クラス1インテグロンおよび遺伝子カセットのための食品のスクリーニング

サマリー

このプロトコルは、食品中のクラス1インテグロンとそれらに関連する遺伝子カセットの検出を説明しています。

要約

抗生物質耐性は、21^世紀の健康に対する最大の脅威の一つです。遺伝子の横伝播による耐性遺伝子の獲得は、多様な耐性メカニズムが広がる大きな要因です。横方向移動を促進するDNA要素の中で、クラス1インテグロンは、グラム陰性病原体間で抗生物質耐性の決定因子を広める主な役割を担っています。これらのインテグロンは、合計で130種類以上の抗生物質耐性遺伝子を獲得し、播種しています。抗生物質の使用が続くと、クラス1インテグロンは、ヒトとその家畜の共生動物や病原体に遍在するようになりました。その結果、彼らは現在、すべての人間の排泄物の流れで見つけることができ、そこで新しい遺伝子を獲得し続け、食物連鎖を通じて人間に戻る可能性があります。このプロトコルでは、培養とPCRを使用して、食品中のクラス1インテグロンとそれらに関連する耐性遺伝子カセットを検出するための合理化されたアプローチについて詳しく説明します。このプロトコルを使用すると、研究者は次のことができるようになります:濃縮培養物を作成し、クラス1インテグロンをスクリーニングするためのサンプルを収集して準備します。単一の細菌コロニーを分離して、インテグロン陽性分離株を同定します。クラス1インテグロンを含む細菌種を特定します。そして、これらのインテグロンとそれらに関連する遺伝子カセットを特徴付けます。

概要

抗生物質の発見は20 ^世紀の最も偉大な科学的成果の一つでした。しかし、抗生物質の使用や乱用は、抗生物質耐性菌の急速な進化につながっている、これらは現在、21世紀^の公衆衛生に深刻な脅威をもたらします。ほとんどの治療の選択肢に耐性細菌株の上昇は、我々は抗菌薬がもはや^1,2に効果的である時代に入っている可能性を高めます。

抗生物質耐性を付与する遺伝子機構は年間³百万のすることによって、ヒトおよび抗生物質選択圧をより以前、古代のシステムです。このようなプラスミド、トランスポゾン、ゲノムの島々 、統合的な接合要素とインテグロンなどのモバイル遺伝的要素は、内および細菌種⁴との間の両方の抗生物質耐性遺伝子（ARG）を広めることができます。これらのうち、インテグロンはもかかわらず、ARGの普及において中心的な役割を果たしてきました彼らは細菌ゲノム⁵への動員および挿入するためのプラスミドおよびトランスポゾンに依存しているという事実。インテグロンはインテグロンインテグラーゼを用いた遺伝子カセットをキャプチャして、[エンコードされインテグロンプロモーター^6,7（ 図1）を使用して、カセットを発現します。 インテグロン遺伝子カセットは、その製品の抗生物質や消毒剤⁸に対する抵抗性を付与することができる単一のオープンリーディングフレーム（ORF）からなる小型のモバイル要素です。クラス1インテグロンは、最も一般的に、それらをまとめて130の異なる抗生物質耐性遺伝子カセット⁹を介して取得した臨床分離株⁵から回収インテグロンです。

人間関連共生や病原性細菌へのクラス1インテグロンの広がりは、これらの遺伝子エレメント¹⁰の多くが含まれている人間の廃棄物の流れを生成します。クラス1インテグロンが含まれている推定10 ¹⁹細菌が毎年下水汚泥を経てリリースされた私nはイギリス^11。これは、抗生物質耐性を付与するクラス1インテグロンは今野生の鳥類、魚類、および他の野生生物の^12-14の微生物叢中に検出されていることは驚くべきことではありません。新しい遺伝子カセットなどのモバイル要素と複雑な再配列の取得は、特に下水処理場や他の水域^15-18で、引き続き発生するので、戻って環境にインテグロンを解放すると、重大な公衆衛生上の脅威をもたらします。自然環境は、新しい耐性決定と日和見病原体^19,20のための肥沃な募集の地面になります。新規インテグロン含有細菌や新しいargsが汚染された水や食物^21,22を通じて人間社会に戻って一周することができます。環境ARGSのサーベイランスは、理解と将来²³に抗生物質耐性を管理するための重要な戦略です。具体的には、注意が生で食べたりしている食品に支払われるべきですこれらは、新しいモバイル要素と病原体の伝播のための最大の脅威を提示するので軽く、調理。

