィルターを用いてPBS、1％BSAを滅菌します。

2.長期培養細胞（14日·プロトコル）

（初日）

  1. cRPMI中で最終濃度の2倍で抗原溶液を調製します。抗原の選択は重要であり、研究の目的に合わせて調整する必要があります。
  2. 組換えM.を希釈（各抗原の、最終濃度を1μg/ mlである） 結核は、2 / mlのにTB10.4抗原Ag85Aを抗原。
  3. 希薄M.ボビス精製タンパク質誘導体10μg/ mlのへ（PPD-B、Prionics Ag）から（最終濃度は5μg/ mlのです）。
  4. を2μg/ mlまで（1μg/ mlの最終濃度）：組換え早期分泌抗原標的-6（ESAT-6）および培養濾液タンパク質10（CFP-10）融合タンパク質（CFP10 rESAT-6）で希釈します。
    注：これらの抗原は、結核性マイコバクテリアの免疫IFN-γ誘導性抗原であり、M.からPBMCを刺激することが含まれていてもよいですボビスは、動物を感染させました。 BCGまたはM.これらの株で削除され（すなわち、RD1）これらの抗原をコードする領域として、CFP10： ボビス ΔRD1は、動物がrESAT-6に応答しないワクチン接種しました。 rESAT-6：これらの研究で使用したCFP10博士C.ミニオン、アイオワ州立大学からの親切な贈り物でした。 TB10.4および抗原Ag85Aは、病原性およびワクチンM.に存在する免疫優性抗原でありますボビスは 37株。 PPDBは、精製タンパク質誘導体などの非結核性マイコバクテリアと共有する抗原を含む、いくつかの抗原の複合体です。 Infecワクチン接種した動物はrESAT-6に応答してはならないが、：CFP10 11（CFP10とPPDb：TB10.4、銀85A、rESAT-6すなわち）テッド動物は、潜在的に全ての抗原に応答します。
  5. 24ウェルプレート内の各動物の四連で抗原溶液のプレートを500μl/ウェル。このプロトコルでは、プールなどの抗原を使用します。このように全てのウェルは、全ての抗原と、このステップ（例えば、nullまたはマイトジェンなど）なしのコントロールが含まれています。 39℃/ 5％CO 2でプレートをインキュベートします。牛の通常の温度は39℃です。このように、いくつかの研究者は、ウシ細胞の培養のために39℃を使用しています。また、ヒトの細胞である場合に、39℃での細胞培養は、追加の利点26,30を提供します。
  6. 2 X酸 - クエン酸 - ブドウ糖の6ミリリットルで16または18 G注射針と結合されたプリロードシリンジ。と頚静脈穿刺によりウシの血液60ミリリットルを収集します。
  7. 末梢血バフィーコート分画の標準的な密度勾配遠心分離によりPBMCを単離しMaue らによって記載されるように4×10 6細胞/ mlに細胞濃度を調整する27
  8. 抗原に細胞を（500μL/ウェル）を追加し、各動物（ステップ2.5）のために四重に、24ウェルプレートをプリロード。 39℃/ 5％CO 2でプレートをインキュベートします。

（日3および7）

  1. 無菌技術を使用して、慎重に細胞層を乱すことなく、各ウェルからの上清500μlのを削除します。
  2. IL-2を含むcRPMI中の500μL/ウェル添加することにより、ウェル容量を補充（30 U /μlの、 すなわち 、15 U /ウェルを、組換えヒトIL-2シグマI7908）。 39℃/ 5％CO 2でプレートをインキュベートします。

（日10および12）

  1. 無菌技術を用いて、各ウェルからの上清750μlのを削除します。 （IL-2を含まない）のcRPMIの750μL/ウェルで容量を補充します。 39℃/ 5％CO 2でプレートをインキュベートします。
3。 ELISPOTアッセイ（3日間プロトコル）

