クラス1インテグロンおよび遺伝子カセットのための食品のスクリーニング

サマリー

このプロトコルは、食品中のクラス1インテグロンとそれらに関連する遺伝子カセットの検出を説明しています。

要約

抗生物質耐性は、21^世紀の健康に対する最大の脅威の一つです。遺伝子の横伝播による耐性遺伝子の獲得は、多様な耐性メカニズムが広がる大きな要因です。横方向移動を促進するDNA要素の中で、クラス1インテグロンは、グラム陰性病原体間で抗生物質耐性の決定因子を広める主な役割を担っています。これらのインテグロンは、合計で130種類以上の抗生物質耐性遺伝子を獲得し、播種しています。抗生物質の使用が続くと、クラス1インテグロンは、ヒトとその家畜の共生動物や病原体に遍在するようになりました。その結果、彼らは現在、すべての人間の排泄物の流れで見つけることができ、そこで新しい遺伝子を獲得し続け、食物連鎖を通じて人間に戻る可能性があります。このプロトコルでは、培養とPCRを使用して、食品中のクラス1インテグロンとそれらに関連する耐性遺伝子カセットを検出するための合理化されたアプローチについて詳しく説明します。このプロトコルを使用すると、研究者は次のことができるようになります:濃縮培養物を作成し、クラス1インテグロンをスクリーニングするためのサンプルを収集して準備します。単一の細菌コロニーを分離して、インテグロン陽性分離株を同定します。クラス1インテグロンを含む細菌種を特定します。そして、これらのインテグロンとそれらに関連する遺伝子カセットを特徴付けます。

概要

抗生物質の発見は20 ^世紀の最も偉大な科学的成果の一つでした。しかし、抗生物質の使用や乱用は、抗生物質耐性菌の急速な進化につながっている、これらは現在、21世紀^の公衆衛生に深刻な脅威をもたらします。ほとんどの治療の選択肢に耐性細菌株の上昇は、我々は抗菌薬がもはや^1,2に効果的である時代に入っている可能性を高めます。

抗生物質耐性を付与する遺伝子機構は年間³百万のすることによって、ヒトおよび抗生物質選択圧をより以前、古代のシステムです。このようなプラスミド、トランスポゾン、ゲノムの島々 、統合的な接合要素とインテグロンなどのモバイル遺伝的要素は、内および細菌種⁴との間の両方の抗生物質耐性遺伝子（ARG）を広めることができます。これらのうち、インテグロンはもかかわらず、ARGの普及において中心的な役割を果たしてきました彼らは細菌ゲノム⁵への動員および挿入するためのプラスミドおよびトランスポゾンに依存しているという事実。インテグロンはインテグロンインテグラーゼを用いた遺伝子カセットをキャプチャして、[エンコードされインテグロンプロモーター^6,7（ 図1）を使用して、カセットを発現します。 インテグロン遺伝子カセットは、その製品の抗生物質や消毒剤⁸に対する抵....

プロトコル

生で食べたり、軽く調理される食品は、ヒトの健康のために最も懸念されます。例としては、サラダ、野菜、果物、甲殻類や甲殻類が含まれます。

1.サンプルの採取

1. 汚染を最小限に抑える条件下でサンプルを採取し、輸送中に独立した、クリーンバッグに格納されています。採取した後、サンプルを4℃で保存し、24時間以内に処理されるべきです。

2.エンリッチド文化の準備

1. 果物と野菜：
   1. 丈夫なビニール袋に材料の約10グラムを配置します。大きな材料を加工する場合は、果物や野菜の皮に集中しています。 90ミリリットルの0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0の処理は30秒間パドルブレンダーに加えます。パドルブレンダーが使用できない場合は別の方法として、材料を手動で撹拌することができます。
   2. 2 50ミリリットルファルコンチューブ内に液体を収集します。ペレット細菌に7分間4,000×gで遠心分離管。
   3. 上清を慎重に除去し、無菌ルリアベルターニ（LB）ブロス30ml中のペレット化した細菌を中断。
   4. 37℃で25℃で1チューブを保持し、他の、シェーカーO / Nでインキュベートします。培養物は、毎分200振動（OPM）で振盪されるべきです。 4℃で保存培養必要になるまで。
2. シーフード：
   ....

