人工細胞外マトリックス（AECM）タンパク質からの設計と構築エシェリヒア·コリ皮膚組織工学のための

サマリー

組換え技術により、材料設計者は組織工学アプリケーション向けにカスタマイズされた機能を持つ新しい人工タンパク質を作成することができました。例えば、人工細胞外マトリックスタンパク質は、天然ECMに由来する構造的および生物学的ドメインを組み込むように設計することができます。ここでは、エラスチン様リピートを含むaECMタンパク質の構築と精製について説明します。

要約

組換え技術は、調整可能な特性を持つ新しい人工タンパク質を作成するための多用途のプラットフォームです。過去10年間で、自然界に由来する機能ドメインを組み込んだ(またはde novoに作成された)多くの人工タンパク質が報告されています。特に、人工細胞外マトリックス(aECM)タンパク質が開発されています。これらのaECMタンパク質は、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲンから採取された生物学的ドメインで構成され、エラスチン様リピート、シルク、コラーゲンリピートなどの構造ドメインと組み合わされています。今日まで、aECMタンパク質は、組織工学や創傷修復への応用について広く研究されてきました。最近、Tjin氏らは、ヒトの皮膚ケラチノサイトの接着と増殖を促進するために設計されたインテグリン特異的なaECMタンパク質を開発しました。彼らの研究では、aECMタンパク質は、フィブロネクチン、ラミニン-5、コラーゲンIVから採取した細胞結合ドメインと、隣接するエラスチン様リピートを組み込んでいます。彼らは、彼らの研究で開発されたaECMタンパク質が人工皮膚の基質として使用するための有望な候補であることを示しました。ここでは、このようなaECMタンパク質の設計と構築、およびエラスチンの熱応答性を利用した精製プロセスについて概説します。

概要

数十年にわたり、合成材料と天然材料の両方が組織工学の足場として利用されてきました^1,2。ポリマーなどの合成材料は、優れた構造的完全性と調整可能な機械的特性を提供しますが、組織の成長と浸潤を促進するには不十分な生理活性を持つことがよくあります。一方、細胞外マトリックス(ECM)タンパク質などの天然素材は、優れた生物活性を持っていますが、バッチ間のばらつき、急速な分解、免疫原性の問題などの制限があります。そのため、組換えタンパク質は、天然タンパク質^3,4の望ましい特性のみを模倣するように設計できるため、望まれている。

組換えタンパク質工学は、新規人工タンパク質バイオポリマーの設計と製造のための多用途のプラットフォームとして、幅広い関心を集めています。遺伝子配列を制御することにより、人工タンパク質の機能をさまざまな用途に合わせて調整することができます^5,6。特に、人工細胞外マトリックス(aECM)タンパク質は、組織工学、再生、創傷修復のアプリケーション向けに複数の機能を持つように調整することができます^2,7。さらに重要なことは、クローニングおよび精製技術の進歩により、スケーラビリティが向上し、組換えタンパク質の製造コストが大幅に削減されたことです。低コストで大量の組換えタンパク質を生産することが可能であり、これは臨床での使用にとって経済的^{である5。}

人工細胞外マトリックスタンパク質は、組織工学の応用^8-11のために開発されました。例えば、Tirrellらは、フィブロネクチンCS5配列とエラスチン様リピート(ELP-CS5)を含む人工タンパク質を用いて、小径の血管移植片を設計しました。彼らは、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)がこれらの材料に付着して成長できることを示しました¹²。また、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、フィブリノーゲン、ビトロネクチンから採取した短い生理活性配列や、エラスチン、クモの糸、コラーゲンを模倣した構造ドメインを組み込んで、さまざまな融合タンパク質を作製しているものもあります¹⁰。エラスチンベースのaECMタンパク質から作られたバルク架橋フィルムも、天然エラスチンと同様の機械的特性を示しました(弾性率は0.3〜0.6 MPaの範囲)¹³。その後、より長いフィブロネクチン断片を含むaECMタンパク質も、インテグリン結合親和性の増加によりin vitroで創傷治癒を促進すると報告されました⁸。

最近、インテグリン特異的な人工ECMタンパク質がTjinと共同研究者^{によって開発されました14}。各aECMタンパク質には、ラミニン-5、コラーゲン-IV、フィブロネクチンなど、ヒトの天然皮膚^2,7,15のECM成分から採取された生理活性細胞結合ドメインが含まれています。例えば、インテグリンα_3β1は、ラミニン-5α-3鎖球状ドメイン3(LG3)^16,17に見出されるPPFLMLLKGSTR配列に結合することが示されている。彼らの報告では、初代ヒト皮膚表皮ケラチノサイトは、存在する細胞結合ドメインの種類に応じて、各aECMタンパク質への結合に異なるインテグリンを優先的に関与させることを示しました。

