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方法論記事

非統合ソームプラスミドを用いて凍結軟膜から誘導多能性幹細胞の生成

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DOI:

10.3791/52885

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2015年6月5日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Biomedicine, European Academy Bozen/Bolzano (EURAC), 2Laboratory of Medical Genetics, Fondazione IRCCS Ca´ Granda, Ospedale Maggiore Policlinico, 3Del E. Webb Center for Neuroscience, Aging & Stem Cell Research, Sanford-Burnham Medical Research Institute

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

誘導多能性幹細胞（iPS細胞）が臨床応用および基礎研究のための患者特有の組織のソースを表します。ここでは、非組み込みエピソームプラスミドを用いてウイルスを含まないiPS細胞に凍結バフィーコートから得たヒト末梢血単核細胞（PBMNCs）を再プログラムするために詳細なプロトコルを提示します。

要約

体細胞は、典型的には、ヒト胚性幹細胞（hESC）で表される、（KLF-4、Oct-4の、ソックス-2、及びc-Mycの）は、4つの転写因子の発現を強制することによって誘導多能性幹細胞（iPS細胞）に再プログラムすることができ。によるヒトES細胞との類似性のために、性IPSCは、ヒトES細胞に関連する倫​​理的な問題を回避し、潜在的な患者特有の再生医療のための重要なツールとなっています。臨床応用のために適切な細胞を得るために、導入遺伝子を含まないiPS細胞は、導入遺伝子の再活性化、遺伝子発現の変化と誤った分化を回避するために生成される必要があります。また、非常に効率的で安価な再プログラミング方法は、治療目的のために十分なiPS細胞を誘導するために必要です。この必要性を考えると、効率的な非統合エピソームプラスミドアプローチは、iPS細胞の誘導に好適な選択です。現在、再プログラミングのために使用される最も一般的な細胞型は、線維芽細胞、組織生検を必要とするの分離、Iであります患者のためのnvasiveの外科的処置。そのため、ヒト末梢血は、iPS細胞の生成のための最もアクセスし、最も侵襲性の組織を表します。

本研究では、非組み込み型エピソームプラスミドを用いてコスト効果およびウイルスフリープロトコルは、全血の遠心分離後に密度勾配分離せずに凍結バフィーコートから得たヒト末梢血単核細胞（PBMNCs）からのiPS細胞の生成のために報告されています。

概要

2006年には、山中伸弥のグループが1 KLF-4、成体マウスおよびヒトからの体細胞は、4つの再プログラミング因子（Oct-4の、ソックス-2の異所性発現によって多能性状態に変換することができることを初めて実証し、 C-Mycの）、いわゆる人工多能性幹細胞（性IPSC）2を生成します。患者特異性IPSC密接形態、増殖、およびhESCの使用に関連する倫​​理的な問題を欠くと迂回し、三生殖細胞型（中胚葉、内胚葉及び外胚葉）に分化する能力の点でヒト胚性幹細胞（hESC）の似ています可能な免疫拒絶3。このように、性IPSCは、基礎研究、薬物スクリーニング、疾患モデリング、毒性の評価、および再生医療の目的のために4患者特異的細胞の最も重要な源の一つとして表示されます。

いくつかのアプローチは、iPS細胞の生成のために使用されている：ウイルスベクターを統合します（レトロウイルス5、レンチウイルス6）、ウイルス非組み込み型ベクター（アデノウイルス7）、センダイウイルス8、BACトランスポゾン9、エピソームベクター10、タンパク質11またはRNAの送達12。ウイルス媒介方法の使用は、高効率のリプログラミングにつながることができますが、ウイルスベクターは、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、したがって、潜在的なランダム挿入変異、遺伝子発現の永久的な変化、および分化の間沈黙導入遺伝子の再活性化は、13を除外することはできません。

再生医療用iPS細胞をより安全にするために、努力は携帯のゲノムへの外来DNAの組込みなしでiPS細胞を誘導するためになされています。切除可能なウイルスベクターおよびトランスポゾンが開発されているが、それは必然的に短く切除後に形質導入​​した細胞中に残存ベクター配列、およびトランスポザーゼの発現は、細胞内変化を誘発することができるかどうかまだ不明ですウラル機能13。その高い初期化効率にもかかわらず、センダイウイルスは、高価なアプローチを表し、このシステムを開発した会社でリーチスルーライセンスの懸念は、翻訳の研究でその用途を制限する可能性があります。さらに、タンパク質およびRNAの直接導入の必要性は、これが導入されて、固有の技術的な限界で分子を再プログラミングする複数の配信を必要とし、全体の再プログラミング効率は14非常に低いです。注目すべきは、エピソームプラスミドの使用に基づいて、費用対効果の高い無料のウイルスおよび非統合の方法は、正常皮膚線維芽細胞15の再プログラミングのために報告されています。具体的には、本研究で我々は、以前に10,15を報告したように、市販の統合フリーエピソームプラスミドを使用することにしました。