（デイ1（長期培養プロトコールの12日目 ））

  1. APCにすることなく、長期的な細胞に加えて、抗原提示細胞（APC）、長期的な細胞およびex vivo /短期細胞（ 図1）：細胞をプレーティングする際のミスを避けるために、サンプルの各セットのために適切にELISPOTプレートにラベルを付けます。各処置（すなわち、抗原刺激）のために複製することは、少なくとも二重に行われる必要があります。
  2. PBS中のマウス抗ウシIFN-γ抗体（MCA2112、クローンCC330）（/ mlの8μgの）を希釈することにより、捕捉抗体溶液を調製します。
  3. マルチチャンネルピペッター用いて、1分間/ウェルの35％エタノールを15μlのELISPOTプレートのウェルを事前に濡らします。膜の損傷を防止するために、アッセイ中の任意の時点でのピペットチップでウェルの底に触れないでください。
  4. ウォッシュプレート300μlのPBS /ウェルで6回。洗浄液は、プレート反転によって破棄されるべきです。洗浄は、プレートウェルを乾燥させることではない、迅速に行う必要があります。
  5. キャプチャ（上記のステップ1からの）抗IFN-γ抗体のピペット100μl/ウェル。 4°CO / N（ジッパー付き収納袋内部のプレートを保持）でインキュベートします。

（二日目（長期培養プロトコールの13日目 ））

  1. 最終濃度の2倍で抗原溶液を調製します。治療は、次のとおりです。刺激なし（cRPMI中）、PPD-B（20μgの/ mlであり、最終濃度10μg/ ml）、TB10.4のタンパク質カクテルとAg85A（各タンパク質を2μg/ mlの最終濃度：1μgの/各タンパク質のミリリットル）、rESAT-6：10：このようなアメリカヤマゴボウ（20μgの/ mlの最終濃度のように1μg/ ml）を、陽性対照：M.ボビス感染の2μg/ mlの最終濃度のためにCFP10（ / mlの）。他のマイトジェンではなく、PWM（ 例えば、コンカナバリンA）を用いてもよいです。
    注：このステップのための抗原は、4つの異なる治療法を構成し、nはOTは（ステップ2.5のように）プールとして使用します。 4つの処理は、次のとおりです。NS、PPDb、タンパク質カクテル（TB10.4とAg85A一つの処理を構成する）とPWM。

4.短期細胞培養および接着細胞（APCに）単離

  1. （下：長期培養、14日プロトコル）1日目に採血し、同じ動物から60ミリリットルの血液を採取し、前と同様にしたPBMCを分離します。
  2. 2×10 6細胞/ mlに細胞濃度を調整します。細胞をプレーティング時にラベル管が明らかに不適切な配分を防止します。これらの細胞は、抗原提示細胞の分離とも短期細胞培養（ステップ6.5）に使用されます。動物番号と（：ex vivoで 、短期または新鮮な細胞、この場合の）文化のタイプの両方のLabelチューブ。
  3. プレート反転によってELISPOTから過剰な捕捉抗体を除去します。 300μlのPBSTでプレートを6回洗浄します。
  4. できるだけ多くのPBSTを削除します。長期細胞+ APCとしてラベルされたウェルに細胞懸濁液をピペットで50μL。ブロックその他のWELのcRPMIの200μL/ウェルでLS。 90で分または39℃ でインキュベートしますプリ暖かいのcRPMIまたは39℃ の （後続のステップのために必要）。付着細胞（APCに）単離のために使用されていない新鮮なPBMCをその後の工程で必要とされ、保存されるべきです。

5.培養細胞

  1. 90分のインキュベーション（ステップ4.4、短期培養および接着細胞の単離工程）、収穫の長期培養細胞中に。
  2. 細胞を剥離するには、上下の細胞と5または10μlのピペット、ピペットメディアを使用して、四重は、単一の15ミリリットルチューブに各動物から複製し組み合わせます。 400gで5分間チューブを遠心。
  3. 遠心分離後、チューブの反転により、上清を捨てます。細胞ペレットを取り除きます。必要に応じて静かに、ペレットを再懸濁、5mlのPBSを追加します。遠心分離を繰り返します。二回の洗浄工程を繰り返します。チューブ反転により上清を捨て、静かに1ミリリットルのcRPMIで再懸濁細胞。細胞濃度を調整します2×10 5細胞/ mlです。