Tjinらの研究で議論されているaECMタンパク質は、人間の皮膚の機械的特性を模倣する弾性を付与するエラスチン様ドメイン{(VPGIG)₂VPGKG(VPGIG₎₂}₈を隣接して含んでいます。さらに、エラスチン様リピート内にリジン残基が取り込まれると、水性溶媒への全体的なタンパク質溶解度も増加します。さらに、リジン残基は、架橋されたaECM膜の形成を促進するための架橋部位としても機能する¹²。aECMタンパク質配列内にエラスチン様リピートを含めることで、逆遷移サイクリング(ITC)¹⁴によりタンパク質を容易に精製することができます。エラスチンは、下臨界溶液温度(LCST)または逆転移温度(T_t)^18-20として知られる特定の温度で急激で可逆的な相転移を受けます。エラスチンとエラスチン様リピートは、LCSTより下では親水性のランダムコイル構造を採用して水溶性になりますが、LCSTより上では、エラスチンは急速に凝集してミクロンサイズの粒子になります。このような相転移は可逆的であり、したがって、エラスチンベースのaECMタンパク質をITC技術²¹を介して容易に精製できるようにするために利用することができる。

この研究では、エラスチン様リピートに融合した生理活性細胞結合ドメインを含む人工ECMタンパク質を設計、構築、精製するための一般的な手順を報告します。aECMタンパク質のアミノ酸配列をコードするプラスミドを設計し、クローニングするプロセスについて説明します。ITCを使用してaECMタンパク質を精製するための手順を概説します。最後に、SDS-PAGE電気泳動とウェスタンブロッティングを使用して得られたaECMタンパク質の純度を決定する方法について説明します。