食品中のクラス1インテグロンおよびそれらに関連する遺伝子カセットが概説されて、検出、同定および特徴づけるためのこのプロトコルでは、効率的なアプローチ（ 図2）。培養およびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の組み合わせを使用して、インテグロンは急速に複雑な細菌群集及び個々の分離株で検出することができます。細菌およびインテグロン関連遺伝子カセットの立体構造と同一の種を同定するための方法が挙げられます。この方法は、植物及び動物の食品の広い範囲に適しており、典型的なワークフローの例は、これらの食品の種類ごとに与えられています。

プロトコル

生で食べたり、軽く調理される食品は、ヒトの健康のために最も懸念されます。例としては、サラダ、野菜、果物、甲殻類や甲殻類が含まれます。

1.サンプルの採取

1. 汚染を最小限に抑える条件下でサンプルを採取し、輸送中に独立した、クリーンバッグに格納されています。採取した後、サンプルを4℃で保存し、24時間以内に処理されるべきです。

2.エンリッチド文化の準備

1. 果物と野菜：
   1. 丈夫なビニール袋に材料の約10グラムを配置します。大きな材料を加工する場合は、果物や野菜の皮に集中しています。 90ミリリットルの0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0の処理は30秒間パドルブレンダーに加えます。パドルブレンダーが使用できない場合は別の方法として、材料を手動で撹拌することができます。
   2. 2 50ミリリットルファルコンチューブ内に液体を収集します。ペレット細菌に7分間4,000×gで遠心分離管。
   3. 上清を慎重に除去し、無菌ルリアベルターニ（LB）ブロス30ml中のペレット化した細菌を中断。
   4. 37℃で25℃で1チューブを保持し、他の、シェーカーO / Nでインキュベートします。培養物は、毎分200振動（OPM）で振盪されるべきです。 4℃で保存培養必要になるまで。
2. シーフード：
   1. 滅菌ピンセットとピンセットを用いて、胃（カキ）または消化管（エビ）を解剖し、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0の200μLを含む滅菌1.5mlチューブに入れます。ホモジネートを作成するためのサンプルを柔らかく。
   2. 2滅菌5ミリリットルチューブにLBブロス5mlのを分配し、シーフードホモジネートとそれぞれに接種。
   3. 25℃、他の37℃で1チューブを保持する、シェーカーO / Nでインキュベートします。培養物を200 OPMで振とうすべきです。 4℃で保存培養必要になるまで。

インテグロン3.スクリーニング文化

注：標準的なPCRプロトコールは、酵素、および2.5mmの最終のMgCl ₂濃度で提供される緩衝液を用いて、この方法で使用されています。必要に応じて、ローレンツ^{（2011）24は、}この雑誌の以前の問題で、PCRの最適化とトラブルシューティングの方法を概説しました。