結果

intI1用混合培養し、細菌分離株のスクリーニング

プライマーセットHS463a / HS464 PCRは、クラス1インテグロン、インテグラーゼ遺伝子、intI1（ 図1）の存在を検出することができます。このプライマーセットは、混合培養でintI1を検出するためにうまく機能し、また、拡散板（ 図2）から回収した細菌コロニーをスクリーニングするために使用されます。正の分離株は、このプライマーセット（ 図3A）を用いて、471塩基対で、単一の強いバンドを生成する必要があります。正の分離株の大部分は、ヒトまたはそれらの農業や家畜に由来しているintI1を運ぶでしょう。これらの分離株はまた、311 bpのアンプリコン（ 図1）を生成する必要がある、プライマーF165 / R476を用いたPCRで陽性であることになります。 intI1の環境情報源は、一般的に、この第二のアッセイで陽性になりませ.......

ディスカッション

インテグロンおよびそれらに関連する遺伝子カセットの同定は、潜在的に、新たな日和見病原体の出現を予測する人間の食物連鎖の中に病原体のための経路を追跡し、新たな耐性を特定する際に重要なステップであり、毒性は^8,21,26を決定因子。本稿の目的は、そのカセットの配列を特徴付けるし、それらが存在する細菌種を識別し、クラス1インテグロンのためのサンプルをスクリーニングするための効率的なアプローチを説明することでした。プロトコルにおける重要なステップは、良好な微生物学的実践を伴って、偽陽性を生成するPCRの汚染を防止します。

ここで説明するプロトコルは、簡単に、ヒトの病原体で発見されたクラス2およびクラス3インテグロンを含む他の臨床的に関連するインテグロンを検出するように修飾することができます。また、水、バイオフィルム、土壌または堆積物から微生物群集でインテグロンを検出するように修飾することができます。いくつかのlimitatioがあります細菌細胞の培養に依存から生じるこの技術では、ナノ秒。多くの環境細菌は容易に培養可能なものではなく、ここに記載されているプロトコルは、こ.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
GoTaq Colourless Mastermix	Promega	M7132	すべてのPCRで使用
RNAse (ウシ膵臓からのリボヌクレアーゼA)	Sigma	R6513-10MG	すべてのPCRで使用
HinFI制限酵素	Promega	R6201	16S rDNA PCRの消化に使用されます。酵素は、最適な緩衝液とBSA
100 bpのはしご	GEヘルスケア	27400701	が付属しています すべてのアガロースゲル
GelRedDNAステイン	ビオチウム	41003	注意:この材料を取り扱うときは、個人用保護具を着用する必要があります
オシアン酸グアニジニウム	ライフテクノロジーAM9422		注意:この材料を取り扱うときは、個人用保護具を着用する必要があります
CLS-TC溶液	MP Biomedicals	6540409	ゲノムDNA抽出の開始時に使用される再懸濁液
Lysing Matrix E FastPrep チューブ	MP Biomedicals	116914500	細菌細胞壁の機械的破壊に必要なチューブ。このコードは500本のチューブのパックに使用され、少量が利用可能です。
結合マトリックス	MP Biomedicals	116540408	6 M グアニジニウムチオシアン酸で 1:5 に希釈し、ゲノム DNA 抽出法で使用します。
Fast Prepマシン	MP Biomedicals	利用可能なオプションの数	MP Biomedicalsは、購入可能なFastPrepマシンを多数ご用意しています。詳細については、http://www.mpbio.com をご覧ください

のサイズ標準として使用されます チ。