現在までに、皮膚線維芽細胞は、最も人気のあるドナー細胞型5を表します。しかし、他の細胞源は大成功していますsfullyケラチノサイト16、骨髄間葉系幹細胞17、脂肪間質細胞18、毛包19および歯髄細胞20を含むiPS細胞に再プログラム。これらの細胞の単離は、外科的処置を必要とし、数週間の初代細胞培養を確立するために、 インビトロ細胞増殖に必要とされます。

この観点から、細胞型の開始の選択は重要であり、それは、血液などの容易にアクセス可能で低侵襲性の組織からiPS細胞を生成することができることが同様に重要です。臍帯血単核細胞（CBMNCs）21,22と、末梢血単核細胞（PBMNCs）14,22-24両方が性IPSCの導出のための細胞の適切な供給源を表します。

成人PBMNCの再プログラミングの効率がCBMNCs 22のそれよりも20〜50倍低いが、それらは、サンプリング目的のために最も便利な細胞型のままです。で実際には、PBMNCサンプリングは低侵襲であるという利点があり、加えて、これらの細胞は、再プログラミング実験の前に、インビトロで広範な拡張を必要としません。現在までに、異なるプロトコルは、密度勾配分離後PBMNCsを凍結し、解凍した日数ヶ月に凍結後と性IPSC 22,23に再プログラミングする前に数日のために拡張することができることを報告しています。それにもかかわらず、限り我々が知っているように報告は凍結バフィーコートからPBMNCsの再プログラミングを説明していません。重要なことは、密度勾配分離することなく収集凍結軟膜は、このように、試料採取を回避するiPS細胞の製造のための材料の容易にアクセスできるプールを表す、集団研究から大規模なバイオバンクに保存されている最も一般的な血液サンプルを表します。

本明細書中で、私たちは以前に記載されたプロトコル22に基づいて、初めて人間の冷凍軟膜からのウイルスフリー性IPSCの生成を報告しています。でまた、性IPSCは、非密度勾配精製PBMNC結果の制御プロトコルとして、密度勾配分離後に得られた凍結PBMNCsから生成されました。

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プロトコル

末梢血単核細胞（PBMNCs）は、後のインフォームドコンセントと南チロル州の倫理委員会の承認に署名した健康なドナーのヒト末梢血サンプルから単離しました。実験は、ヘルシンキ宣言で表さ原理に従って行われました。すべてのデータが収集され、匿名で分析しました。

末梢血単核細胞（PBMNCs）の1の単離

  1. PBMNCsは、密度勾配分離することなく、全血を遠心分離した後、バフィーコートから得られました。
    1. クエン酸ナトリウム中に静脈末梢血の8ミリリットルを収集し、室温（25℃）で、プラスチックチューブ、およびストアバッファリング。採取後12時間内のプロセスの血液。
    2. スイッチングオフ遠心ブレーキを、スウィングローターで、4℃で15分間、2,000×gでチューブを遠心。
    3. 曇ったバフィーコート（上プラズマ相との間の層と下部の収集クリオバイアルチューブ内に濃縮されたPBMNC画分（500μl）を含む赤血球の大部分を含む相）、。
    4. 2×500μlの、10％のDMSO濃度で1mlの総容量を得るために、90％FBSおよび20％DMSOを含む培地を凍結してバフィーコートの500μLを再懸濁します。
    5. -80℃で制御された速度の冷凍コンテナのバイアルを凍結。より長い期間のために液体窒素中で細胞を保管してください。
  2. 密度勾配分離後に得られたPBMNCs
    1. クエン酸ナトリウムに静脈末梢血12mlのを収集するには、室温でプラスチックチューブ、およびストアをバッファリング。採取後12時間内のプロセスの血液。
    2. 35ミリリットルの最終容量まで無菌PBSで血液を希釈します。
    3. 慎重にゆっくりと、50mlコニカルチューブ（比率3：1）中の（密度勾配分離のために使用される）ポリスクロース溶液（P = 1.077）を15mlに希釈した血液の層35 mlです。
    4. RTで30分間、800×gでチューブを遠心スウィングローター、スイッチングオフ遠心ブレーキを。
    5. プラズマを含む上部、黄色相を吸引し、それを捨てます。慎重に、新しい50mlコニカルチューブにPBMNCsを含む不透明な白色相間層を転送します。
    6. 滅菌PBSで30 mlに全量を、室温で10分間、300×gで遠心します。
    7. 上清を捨て、PBS 30mlで細胞を懸濁します。トリパンブルー排除25に基づいて、生存細胞の数をカウントします。
    8. 室温で10分間、300×gで遠心分離PBMNCsは、上清を吸引し、それを捨てます。
    9. 5×10 6細胞/ mlの濃度を得るために、90％FBSおよび10％DMSOを含有する凍結培地の適当量に細胞ペレットを再懸濁します。
    10. アリコート1ミリリットル当たりのバイアル（約5×10 6細胞/ ml）と、制御速度凍結容器にバイアルを凍結- 80°C。より長い期間のために液体窒素中で細胞を保管してください。