1. ゆでたDNAの調製：
   1. 滅菌0.5ミリリットルのPCRチューブに濃縮された培養物100μlを分注します。水浴またはヒートブロックを用いて、10分間99℃にサンプルを加熱します。 2分間氷上で寒さをスナップ。
   2. 5分間、14,000×gでマイクロ遠心は、細胞破片をペレット化します。氷に戻ります。 DNAサンプルは、必要になるまで-20℃で凍結することができますが、氷上で解凍する必要があります。
2. PCRを使用して、クラス1インテグロンのスクリーニング：
   注：O / Nインキュベーションからの混合培養物をHS463a / HS464 PCRプロトコル（ 表1）を使用してクラス1インテグロンについてスクリーニングされます。
   1. 任意の潜在的SOUから離れて、氷の上のすべてのPCR試薬を解凍DNAの混入のRCE。陰性対照（ 表2）を含む、サンプルあたり48μlのPCRマスターミックスを構成します。バリアのヒントを使用して、各チューブにPCRマスターミックスの48μLを分注します。
   2. バリアのヒントを使用して、個々のPCRチューブに解凍したDNAの2μlを添加します。 PCRサーモに適切なプログラムを実行します。
   3. 増幅の結果を評価するために、注入し、TBE緩衝液（90 mMトリス - ホウ酸、2mMのEDTA）で実行する2％アガロースゲル上でPCR産物の7μLを電気泳動。 100bpラダーなどの分子量マーカーを含みます。
   4. ポストは、DNA染色でゲルを染色し、UVトランスイルミネーターを用いて可視化します。陰性コントロールには増幅がなされていないことを確認してください。任意の特定のサンプルのための周りの470塩基対での強いバンドが混合培養がクラス1インテグロンを運ぶ細菌を含んでいることを示します。純粋なコロニーは今PCR陽性を返された混合培養物から単離されます。

4。クラス1インテグロンのための単一コロニーのスクリーニング

1. 連続希釈と拡散板：
   注：PCR陽性の混合培養物からの単一コロニーを単離するために、混合培養物を連続リン酸ナトリウム緩衝液中で10倍に希釈し、その後、単一コロニーを回収するためにメッキされます。
   1. 0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0の9ミリリットルに混合培養の1ミリリットルを加え、反転により混合します。リン酸緩衝液をさらに9ミリリットルに希釈の1ミリリットルを追加し、10 ^-8の連続希釈に達するまで繰り返します。
   2. 二重に、LB寒天上に10 ^{-4〜10 -8}希釈液100μLを広げます。最初の混合培養に用いたのと同じ温度でプレートO / Nをインキュベートします。次いで、プレートを、しかし、それは非常に迅速に、単一のコロニーを処理するのが最善である、必要になるまで4℃で保存することができます。
2. 単一コロニーの選択と煮DNA調製：
   1. 連続希釈プレートから単一コロニーを選び、SEこのようなコロニーの大きさ、形状、色などの基準を使用して、できるだけ多くの異なるタイプのコロニーをlecting。スプレッドプレートから単一コロニーを選択するために、滅菌爪楊枝を使用してください。
   2. コロニーにつまようじをタッチし、次に100μlの滅菌水を含むPCRチューブに移します。多数のコロニーをスクリーニングする場合は、その後コロニーをマイクロタイタートレイ中で調製する​​ことができます。水への細胞の一部を除去するために指の間つまようじをスピン。
   3. 同じつまようじを使用して、コロニーのストリークを含むLBプレートに接種。各縞は約1cmの長さである場合、多数のコロニーは、標識されたプレート上に記憶することができます。あなたが分離株の適切な数を選択するまで繰り返し、1〜3を繰り返します。
   4. 最初の富化培養に用いたものと同じ温度で、LBプレートO / Nインキュベートします。必要になるまで、培養物を、次いで、4℃で保存することができます。
   5. 細菌懸濁液からDNAを調製するために、OUなどの手順に従ってください3.1節でtlined。純粋培養溶解物のスクリーニングのために、3.2節で概説されるようにHS463a / HS464 PCRを行います。 PCR陽性を返すの分離株は、ゲノムDNA（第5節）の製造のための、およびさらなる分析のために使用されます。