プロトコル

AECMタンパク質のための組み換えプラスミドエンコーディングの1クローニング

1. 機能的ドメイン（ 例えば 、細胞結合ドメインとエラスチン様反復）のアミノ酸配列を設計します。機能的ドメインの末端に隣接するデザインの制限部位は、サブクローン化ソフトウェア命令に従ってフリーソフトウェアを使用して（ 例えば 、http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/）を容易にします。ここでは、意図したサイトへの消化を閉じ込める機能ドメインに存在しないユニークな制限部位を選択します。サブクローン化のための宿主ベクター（ 例えば 、たpET22b（+））のマルチクローニングサイト（MCS）に表示される制限部位を選択してください。
2. ソフトウェア命令に応じて自由にウェブサイトを使用してヌクレオチド配列にアミノ酸配列を逆翻訳します。 （ 例えば 、http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html）。確認コドンは、Eのために最適化されています大腸菌ホスト。
3. 目的の遺伝子はパーチャスすることができますED商業として一本鎖オリゴヌクレオチドは、DNAとアニールを行う（オリゴヌクレオチド<100塩基対（bp）の場合、すなわち、）（ステップ1.4参照）、コストを低減することができます。それ以外の場合は、100塩基対よりも大きい遺伝子について、それらは商業会社を通じて購入することができました。
4. オリゴヌクレオチドのDNAアニーリング
   1. 所望の遺伝子配列を得るために、DNAオリゴマーをアニール。を1μg/μlの最終濃度まで（濾過2-アミノ-2-（ヒドロキシメチル） - プロパン-1,3-ジオール、pH8.0の、10mMトリス）DNAオリゴマーバッファにおけるDNAオリゴヌクレオチドを​​溶解します。
   2. 合計40μlの混合物を達成するために、DNAのアニーリングバッファー（10mMトリス、100mMのNaClおよび100nMのMgCl _2）の32μlに各オリゴマーの4μlを添加します。
   3. ホットプレートを用いて水の入ったビーカーを沸騰させると5分、95°Cのための混合物を浸します。ビーカーを外し、徐々に発泡スチロールの箱O / Nに設定全体を冷却します。オリゴマーは、アニールし、消化のために準備ができているされています。
5. アニーリングしたオリゴマー（ すなわち 、インサートと呼ばれる）と宿主ベクター別々に（ すなわちたpET22b（+））を消化するために対応する制限酵素を加えます。 37℃で3〜4時間以下のレシピ（DNAの1〜2μgの、それぞれの制限酵素2μlの、合計50μlの混合物に10倍制限酵素バッファー、水までの5μl）を使用してください。
   注：たpET22b（+）プラスミドベクターは、アンピシリン抗生物質耐性であり、C末端に6×Hisタグが含まれています。 6X-HisタグされたpET22b（+）に存在は、私たちは、ステップ7でウェスタンブロッティングを介して標的タンパク質を同定するためにHisタグ抗体を使用することができます。
6. 各消化混合物に6×ローディング色素を追加します。 100 Vで1時間紫外線蛍光DNA染色を含むDNAのアガロースゲルはUV光照明で1.2％のDNAのアガロースゲルを視覚化し、1.2％に個別にDNAラダーを含む消化混合物を実行します。
7. 商業ゲル精製キットを用いて消化DNA産物を抽出するために、ゲルをスライス。 ELUT電子50-100 ng /μLでの最小DNA濃度を達成するために、列の最小ボリュームを使用。
8. 、ベクトルの（2μL、T4リガーゼ1μlの：消化されたDNAは、以下のレシピを使用して、T4リガーゼを用いてプラスミドベクター（ すなわち、エラスチン反復またはDNAアニールにより得られた細胞結合ドメイン）を挿入連結することにより、目的の順次の遺伝子を組み合わせてT4ライゲーションバッファー1.5μlの、Xμlのインサートの、10.5-Xμlの合計15μlの混合物のための水）。室温で2時間ライゲーション混合物をインキュベートします。
   注：挿入するベクターのモル濃度は、ライゲーション効率を最適化するために変化されるべきです。レシピのxと記載インサートの体積は、ステップ1.7から溶出したDNA濃度に依存します。
9. 雪解けE.氷の上で大腸菌 DH5α化学的コンピテント細胞（または任意のクローニング株）。ウォームする2×YT寒天プレートアンピシリン（25μg/ ml）を含有する（ 表1）37℃です。
10. 使用して細胞を形質転換ヒートショック：
    1. きれいな、予備冷却マイクロ遠心チューブに小分けしたコンピテント細胞を50μl。細胞内へのライゲーション混合物（100 ngの100 pgの間）ピペットを5μl、優しく上下にピペッティング混合します。氷上で20分間、混合物を残します。
    2. 2分間42℃の水浴中で細胞混合物を含むマイクロ遠心管を浸し、2分間氷上に戻しました。細胞への熱損傷を最小にするために、浸漬時間を時間。
    3. マイクロ遠心管にSOC培地（ 表1）の500μl加え、1時間37℃で振盪しながらインキュベートします。
    4. 室温に予め温めてきたの2×YT寒天プレート上に細胞/ライゲーション混合物の50〜500μLを広げ、アンピシリン（25μg/ ml）を含有し、37°のCO / N（12〜16時間）でプレート逆さまをインキュベート。
11. 次の日、きれいなピペットチップを使用して、寒天プレートからDNAのコロニーを選択します。 2YT培地（ 表 5 mlにコロニーを育てます1）（225 rpm）し振とうしながら37°CO / N（12〜16時間）で、アンピシリン（25 / mlの）O / Nを含みます。
12. 翌日、製造業者のプロトコルに従って選んだ各コロニーのためのDNAプラスミドを抽出するために、プラスミド単離キットを使用しています。水50μlのDNAを溶出します。
13. （5μlのDNA、各制限酵素の0.2μlを、1μlの10×制限酵素バッファーとトップアップ合計10μlの混合物のための水）、37℃で2時間インキュベート：以下のレシピを使用して、制限酵素で消化試験を行いますそうインサートを含有し、ステップ1.6のように1.2％のDNAのアガロースゲルで泳動したコロニーをスクリーニングするため。
    注：消化すると、それぞれの分子量（ 図1）に対応する1つ各ベクトルと挿入するための2つのバンドで成功したライゲーションすべき結果、。
14. フォワードT7プロモーターを使用して、DNA配列決定のための可能性のコロニーを送ると商業シーケンサにリバースプライマー。