2.解凍とPBMNCsのめっき（0日目）

  1. PBMNCsは、密度勾配分離することなく、全血を遠心分離した後、バフィーコートから得られました。
    1. 凍結したバフィーコートからPBMNCsを使用してプロトコルを開始するには、37℃の水浴中での細胞の1バイアルを解凍し、2mlの最終容量まで無菌PBSでバフィーコートを希釈。
    2. 50mlのコニカルチューブに希釈軟膜転送赤血球溶解緩衝液10mlを添加し、室温で10分間インキュベートします。
    3. 赤血球溶解緩衝液を500mlを調製するために、重炭酸カリウム0.5gを、塩化アンモニウム4.145グラム、超純水500ml、pHが7.2〜7.4の0.5 M EDTA溶液100μlを加えます。
    4. 滅菌PBSで50mlに全量を、室温で10分間、300×gで遠心します。
    5. 上清を捨て、滅菌PBS 50mlでペレットを洗浄、室温で10分間、300×gでバフィーコートを遠心してください。
    6. で細胞を再懸濁IMDMとハムのF-12（比率1：1）、インスリン-トランスフェリン-セレン-エタノールアミン（ITS-X）、化学的に1％の1％の定義された脂質濃縮PBMNC培地1mlを、としては、以前からなる、22に記載しました（CDL）、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、L-アスコルビン酸0.005％、ウシ血清アルブミン（BSA）0.5％、1-チオグリセロール（終濃度200μM）、細胞因子SCF（100ng / mlの）の幹、インターロイキン-3 IL-3（10 ngの/ ml）を、エリスロポエチンEPO（1 U / ml）を、インスリン様成長因子IGF-1（40 ngの/ ml）を、デキサメタゾン（1μM）及びホロトランスフェリン（100μg/ mlの）。
    7. 2×10 6細胞/ mlの密度で、コーティングすることなく、標準的な組織培養処理された表面を有する12ウェルプレートのウェルに移します。変更メディアステップ（セクション3を参照）まで、48時間加湿インキュベーター中、37℃、5％CO 2で細胞をインキュベートします。
  2. 密度勾配分離後に得られたPBMNCs
    1. 後に凍結したPBMNCsを使用してプロトコルを開始するには密度勾配分離、融解37℃の水浴中での細胞の1バイアルを、PBMNC培地5mlに細胞を移します。室温で10分間、300×gで遠心分離します。
    2. PBMNC培地1mlで細胞を再懸濁し、2×10 6細胞/ mlの密度で、12ウェルプレートのウェルに移します。変更メディアステップ（セクション3を参照）まで、48時間加湿インキュベーター中、37℃、5％CO 2で細胞をインキュベートします。

3.文化とPBMNCsの拡大（DAY 2-13）

  1. RTで10分間、300×gで15ミリリットルの円錐管と遠心機で、1mLの先端にピペットを使用して、懸濁培養でPBMNCsを収集します。
  2. 上清を捨て、新鮮なPBMNC培地1mlで細胞を懸濁します。
  3. 加湿インキュベーター中でコーティングすることなく、標準的な組織培養処理された表面を有する12ウェルプレートの1ウェルに細胞を移し、37℃でインキュベートして、5％CO 2。
  4. 2日ごとにこれらの手順を繰り返し、そして比1でセルを分割する：彼らは（80％程度）適切なコンフルエンスに到達したとき2。