6.メッキ新鮮で培養したPBMC

  1. 90分間のインキュベーション後、30秒間、プレートシェーカー上でプレートを振盪します。プレート反転することにより、非接着細胞を除去します。ピペットを150μl/ウォームのcRPMIのウェル（下のステップ4から：短期細胞および接着細胞（APCに）単離工程）。
  2. プレートを振ると、洗浄液を廃棄します。繰り返し洗浄を3回。 100μl/ウェルの適切なウェルに各抗原を追加（前標識されました）。
  3. 細胞をプレートに、長期の細胞+ APCとして標識されたウェルにピペットで100μl/ウェルの長期培養細胞懸濁液（2×10 5細胞/ ml）。この手順で追加した長期的な細胞は、APCのすでによくと同じ動物からのものであることを確認してください。異なる動物からAPCのと長期培養した細胞を混在させないでください。
  4. APCなしのウェルに長期培養細胞懸濁液をピペットで100μl/ウェル（2×10 5細胞/ ml）長期培養応答にAPCの要件の評価のための。
  5. ex vivoでの応答評価のために（新たに単離され、そして2×10 6細胞/ mlに調整した）短期細胞の100μl/ウェルを添加します。 39℃/ 5％CO 2インキュベーターでプレートO / Nをインキュベートします。プレートが平らにされていることを確認し、プレートを積み重ねないでください。
    注：細胞表現型の解析が望まれる場合、フローサイトメトリーは、補助的なアッセイとして行うことができます。 ELISPOTアッセイについて記載したように、細胞を（代わりにELISPOTプレートの）96ウェルU底プレートに播種されています。捕捉抗体の吸着は（3.5に3.4ステップ）はスキップされるべきです。次いで、細胞を39℃/ 5％CO2および実行標準的な細胞染色プロトコルでO / Nインキュベートします。細胞染色試薬は、試薬テーブルに含まれています。

デイ3（長期培養プロトコールの14日目 ）

  1. 検出抗体（マウス抗ウシIFN-γ、クローンCC3を希釈02）PBS、1％BSA中5μg/ mlです。さらに6回、一回のdH 2 O（300μL/ウェル）で、10秒間、毎回前に、間の洗浄シェーカー上に配置し、PBST（300μL/ウェル）で6回：井戸や洗濯板から流体を捨てますPBSでPBST（300μL/ウェル）、2回（300μL/ウェル）。細胞をプレートから除去した後、無バイオセーフティの問題が適用されない場合、手順は、生物学的安全キャビネットの外に行ってもよいです。
  2. 洗浄液を捨てます。ペーパータオル上でプレートをタップして、できるだけ多くの洗浄液を除去します。検出抗体（100μl/ウェル）を追加します。
  3. で120分または39℃ のためにプレートをインキュベートこのインキュベーション工程の間、製造業者の説明書に従って、アルカリホスファターゼ溶液を調製。使用前に三十分（すなわち、ウェルに検出抗体の添加後90分）PBST中の試薬を希釈。試薬を混合するために穏やかにチューブを反転し、室温でインキュベートしました。
  4. 12の後0分のインキュベーション、プレート反転により過剰検出抗体を捨てます。洗浄プレートをPBSTで6回（300μL/ウェル）。ペーパータオル上でプレートをタップして、できるだけ多くの洗浄液を除去します。
  5. （上記のステップ3から）のアルカリホスファターゼ溶液100μl/ウェルを追加します。 RTで45分間、プレートをインキュベートします。流体捨て、PBST（300μL/ウェル）で各プレートを6回洗浄します。
  6. メーカーの説明書（ベクトルブルーAP基質III）は、次の基質溶液を調製する：100 mMトリス塩酸pH8.2の緩衝液に試薬を希釈します。ピペット基質溶液50μl/ウェル。
  7. 青色が（約30分）の開発を開始するまで、室温でインキュベートします。のdH 2 Oを多量に流体および洗浄プレートを捨てます、膜を露出させるバックウェルの洗浄および空気乾燥に板を可能にするために、底板を外します。
  8. 実体顕微鏡を使用して、手動でイムノ画像解析またはELISPOTリーダー（表1）、または上のプレートをお読みください。あるいは、プレートを保ちます読書まで室温で暗所で。そのため反応基質の高い安定性、品質は数年間保持されます。
    注：細胞および抗原濃度は、数え切れないほどのスポット23,24,27,37でウェルを回避するために最適化されました。それは無数のスポット形成が生物学的変動に異なる設定または原因で発生する可能性があります。その場合は、細胞濃度が可読スポットカウンティング応答が得られるように最適化されるべきです。