2。細菌発現宿主への組換えプラスミドの形質転換

1. 配列決定の結果から、正常にライゲートされたコロニーを選択し、Eへの形質転換のためのDNAプラスミドを使用大腸菌発現宿主。
2. 雪解けE.氷の上で大腸菌発現株（BL21（DE3）pLysSを）。一方、RTにアンピシリン（25μg/ ml）およびクロラムフェニコール（34μgの/ ml）を含む暖かい寒天プレート。
   注：細菌中に存在するpLysSをプラスミドはBL21（DE3）pLysSをクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む株。 pLysSをプラスミドは、構成AECMタンパク質の漏出性発現を制限するために表現されたT7プレッサー遺伝子が含まれています。クロラムフェニコールは、培養中pLysSをが含まれている細菌細胞を選択することが必要です。
3. Eを形質転換し得るために、繰り返し手順1.10人工タンパク質を発現させるために準備ができている大腸菌細胞 。パラフィルムで寒天プレートをラップし、4で上下逆さまに保存 6; 1ヶ月までのためのC。

AECMタンパク質の3細菌発現

1. 図2をピペットチップで形質転換した寒天プレートからコロニーを選択し、試験管にアンピシリンおよびクロラムフェニコール抗生物質の両方を含有する滅菌テリフィックブロス（TB）培地（ 表1）の10ミリリットルに接種するために参照してください。 225rpmで振盪しながら37°CO / N（12〜16時間）で、このスターター培養をインキュベートします。
2. 転送3 L三角フラスコ内の同じ抗生物質を補充した1 L新鮮な滅菌TB培地にスターター培養の10ミリリットル。 2-3時間、225rpmで振とうしながら37℃で培養をインキュベートし、培養物の光学密度を観察（OD _600）読書のための空のキュベットに1mlの培養物をピペットで0.6〜0.8に達しました。 SDS-PAGEの特徴付けのための誘導の前に1mlの培養物を保存します。
   1. 細胞培養物のOD _600を測定するために、キュベット内のTB培地の1バイアルを準備ブランク測定用。これとは別に、新しい空のキュベットに培養フラスコからの1mlの培養物を移します。 600 nmでの吸光度でブランク対照に対して分光光度計を用いて培養物の光学密度を測定します。
   2. 1.5 mlのマイクロチューブに培養サンプルの1ミリリットルを転送することによって（その後のSDS-PAGE分析のために）サンプルを保存して2分間12,000×gで遠心分離し、上清をデカント。
3. 1mMの最終濃度までイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）を用いて培養物を誘導し、さらに4時間、225rpmで振盪しながら37℃でインキュベートします。 SDS-PAGEの特徴付けのために4時間で、誘導の最後に1mlの培養物を保存します。
4. 4℃で30分間12,000×gで1 Lの遠心ボトル及び遠心分離機に培養を転送することによって細胞を回収。上清を捨て、0.5グラム/ mlでTEN緩衝液（1Mトリス、0.01MのEDTA、0.1 MのNaCl、pH値= 8.0）で細胞ペレットを再懸濁の重量を量ります。

細菌培養の4溶解

1. -80°CO / Nで再懸濁細胞培養をフリーズします。細胞を溶解し、室温でまたは氷上で水浴中で凍結した細胞培養物を解凍します。解凍しながら10 / mlのデオキシリボヌクレアーゼI（DNアーゼI）、10 / mlのリボヌクレアーゼA（RNアーゼI）、および50μg/ mlのフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）を追加し、ゆっくり攪拌しながら溶液を均質化します。
2. すべての再懸濁した細胞を解凍した後、水¹²中のタンパク質の溶解度を増加させるためにpHを9.0に溶液を調整します。 6 N NaOHを均質な一貫性を達成するために氷上で撹拌しながら滴下して加えます。直径2mmの平坦な先端、5秒のパルスを用いて、氷上で20分間、超音波破砕によって溶解します。
3. 4℃で30分間、12,000×gで細胞溶液を遠心。後の精製のために4℃で清潔、空き瓶や店舗に上清を移します。
4. 一方、-80℃で10バッファおよび再凍結で再び細胞ペレットを再懸濁します。へ完全な細胞溶解、3回まで繰り返し凍結/解凍し、超音波処理プロセス。 SDS-PAGEの特徴付けのための20μlの細胞溶解物を保存します。