エピソームプラスミドとPBMNCs 4.トランスフェクション（14日目）

注：プラスミド精製のための市販のキットを用いて、多能性遺伝子を有する4つの商業intergationフリーのエピソームプラスミドの単離を行い、アガロースゲル分析を使用して精製したプラスミドの品質を評価し、製造業者の指示に従って。

  1. 15ミリリットルコニカルチューブでPBMNCsを収集し、25（トリパンブルー排除に基づいて）生細胞の数をカウントします。
  2. 遠心分離機室温で10分間、300×gで2×10 6個の細胞。
  3. 100再懸濁バッファーTμlの各1μgのプラスミドDNAを含有するトランスフェクション混合物中に再懸濁2は、x 10 6細胞（p53のに対して、OCT3 / 4とするshRNAを運ぶ1つのプラスミド、1つのプラスミド運搬SOX2、およびKLF4、1プラスミドは、L-MYC及びLIN28を担持し、1つのプラスミド）をトランスフェクション効率をチェックするために、EGFPを運びます。
  4. 吸引し、100μlの先端に細胞を含むトランスフェクション混合物及び垂直チューブにピペットでサンプルを挿入するには、製造業者の説明書に従って、電気穿孔装置のピペットステーションに配置された電解バッファE2を3mlを充填します。
  5. 以下のプログラムを使用して効率的にエレクトロポレーションセル：1,650 V、10ミリ秒、3パルス。
  6. 0.25 mMの酪酸ナトリウム（のNaB）を追加して、予め温めておいたPBMNC培地2mlにエレクトロポレーションした細胞（2×10 6細胞）を再懸濁し、25（トリパンブルー排除に基づいて）、エレクトロポレーションプロトコル後の生細胞数をカウントします。
  7. 、コーティングなしで6ウェルプレートの1つのウェルに細胞を移し穏やかにプレートをロックし、加湿インキュベーター中、37℃、5％CO 2で細胞をインキュベートします。
  8. エレクトロポレーション、COUNの翌日トランスフェクション効率を評価するために、8-10のランダムフィールドの蛍光顕微鏡下でGFP陽性細胞の数はt。
  9. （第6節参照）のMEF上にメッキされるまで、3日間分割せずにトランスフェクトされた細胞を維持します。
  10. 新鮮PBMNCs培地2mlに加え、0.25 mMののNaB 2日ごとに交換してください。

5.共培養用フィーダー細胞と料理を準備します（16日目）

  1. コート37℃で15分間、基底膜マトリックス1mlの6ウェルプレートのウェル及びFBSを含有10％2mLでよく、2×10 5細胞/の濃度でマウス胚線維芽細胞（MEFの）をプレートDMEM（MEF培地）MEFフィーダー細胞上にエレクトロポPBMNCsを継代前に一日。

MEFの上へ6.メッキトランスフェクトのPBMNCs（DAY 17〜19）

  1. 10分間、300×gで15ミリリットルコニカルチューブと遠心分離機トランスフェクトPBMNCsで、1ミリリットルチップでピペットを用いて、懸濁培養でPBMNCsを収集RTで。
  2. 上清を捨て、新鮮なPBMNC培地2mlにペレットを再懸濁、プラス0.25 mMでのNaB。
  3. MEF-コーティングした6ウェルプレート上に細胞をプレートし、加湿インキュベーター中、37℃、5％CO 2で細胞をインキュベートします。
  4. 2日後、培地を吸引し、DMEM（KO-DMEM）、20％KO-血清代替（KOSR）、1 mMのNEAAs、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、20mMのL-ノックアウトからなるiPS細胞培地2mlと交換してくださいグルタミン、0.1mMのβメルカプトエタノール、10 ngの/ mlのFGF（基本のbFGF）および0.25 mMでのNaB。
  5. 毎日新鮮なiPS細胞培地2mlを交換して、毎日の細胞を確認してください。
    注：約22〜25日で、性IPSCの最初のコロニーが見えるはずです。

人工多能性幹細胞の7ピッキングと拡張（性IPSC）クローン（DAY 30〜35）

注：トランスフェクション後約30〜35日目に、iPS細胞コロニーをピッキングし、再播種のための準備ができているはずです。再プログラミング効率はESTIであるべきです以前に26報告されているように、iPS細胞コロニー/エレクトロポレーションした細胞の総数の数の割合として交配。