7.プレートの読み取りとデータ解析

  1. セルラーテクノロジー株式会社（CTL）ELISPOTプレートリーダーガイド（表1）のとおり分析を行います。スポット数は、ウェルの各々に対して得られた後、重複の間の平均を計算します。各抗原性刺激に対する特異的免疫応答は、抗原刺激のウェルとは非刺激ウェル中のスポットの平均数を差し引くことにより算出されます。

結果

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Mと約1ヶ月後のエアロゾル感染ボビス （10 4コロニー形成単位）、感染した（n = 8）および対照動物からのPBMC（N = 8）13日間抗原およびIL-2の存在下で培養しました。 TCM反応の開発は、感染後のIFN-γELISPOTアッセイを用いて決定しました。代表TCM（APCの存在下または非存在下で）と感染動物（3匹の動物）と非感染動物（一匹）からex vivoでのIFN-γELISPOT応答は、図1に示されている。成功した長期的なIFN-γ IFN-γを産生する細胞でのELISPOTアッセイの結果刺激条件下および非感染動物からの応答がない近く、非刺激条件下（スポット形成細胞、SFC）。また、強​​力なT細胞応答は、PWMに応じて発生しました。 Mに特異的応答CFP10抗原刺激： ボビスは、PPD-BまたはrESAT-6によって評価しました。 図に示すようにPPD-BとrESAT-6の1、堅牢TCMおよびex vivoでの応答：CFP10は、3つすべてのMから検出されましたボビスは、動物に感染し。 TCMおよびex vivoで応答なしに最小限のは、コントロール動物から検出されました。また、APCの存在は、自己APCの非存在下で培養した長期細胞によって大幅に低減応答によって証明されるように、感染した動物によって最適なTCM応答に必要でした。 M.からのPBMCによるIFN-γ応答ボビス感染および非感染動物は、図2に示されている。各動物からのSFCの数はPPD-Bマイナス培地のみのそれぞれの応答に応じて重複サンプル中のSFCの平均数として算出しました。応答は、10 6個の細胞のために推定しました。応答は（ すなわち 、長期培養に対するエキソビボ培養）APCおよび培養期間の感染状態有無に基づいて（P <0.05）が異なっていました。

プレートの画像を取得します
1。 マシンの電源を入れます
2。 「免疫キャプチャ」バージョン6.3ソフトウェアを開きます。
3。 ステップ1：選択プレートタイプ。
4。 ステップ2：ロードプレート。
5。 ステップ3：スキャンオプションを選択します。
6。 ステップ4：スキャンを開始します。
7。 プレートの概要イメージを取得します。
8。 プレートを取り出します。
9。 「免疫キャプチャ」ソフトウェアを終了します。
スポット形成単位をカウント
1。 「免疫スポットキャプチャ」バージョン5.0ソフトウェアを開きます。
2。 OBJEC選択 Tタイプ：ノーマル。
3。 スマート数：カウンティングモジュールを選択します。
4。 ステップ1：ロードプレート。
5。 ステップ2：計数パラメータを定義します。異なるスポットを有するウェルのスポット認識の試験精度を。
6。 自動カウントを開始します。
品質管理
1。 オープン「イムノキャプチャー」バージョン5.0ソフトウェア。
2。 品質管理：カウンティングモジュールを選択します。
3。 ステップ1：ロードプレート。
4。 ステップ2：個別に強調表示されたウェルを分析します。
5。 品質管理を終了します。