逆転移サイクリングを使用AECMタンパク質の5精製

1. ステップ4.3からの細胞溶解物を照合し、エラスチンベース²¹タンパク質の精製に使用されるものと同様のITCを用いAECMタンパク質を精製するために進みます。サイクルは、それぞれ、4°C（「コールド」と呼ばれる）、37℃（「温かい」と呼ばれる）のサイクルであり、異なる温度で行われます。
2. 4℃で2時間、40,000×gで50mlの遠心分離ボトル、遠心に細胞溶解液を分割します。細胞ペレットの外観は暗褐色であることと鼻水になります。
3. ペレットからの明確な分離を得るために、ピペットで上清を取り除きます。きれいな遠心ボトルに上清を収集し、（3 Mの最大値に）1 Mの最終濃度までのNaClを追加します。暖かいです225rpmで振盪しながら2時間37℃を解決。
   注：塩化ナトリウムの添加はAECM引き起こす凝集のエラスチン成分の推移をトリガーします。上清を濁っになります。タンパク質濃度が十分に高い場合、白色泡状タンパク質は、遠心分離ボトルの側面に見られます。
4. 37℃で2時間、40,000×gでステップ5.3から上清を遠心します。上清を除去。金属へらを使用して、ペレットを粉砕し、磁気攪拌棒と板を用いて、4℃で激しく撹拌しながらのO / Nで氷のように冷たいオートクレーブした蒸留水（50 mg / mlの）でペレットを再懸濁ビット。ペレットが完全に溶解する必要があります。
5. 繰り返しは、タンパク質の高い純度を得るために、他の3倍から5倍のために5.2〜5.4を繰り返します。
6. 精製の最終サイクルの後、4℃の蒸留水に対して、それを透析することによってタンパク質溶液を脱塩。水のすべての4の変化で2〜3日間水に対してタンパク質溶液を透析します時間またはO / Nのための8時間。 SDS-PAGEのために精製したタンパク質の20μLを保存し、さらに使用するまで-80℃で精製したタンパク質や店舗の残りの部分を凍結乾燥。

SDS-PAGE電気泳動を用いてAECMタンパク質の6キャラクタリゼーション

1. （分子量が大きい場合には、より良好な分離のために、8％SDS-PAGEゲルを使用）を12％SDS-PAGEゲルを調製します。 AECMタンパク質の分子量に対応するタンパク質ラダーの中間に到達するまで、各サンプルに2×SDSローディング緩衝液を加え、100℃で10分間、試料を加熱し、100 Vまたはで1時間、ゲル上のサンプルを実行しますゲル。
2. セットアップSDS-PAGEからゲルを取り出し、ペトリ皿に1時間ゲルを沈めるためのボリュームとクマシーブリリアントブルー染色した（ 表2）を追加します。ロッカーで5分間脱色液（ 表2）でゲルをすすぎます。脱色液を変更し、Tの背景まで揺動してゲルを脱色し続けます彼ゲルは透明になります。タンパク質バンドは明らかに見えるはずです。
3. 標的タンパク質の分子量を決定するために、タンパク質ラダーに対する標的タンパク質の位置を比較します。
4. さらに、標的タンパク質の存在を確認するには、ステップ7と同様にウェスタンブロッティングを行います。

ウエスタンブロッティングを使用してAECMタンパク質の7キャラクタリゼーション

1. 無染色のセクション6のように、12％SDS-PAGEゲル上でサンプルを実行します。
2. SDS-PAGEゲルよりも若干大きいサイズにニトロセルロース膜をカットします。同じ大きさにろ紙の4枚をカット。
3. 濾紙の別の部分に続くウエスタントランスファーと濾紙の湿潤一体緩衝液（20％（v / v）のメタノール、25 mMトリス、190 mMのグリシン、pHは8.3）、濾紙の上にSDS-PAGEゲルを配置し、 、その後、ニトロセルロース膜、フィルターペーパーの最終的な他の二枚。全体のセットアップが十分な西部の転送バッファに沈めていることを確認します。
   注：タンパク質が接触した際に膜に結合することができるようにゲルと膜がこの時点で接触してはなりません。
4. ニトロセルロース膜に続く西部の半乾燥転写部へ2の濾紙を配置することによりニトロセルロース膜にタンパク質を移し、慎重に膜内と上のSDS-PAGEゲルを置き、最後の最後の2湿った濾紙を配置SDS-PAGEゲル。 45ミリアンペア、30分で西部の転送を実行します。電圧が30 [V]よりも高い場合に、バッファを追加
   注：好ましくは、1つの試みで膜上のSDS-PAGEゲルを配置し、タンパク質が接触した際に膜に結合することができるように膜に不必要にゲルをシフトすることは避けてください。
5. 取得し、RTで2時間（ろ紙でろ過PBSのpHは7.4、5％無脂肪乳）をブロッキング溶液でニトロセルロース膜をブロックします。ブロッキング緩衝液を処分し、すすぐためにPBSを追加します。
   注：不要なproteを有する膜を汚染しないために、新しい手袋に変更イン。
6. 揺らしながら室温で1時間：1,000 1でPBS中に希釈で一次抗His抗体をインキュベートします。 1ミリリットル全混合物のために999μlのPBSに：抗体の1μlを添加1,000（1 mg / mlのストック濃度：）希釈率1で、例えば、膜全体を沈めることができ、ボリュームに混合物を準備します。
7. PBST 5mlの（0.1％のTween20を含むPBS）で膜を洗浄します。
8. 揺らしながら室温で1時間5,000：1でPBSで希釈ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）に結合した二次抗体とインキュベートします。 5ミリリットル全混合物のために4999μlのPBSに：抗体の1μlを添加、5,000（1 mg / mlのストック濃度：）希釈率1で、例えば、膜全体を沈めることができ、ボリュームに混合物を準備します。
9. PBST 5mlでメンブレンを洗浄し、二回繰り返します。
10. 膜をカバーし、使用する基板のための手順に従って、インキュベートするボリュームを有する膜に化学発光基質を適用します。
    注：タンパク質の検出に基板の感度が異なる場合があり、我々は、信号を増加させない抗体濃度を増加させる場合には、非常に低い信号に対して最大感度を有する基板を推奨します。
11. CCDカメラベースのイメージャーを用いて化学発光信号をキャプチャします。信号が弱く、非特異的である場合は、プライマリおよび二次抗体の希釈率を調整します。バックグラウンド信号が高い場合、ブロッキング溶液中でより長くインキュベートします。