  1. iPS細胞コロニーを継代前日に、12ウェルプレート（1.25×10 5細胞/ウェル）でMEFフィーダーを用意します。
  2. 吸引しMEF培地および10 ngの/ mlのbFGFおよび10μMY-27632でiPS細胞培地1mLで変更します。手動で、グリッドを得るために、ピッキング、フード内で解剖顕微鏡下で各時刻で針1のコロニーを解剖し、ピペッティングにより小さい塊を収集したMEFでコーティングした12ウェルプレートの1ウェルに個別にそれらを転送します。
  3. さらなる増殖のために4：1の比率で、2、各6ウェルプレートを：比1で6ウェルプレートに各12ウェルプレートを通過して展開します。解剖した後、酵素解離プロシージャを使用し、（のような徹底的にステップ7.2で説明した）最初の2〜3継代のために手動でiPS細胞を拡大する（ステップ7.4から開始）。
  4. 酵素解離プロトコルの場合、きれいなiPS細胞のコローニピッキング·フードで解剖顕微鏡下で、分化した部分を吸引することにより、ES。
  5. 37℃で10分間のコラゲナーゼIVを1ml（1mg / ml）でiPS細胞をインキュベートします。
  6. 、酵素液を吸引KO-DMEM 1mlで細胞を洗浄し、15ミリリットルコニカルチューブにコロニーを収集します。 RTで2分間、100×gで遠心分離。
  7. 吸引した上清を、10 ngの/ mlのbFGF及び10μMのY-27632を用いてiPS細胞培地2ml中でコロニーを再懸濁し、MEFで被覆した6ウェルプレート（比1：4）上にプレート。