表1 - AutoImmun Diagnostika ELISPOTリーダー画像取得および細胞カウント手順。

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ELISPOTアッセイγ長期培養IFN-から井戸の図1.画像が。培養IFN-γELISPOTアッセイは、病原性M.でチャレンジ後approximatelyone月実施しましたボビス （3匹）。非感染動物は、対照（一匹）として含めた長期細胞株は、組換えAg85A（を1μg/ ml）を、TB10.4（1μg/ ml）のカクテルでPBMCを刺激することによって生成された、rESAT-6： CFP10（1μg/ ml）およびPPD-B（5μg/ mlの）自己由来APCの存在下または非存在下でのELISPOTプレートに移し、続いて13日間培養しました。短期細胞は、13日目に単離され、ELISPOTプレートに直接メッキPBMCから成っていました。長期および短期の細胞はrESAT-6、PPD-B（10μg/ ml）で刺激した：CFP10（1 / mlの）、培地のみ、またはヤマゴボウマイトジェン（5＆＃956; G / ml）で24時間処理しました。

figure-results-2
MにELISPOT応答γ長期培養IFN-から図2.代表的な結果ボビス精製タンパク質誘導体（PPD-B）。培養IFN-γELISPOTアッセイは、病原性M.でのチャレンジ後approximatelyone月間行きましたボビス （8匹の動物）。非感染動物は、8匹の動物の長期細胞は、組換えAg85Aのカクテル（を1μg/ ml）を、TB10.4（を1μg/ ml）でPBMCを刺激することによって作製した（対照として含めたrESAT-6：CFP10（1 / mlの）とPPD-B（5μg/ mlの）自家APCの存在下または非存在下でELISPOTプレートに移し、続いて13日間培養した。短期細胞がPBMCから成って13日目に単離され、ELISPOTプレートに直接メッキ。長期と笙RT期細胞は単独で24時間PPD-B（10μg/ ml）または培地で刺激しました。各動物（SFC / 10 6細胞）からの特定の応答はPPD-B（重複サンプルの平均）マイナス培地単独に対する応答に対する応答として提示されています。

ディスカッション

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長期培養ELISPOTアッセイにおけるIFN-γ産生は、ヒトにおいて、一般的にTCMに起因するものであるが、どのようにこの応答は、培養に発症することは十分に理解されていません。かどうかTCMは、循環中に存在し、in vitroで拡大、またはTCMの応答が培養中にTCMへのエフェクターおよびTEM細胞の分化に起因する場合は知られていません。しかし、ヒト由来の試料を用いた研究は、ex vivoおよび長期培養IFN-γELISPOTアッセイからのCD4 + T細胞は、TCM応答は、エフェクター細胞28から発生しないことを意味する、無関係なエピトープ特異性を有することを見出しました。明らかに、応答の持続時間は異なるが、病原体のクリアランスが達成された場合、最終的には両方のex vivoおよびTCMの応答が低下します。また、初期の測定長期培養の応答と長い抗原プライミングした後（エフェクター応答が低い）相関することが示されている、抗後の早いTCM集団を循環し、長いことを示していますジェニックプライミングは、 生体内で関連のままである。一方、ex vivoでの応答の大きさは、記憶応答29の大きさに関係すると表示されません。これらの結果は、長期培養したIFN-γのELISPOT応答がTCM のインビトロ拡大し、試料中のエフェクター応答の関連衰退ではなく、TCM表現型へのエフェクター細胞の分化に起因することを示唆しています。