結果

エラスチン様反復を含む融合タンパク質を設計するには、全体のエラスチン含有量は、融合タンパク質¹⁸の十分大きな部分を維持することが重要です。これは、融合タンパク質構築物は、精製のためにITCを使用するために、そのエラスチン様特性を保持することを保証することです。このセクションで説明AECMタンパク質の設計および配列は、特にTjin らによって研究から採取した^。14。この研究では、三AECMタンパク質が正常たpET22b（+）発現ベクターにクローニングしました。シーケンシャル連結は、最初の細胞結合ドメインを挿入することにより、その後、エラスチン反復はpETベクターに挿入結紮から始まりました。最後に、エラスチン反復の最後のセットは、同じ方法を用いて、細胞結合ドメインの末端に挿入しました。組換え遺伝子が正常に構築されているかどうかを確認するには、それぞれの組換えプラスミドは、試験37℃で3時間、XhoIおよびSalIで消化し、C. 図1は、テスト消化後にDNAインサートとベクターのバンドを示しています。 AECMタンパク質のそれぞれ...

ディスカッション

組換えタンパク質工学は、ボトムアップアプローチを用いた新規タンパク質材料を作成するための汎用的な技術です。タンパク質ベースの材料は、目的の用途に応じて調整、複数の機能を有するように設計することができます。によるクローニングおよびタンパク質発現技術の増加発展には、再現性があり、スケーラブルな方法で人工タンパク質の様々なを作成するために、比較的簡単な（かつ費用対効果の高い）となっています。エラスチン様ドメインが精製タグとして機能するだけでなく、機械的特性を付与するために、人工タンパク質の数に組み込まれています。エラスチン様配列を含む人工タンパク質が容易に高価な精製カラムおよび抗体の必要性を排除するITCを用いて精製することができます。

このプロトコルは、AECMタンパク質をコードする組換えプラスミドを構築する手順について説明します。エラスチン様反復をコードする遺伝子は、購入しました。のためにポリペプチドのようなエラスチンのような反復性の高いペプチド配列は、再帰的な方向性ライゲーション（RDL）戦略は^22を使用することができるようなクローニング戦略を設計することをお...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
pET22b (+)	Novagen	69744	T7 発現ベクターとアンピシリン耐性
BL21(DE3)pLysS	Invitrogen	C6060-03	追加の抗生物質 - クロラムフェニコール
イソプロピル-β-D-チオガラクトシド (IPTG)	ゴールド バイオテクノロジー	I2481C	1 M ストック溶液とオートクレーブ水、導入前に新鮮にしてください。
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106	プラスミド分離キット
T4 リガーゼ	ニューイングランド Biolabs	M0202S
アンピシリン	Affymetrix	11259
Chloramphenicol	Affymetrix	23660
Zymoclean™ ゲル DNA 回収キット	Zymo Research	D4001
XL10-金株	アジレントテクノロジー	ズ200315