性IPSCの8.特性（5-15通路間）

  1. アルカリホスファターゼ染色
    1. 10 ngの/ mlのbFGFを持つiPS細胞培地中で3-5日間培養iPS細胞コロニーを。
    2. アルカリホスファターゼ染色プロトコルを開始するため、PBSで一回性IPSCをリンスし、次いで、室温で20分間、4％PFA 1mlでそれらを修正。
    3. 残留PFAを除去するために、PBSで細胞を3回洗浄します。
    4. 使用して染色固定細胞製造業者の指示に従って商業アルカリホスファターゼ染色キット。
  2. 免疫蛍光
    1. 10 ngの/ mlのbFGFを持つiPS細胞培地中で3-5日間培養iPS細胞コロニーを。
    2. 免疫蛍光アッセイを開始するには、PBSで一回性IPSCを洗浄した後、室温で20分間、4％PFA 1mlでそれらを修正。
    3. 残留PFAを除去するために、PBSで細胞を3回洗浄します。
    4. RTで1時間、4％ヤギ血清、0.1％BSA、0.1％トリトンX-100及び0.05％アジ化ナトリウム（NaN 3を） を含む溶液をブロッキング/透過1mlの固定性IPSCを扱います。
    5. ブロッキング溶液を吸引し、4℃で一次の3％BSA中の抗体および0.05％のNaN 3溶液のO / Nで固定した細胞をインキュベート（一次抗体リストの材料表をチェックして、抗体の希釈倍率を示唆）。
    6. 次の日、PBSで性IPSC 3回洗浄し、次いでAlexa Fluor 488ヤギ抗マウスおよびAlexaフロリダで細胞をインキュベートします37℃で1時間、3％BSAおよび0.05％NaN 3を溶液1,000：UOR 555ヤギ抗ウサギ抗体を、1に希釈しました。
    7. PBSで3時間洗浄し、暗所で室温で10分間、のためにDAPI（1μgの/ ml）で核を染色します。
  3. 胚様体におけるiPS細胞の分化（胚様）
    1. 10 ngの/ mlのbFGFを持つiPS細胞培地中で5-6日間培養iPS細胞コロニーを。
    2. ピッキング·フードで解剖顕微鏡下で、吸引することによってiPS細胞コロニーから分化した部分を削除します。
    3. 37℃で10分間のコラゲナーゼIVを1ml（1mg / ml）でiPS細胞をインキュベートします。
    4. 、酵素液を吸引KO-DMEM 1mlで細胞を洗浄し、15ミリリットルコニカルチューブにコロニーを収集します。 RTで2分間、100×gで遠心分離。
    5. 上清を吸引し、KO-DMEM、20％の定義されたウシ胎児血清（FBS）からなるEB培地2ml、1mMのNEAAs、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、20mMのL-グルタミン、0.1mMの中でコロニーを再懸濁します46;メルカプトエタノール。
    6. 球状​​三次元胚様体（EB）の形成を可能にするために、超低付着6-ウェルプレートに6日間懸濁液中のiPS細胞コロニーをプレート。 2日ごとに新鮮なEB培地2mlを変更します。
    7. 7日目に、EBを収集し、EB培地2mlで6ウェルプレートにコーティングし、20日間分化したEBを維持し、0.1％ゼラチンにそれらをプレート。
    8. 2日ごとに新鮮なEB培地2mlを変更します。
  4. 遺伝子発現解析のための定量RT-PCR
    1. 10 ngの/ mlのbFGFを持つiPS細胞培地中で5-6日間培養iPS細胞コロニーを。
    2. メーカーの指示に従って市販の試薬の1ミリリットルを使用してPBMNCs、iPS細胞やEBからの全RNAを抽出します。
    3. このような27分光光度計（280分の260および230分の260比> 1.8で高品質なRNA）を使用するなどの適切な方法により、RNAの濃度および純度を評価します。
    4. チェック製造業者のプロトコル（高品質のRNA RQI> 9.5）28に従って、市販のキットを用いてRNAの完全性。
    5. 製造業者の指示に従って商用逆転写キットを用いて全RNA1μgのに逆転写反応を行います。
    6. cDNA鋳型の5 ngの、7.5μlのSYBR GREENスーパーミックス、5μMのプライマー、2μlの含有定量PCR混合物の準備（フォワード：1μLとは逆：1μl）を、それぞれの反応29のためのRNase / DNaseを含まない水の6μLを。
    7. 45を60℃で10分間、95℃での初期変性工程、15秒間プライマーアニーリングおよび伸長工程95℃での変性段階に分け40サイクル、続いて、次のプログラムを使用して、定量RT-PCRを行って秒29。
    8. ハウスキーピング遺伝子28としてGAPDHを使用して、他の遺伝子の発現を正規化する（ 表1に示すプライマーを参照）。
  5. 定量PCR導入遺伝子の排除のための
    1. 50mMのトリス、100mMのEDTA、100mMのNaCl、1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）および20μg/ mlのプロテ​​イナーゼKを含有する溶解緩衝液1mlを用いPBMNCsまたはiPS細胞からDNAを抽出します
    2. RTで5分間、10,000×gでDNA沈殿および遠心分離を可能にするために3回の100％イソプロパノールを等量（1 ml）を追加し、反転により混合します。
    3. 室温で5分間、10,000×gで70％エタノール及び遠心の1mlでDNAペレットを洗浄、上清を捨てます。吸引し、上清を廃棄し、RNアーゼ/​​ DNアーゼフリーの水に再懸濁します。
    4. このような27分光光度計（280分の260および230分の260比> 1.8で高品質なRNA）を使用するなどの適切な方法により、DNA濃度及び純度を評価します。
    5. （：1μLとは逆：1μlのフォワード）および6＆DNAテンプレート5ngの、7.5μlのSYBR GREENスーパーミックス、5μMのプライマーの2μLを含む定量PCR混合物を準備＃181;各反応29のためのRNase / DNaseを含まない水のリットル。
    6. ハウスキーピング遺伝子29（ 表1に列挙されたプライマーを参照）としてFBX-15を使用して、特定のエピソームプラスミドのEBNA-1遺伝子の発現を正規化します。
  6. 核型分析
    1. 無フィーダー基底膜マトリックス上に培養5-6日間iPS細胞コロニーは製造者の指示に従って定義された商業、iPS細胞用フィーダーなしの維持培地でプレートを被覆しました。
    2. 核型分析プロトコルを開始するために、単一細胞分離が得られるまで、37℃で5分間、細胞剥離液1mlでiPS細胞コロニーを切り離します。
    3. 室温で5分間、400×gで細胞と遠心分離を収集します。
    4. 2mlの培地で再懸濁性IPSCは、具体的には出生前診断技術のための細胞を培養するために開発しました。基底膜マトリックス被覆ガラス皿上にプレート単細胞性IPSC、37℃、5％CO 2 <それらをインキュベート/サブ>インキュベーター。
    5. 2~4日後、培養物に直接10μL/ mlのコルヒチンを追加し、加湿インキュベーター中、37℃、5％CO 2で3時間インキュベートします。
    6. 培地を吸引除去し、室温で10分間、低張液（0.6％クエン酸ナトリウム及び0.13％の塩化カリウム）1mlにiPS細胞をインキュベートします。
    7. 5％酢酸溶液1mlで細胞を洗浄し、メタノール/酢酸溶液（比率3：1）を用いてiPS細胞を固定し、機械で制御された温度および湿度（28℃、42％RH）を有します。
    8. 浸し、暗所で室温で15〜20分間、キナクリン溶液で染色固定した細胞を30（Q-バンディングを得るため）。
    9. 100X倍率29で蛍光顕微鏡下で細胞分裂中期を取得します。