牛では、長期的IFN-γELISPOTアッセイにより検出された応答のエフェクターおよびメモリーサブセットの相対的な寄与は知られていません。最近の研究では、ワクチンとの相関関係が長期培養し、IFN-γELISPOT応答とMとその後の実験感染に対する保護を誘発示しますボビス 23-24。これはワクチン接種に対する弱い長期IFN-γのELISPOT応答が保護30の欠如に関連していることが報告されています。両方が住んでいると殺しますEDワクチンは、同様のex vivoでのIFN-γELISPOT応答を誘導するが、生BCGでのワクチン接種は、ワクチン製剤を殺したんよりも強い、長期培養し、IFN-γELISPOT応答を誘発します。殺された製剤は、病原性結核性マイコバクテリア31-32、33で攻撃に対する保護を提供するために失敗しながら興味深いことに、生ワクチンは、保護されています。

TCM応答の評価は、PBMCから、これらの細胞を選別することによっても実現可能です。 PBMCからのTCMの直接濃縮は、しかしながら、非常に個人的な訓練を受けた高価な装置を必要とし、これらの細胞は、血流中の多数ないので困難です。 PBMCの長期培養は、高価な装置なしTEM及びエフェクター細胞上のTCMの濃縮を提供します。これらのT細胞集団をインビトロで増殖されているのでしかし、それらは、 インビボ記憶応答の少ない表すことができます。これは、長期培養またはTCMの並べ替えを使用して（IFN-γメモリ応答をアクセスすることが可能ですサイトカインのELISA 34、サイトカインビーズアレイ（CBA）、細胞内染色（ICS）、またはサイトカインタンパク質アレイ（CPA）のようなELISPOTアッセイによって以外の戦略）る。これらの方法は、しかし、一般的にELISPOTは35をアッセイよりも感度が低いです。

ELISPOTの利点はすぐに他の細胞による酵素的切断またはサイトカイン取り込みによる上清および分解の希釈を防ぐ、そのリリース後のサイトカインの直接の取り込みを検出する能力です。 ELISPOTアッセイは、ノイズのシナリオ（ すなわち、低特異的応答）35にあっても低信号に正確な結果を提供するサイトカインを産生する単一細胞を検出します。また、ICSで、リリース前にサイトカインの検出は、サイトカインを産生する細胞の偽の身分証明書をもたらすことができる（ 例えば 、原因分泌プロセスの前または間に、翻訳後調節に）34。サイトカイン分泌を最小にするためにICSアッセイで用いられる輸送阻害剤（タンパク質を停止ゴルジとして知られている）抗原刺激中に最終的にサイトカイン産生35に影響を与えるこれらのタンパク質の細胞毒性による細胞刺激の持続時間を制限します。

そうは言って- （ すなわち 、ICSに）CBA、CPAおよびICSおよび/ ​​または細胞表面マーカーの発現を決定するために、同時に複数のサイトカインを測定するために有用な技術です。したがって、これらの方法は、IFN-γELISPOTアッセイ36と組み合わせて使用することができます。 ELISPOTアッセイを介してTCM応答を測定し、前のウシ結核ワクチンの有効性の研究が、他の技術によって、TCM応答の検出は、おそらく同等の結果が得られます。重要なことは、ELISPOTアッセイは、CBA、CPAおよびICS分析技術34よりも実行するために、安価で簡単です。 SFCの手動カウントが自動化された計数の代替であり、ELISPOTプレートは、スポットCの前または後に、最低限の品質損失で長時間室温で保存することができます37 ounting。

結核ワクチン応答を評価する際に、長期培養し、IFN-γELISPOT応答は、人間が記憶応答を評価するために適用され、牛された14-16,31-32,33。 TCMの応答はまたのような牛のいくつかの他の感染物質に宿主応答において重要な役割を果たしているものとする： マイコプラズマミコイデスサブスピーシーズミコイデス 42、 アナプラズマmarginale 38およびウシ呼吸器合胞体ウイルス39。潜在的には、長期的なELISPOTアッセイは、他の動物種、サイトカインおよび感染症のために適合されることがあります。これらのより広範なアプリケーションでは、特定の試薬の現在の限られた在庫状況により、獣医学、免疫学の用途に特に有用であろう。

TCMの応答は、いくつかの感染に対する保護のために重要であるが、MA（疾患の転帰の予測またはワクチンの有効性のために）感染/免疫後早期にそれらを測定しますyが煩雑になります。 エキソビボ短抗原刺激条件下で免疫応答の分析は、多くの場合、特に、免疫学的記憶形成の開始時に、原因メモリとエフェクター応答の重なりに、エフェクター応答を表します。抗原負荷が継続的である慢性疾患の文脈においては、ex vivoでの応答は、エフェクター細胞応答または記憶およびエフェクター細胞応答の組み合わせを評価します。長期培養したIFN-γELISPOTアッセイは、おそらくTCM応答ではなく、エフェクターT細胞または結合CD4 + T細胞応答を測定することができる、ここで説明します。要約すると、長期培養したIFN-γELISPOTアッセイは、T細胞記憶応答を推定するための貴重なアプローチを提供し、感染剤の様々ないくつかの種の記憶応答を評価するために首尾よく使用されている12-16、20-25,29 、31,33,34,38,39。

開示事項

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著者は、彼らが競合する金融利害関係がないことを宣言します。

謝辞

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3625-32000-104農業·食品産業技術総合研究イニシアティブ競争助成なし：研究は、米国農務省、ARSクリスによってサポートされていました。食糧農業のUSDA国立研究所から2011-67015-30736。私たちは、その優れた技術的な支援だけでなく、レベッカマディソン、ダグ·ユーイング、ケイティPille、ジェイ·シュテフェン、デビッド·ルベルスのためのジェシカ·ポロック、エマFrimmlモルガン、シェリージマーマン、クリスティンベース、ブルース·ペッシュ、モリースタフネ、アレン·ジェンセン、およびトレイシー·ポーターに感謝します動物の優れたケアと取り扱いのため、ロビンZeisness、ダビデPanthen。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
クエン酸ナトリウム(二水和物)各種
エン酸(一水和物)各種
デキストロース各種
ELISPOT PVDFプレート各種
ベクタステインABC–APキット スタンダードベクターラボラトリAK-5000
ベクターブルーアルカリホスファターゼ 基質キットベクターラボラトリーズSK-5300
Ag85AライオネックスLRP-0004.323, 24, 25, 37
TB 10.4ライオネックスLRP-0061.623, 24, 25, 37
PPDbPrionics AG7600055
rESAT-6:CFP10Kind gift Dr.Minion, Iastate23, 24, 25, 27,  37
マウス抗ウシIFN-&γ;クローンCC302SerotecMCA1783B23, 24, 25, 27,  37
マウス抗ウシIFN-&γ;ビオチン化クローンCC330セロテックMCA211223, 24, 25, 27,  37
マウス抗ウシ CD4クローン CC8セロテックMCA1653GA
マウス抗ウシ CD45RO クローン IL116AセロテックMCA2434GA
ラット 抗ヒト CCR7 クローン 3D12アブカムab95665
マウス抗ウシ IFN-&γ;-PE クローン CC302セロテックMCA1783PE
ヤギ抗マウスIgG2a- Alexa Fluor 350InvitrogenA-21130
ヤギ抗マウスIgG3 APC-CY7SouthernBiotechnology1080-193
ヤギ抗ラットIgG-APCInvitrogenA10540
BD Cytofix/Cytoperm™BDバイオサイエンス554714
ブレフェルディンAシグマ-アルドリッチB7651
マゴボウマイトジェンシグマアルドリッチL8777ヒト
インターロイキン2シグマ-アルドリッチI7908
クーズ ヤ

参考文献

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