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結果

本研究では、全血の遠心分離および密度勾配分離が報告された後に得られたPBMNCsの再プログラミングと比較した後に凍結したバフィーコートから単離したPBMNCsの再プログラミングによるウイルスフリー性IPSCを生成するための簡単で効果的なプロトコルです。 図1（a）は、の概略図を示します詳細なプロトコル。解凍後、典型的な丸みを帯びた形状を示す単離されたPBMNCsは、14日間の特定の血液培養培地（ 図1B）に展開され、その後、エピソームプラスミドでトランスフェクトしました。 10〜15日後にトランスフェクションした後、定義されたマージンと胚性幹細胞様の形態を有する小さな丸い明るいコロニーが（ 図1C）現れ始めます。約20〜30日、トランスフェクション後に、iPS細胞コロニーは、シャープなエッジで、非常にコンパクトになり、そのサイズを大きくして、ピッキングと拡張（ 図1D）の準備ができています。最初の継代工程（2-3継代）した後、iPS細胞のコロニーをそれらの未分化状態を維持し、典型的なヒト胚性幹細胞の形態...

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ディスカッション

過去には、唯一の方法は、特定の遺伝的変異を有するヒト多能性幹細胞を得るためには、着床前遺伝子診断を受けている親を募集し、その廃棄31,32胚盤胞から胚性幹細胞を生成することでした。再プログラミングのアプローチを使用して、研究者らは現在、事実上すべての遺伝子型を保有する患者からiPS細胞を生成することができます。それは障害および新規治療アプローチのその後の識別の病態生理の研究を可能にするため、患者特異的細胞株と簡単にアクセスできるソースから開始する可能性は非常に重要です。

本研究では、我々はすでに凍結軟膜PBMNCsから以前に密度勾配分離22後に凍結PBMNCsからiPS細胞と正常に生成ウイルスフリー性IPSCを生成するために適用される方法とのプラスミドアプローチ15を組み合わせます。代わりに、密度勾配分離PBMNCsすべてのバフィーコートの使用サンプル処理中にオペレータのための時間と手動の手順を作業、コストを削減するために私達にOWS。凍結したバフィーコートからPBMNCsを使用して、低コストのプロトコルのセットアッ...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この研究は、保健省とボルツァーノ自治州の教育支援・大学・研究局、および南チロリアン・スパークス財団の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
クエン酸ナトリウム緩衝液VenosafeプラスチックチューブテルモVF-054SBCS07
アンモジウムSigma-AldrichA9434
炭酸カリウムSigma-Aldrich60339
EDTA二ナトリウム粉末Sigma-AldrichE51340.5 M溶液
Ficoll-Paque Premium GEヘルスケアライフサイエンス17-5442-02密度勾配遠心分離用ポリスクロース溶液
Iscoveの修飾ダルベッコ培地(IMDM) Gibco21056-023フェノールレッドハム
F-12Mediatech10-080-CV
インスリン-トランスフェリン-セレン-エタノールアミン (ITS -X)Gibco51500-056 1X (ノーマル: 100X)
Chemically Defined Lipid ConcentrateGibco119050311X (Stock: 100X)
ウシ血清アルブミン (BSA)Sigma-AldrichA9418
L-アスコルビン酸 2-リン酸セスキマグネシウム塩水和物Sigma-AldrichA8960
1-チオグリセロールSigma-AldrichM6145最終濃度 200 & micro;M
組換えヒト幹細胞因子 (SCF)PeproTech300-07100 ng/ml (在庫:100 µg/ml) 
組換えヒトインターロイキン-3 (IL-3)PeproTech200-0310 ng/ml (Stock: 10 & micro;g/ml)
組換えヒトインスリン様成長因子 (IGF-1)PeproTech100-1140 ng/ml (Stock: 40 µg/ml)
組換えヒトエリスロポエチン(EPO)R&Dシステムズ 287-TC-5002 U/ml (ストック:50 U/ml)
デキサメタゾン シグマ・アルドリッチD29151 μM (ストック: 1 mM)
ヒトホロトランスフェリンR&Dシステムズ 2914-HT100 &MU;g/ml (在庫:20 mg/ml)
Amniomax IIGibco11269016細胞遺伝学的解析用培地
mTeSR1StemCell Technologies5850iPSCフィーダーフリー培養用培地
ノックアウトDMEMGibco10829-018
ノックアウト血清補充Gibco10828-028
ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)Gibco15140-122
L-グルタミン (200 mM)Gibco25030-024
MEM 非必須アミノ酸溶液 (100X)Gibco11140-050
2-メルカプトエタノール Gibco31350-0100.1 mM (ストック: 50 mM)
酪酸ナトリウムSigma-AldrichB58870.25 mM (ストック: 0.5 M)
組換えヒト FGF 基本、145 aa R&Dシステムズ 4114-TC10 ng/ml (在庫: 10 & マイクロ;g/ml)
Y-27632 二塩酸塩Sigma-AldrichY0503 10 µM (在庫: 10 mM)
胎児定義ウシ血清HycloneSH 30070.03
EmbryoMax 0.1% ゼラチン溶液メルク・ミリポアES-006-B
マトリゲル基底膜マトリックス 成長因子の減少BD Biosciences354230
コラゲナーゼ, IV型Gibco17104-0191 mg/ml (在庫: 10 mg/ml)
AccutasePAALaboratories GmbHL11-007細胞剥離液
マウス胚性線維芽細胞 (CF1)Global StemGSC-6201G1*106 cells/6 well plate
プラスミド pCXLE-hOCT3/4-shp53-FAddgene 270771 & マイクロ;g(ストック:1µg/µl)
プラスミドpCXLE-hSKアドジェネ 270781 µg(ストック:1µg/µl)
プラスミドpCXLE-hULアドジェネ 270801 & マイクロ;g(ストック:1µg/µl)
プラスミドpCXLE-EGFPアドジェネ 270821 &マイクロ;g(ストック:1µg/µl)
アルカリホスファターゼ染色キットStemgent00-0009
Anti-stage-Specific Embryonic Antigen-4 (SSEA-4) AntibodyMerck-MilliporeMAB43041/250
Anti-TRA-1-60 AntibodyMerck-MilliporeMAB43601/250
Anti-TRA-1-81 AntibodyMerck-MilliporeMAB4381 1/250
Anti-Oct-3/4 抗体Santa Cruz Biotechnologysc-90811/500
Anti-Nanog AntibodySanta Cruz Biotechnologysc-337591/500
Anti-Troponin I AntibodySanta Cruz Biotechnologysc-153681/500
Anti-α-Actinin (Sarcomeric) AntibodySigma-AldrichA77321/250
Neuronal Class III ß-Tubulin (TUJ1) AntibodyCovanceリサーチプロダクツ株式会社 MMS-435P-1001/500
抗チロシンヒドロキシラーゼ (TH) 抗体Calbiochem6570121/200
Alexa Fluor 488 ヤギ 抗マウス 分子プローブA-110291/1000
Alexa Fluor 555 ヤギ抗ウサギ分子プローブA-214291/1000
超低接着細胞培養 6 ウェルプレートCorning3471
Trizol ReagentAmbion15596-018 RNA抽出用試薬
SuperScript VILO cDNA 合成キットInvitrogen11754050逆転写酵素キット
iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-Rad172-5124
CFX96 リアルタイム PCR 解析システムBio-Rad185-5195
Experion 自動電気泳動システムBio-Rad700-7000RNA の完全性を確認する装置
Experion RNAHighsense分析キットBio-Rad7007105RNAの完全性をチェックするための試薬キット
解剖顕微鏡(SteREO Discovery V12Zeiss495007
NeonTransfection System 100 µl キットInvitrogenMPK10025エレクトロポレーション用試薬キット
ネオントランスフェクションシステムInvitrogenMPK5000エレクトロポレーション用機器
NanoDrop UV/Vis 分光光度計Thermo ScientificND-2000DNA/RNA定量用機器
EndoFree プラスミド マキシキットQiagen12362プラスミド精製キット
塩化重)

参考文献

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非統合ソームプラスミドを用いて凍結軟膜から誘導多能性幹細胞の生成
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