^25を打つビーズを使用したインテグロン陽性単一コロニーの5のゲノムDNA抽出

1. 4.2節で単離された純粋培養のサンプルとLBブロス5mlの接種。最初の富化培養に使用したのと同じ温度で振とう、O / Nをインキュベートします。
2. ペレット細胞は7分間、4,000×gで、その後、上清を除去します。ライジング行列Eの高速取管で1ミリリットルCLS-TC溶液中でペレット化した細胞を再懸濁します。ビーズ叩解機を用いて、30秒間5.5メートル/秒でサンプルを処理します。
3. 5分間、14,000×gで遠心分離管や滅菌1.5mlチューブに上清700μlのを回復します。
4. M関6と5：1に希釈した結合マトリックスの700μLを追加5分間室温でidiniumチオシアンミックス。 1分間14,000×gで遠心し、上清を捨てます。
5. ペレットを完全に再懸濁されるまで、800μlの塩エタノール洗浄（70％エタノール、0.1 M酢酸ナトリウム）、ボルテックスを追加。 1分間14,000×gで室温で5分間、遠心分離のために洗浄し、上清を捨てます。すべての上清を必要に応じて、マイクロピペットを使用して、削除されたことを確認し、その後5分間空気乾燥させ。
6. ピペッティングにより200μlのTE（10mMのトリス-HCl、1mMのEDTA、pHは7.6）でペレットマトリックスを再懸濁します。 3分間室温でインキュベートします。 3分、転送滅菌チューブに溶出したDNAの160μlのための14,000×gで遠心します。 DNA抽出の収量および完全性をチェックするために2％W / Vアガロースゲル上のゲノムDNA抽出の一部を実行します。精製ゲノムDNAは-20℃で保存し、PCR試験のために必要な場合に、氷上で解凍されます。

6.診断のPCRおよびDNAシークエンシング

注意：セクション5で調製したゲノムDNAは、すべての診断のPCRのために使用され、クラス1インテグロンのための陽性を確認します。

1. 簡単に20秒間14,000×gでDNAサンプルとパルススピンをボルテックス、氷の上でゲノムDNAを解凍します。分離株は、471塩基対のアンプリコン（3.2節）について陽性であることを確認し、HS463a / HS464を使用して、クラス1インテグロンインテグラーゼ遺伝子（ 表1）のためのPCRを繰り返します。
2. 種レベルの陽性培養の同定小サブユニットrRNA遺伝子（16S rDNAの）を分析することによって達成されます。プライマーF27 / r1492（ 表1）を用いて16S遺伝子を増幅します。電気泳動を用いてPCR産物を確認してください。すべての細菌のターゲットは、約1450塩基対の16Sアンプリコンを生成する必要があります。
3. 種同一性を決定するためのシーケンス16S rRNA遺伝子アンプリコンが、そこステップ6.2からの複数のPCRポジティブである可能性があり、これらの陽性の多くは、同じ細菌種になるので、我々は最初usin異なる種を区別します16S PCR産物gの制限消化。
   1. 制限酵素関数hinf 1と16S PCRの一部を消化。任意の4塩基対切断部位致します認識する酵素が、 関数hinf 1は、16Sのターゲットからの良好な多様性を生成し、信頼性の高い、安価な酵素です。
4. 30μlの制限は、滅菌チューブにマスターミックス（ 表2）を消化し ​​、未purfied 16S PCR産物の20μlを添加設定します。 37℃の水浴O / Nでインキュベートします。 2％アガロースゲル上でダイジェストを確認してください。
5. 関数hinf 1によって生成される消化パターンをスコア。同じ16S制限プロフィールと分離株は、同じ種である可能性が高いです。むしろ、すべての16S PCR産物は、各関数hinf 1制限パターンの最も3代表での配列を配列決定するよりも。
6. 市販のキットを用いて16S PCR産物を精製します。一本鎖エキソヌクレアーゼキットを使用することができるが、列ベースのまたは沈殿法もuninc除去するためにうまく機能しますプライマーおよび一本鎖DNAをorporated。シーケンスプライマーR910（ 表1）を用いてシークエンシング機能によって指定されたような反応をセットアップ16Sアンプリコン。
7. BLASTN機能（NCBIでのDNAデータベースを調べるために、得られたDNA配列を使用しhttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ）。 97％以上のヌクレオチド同一性は、通常、種のアイデンティティとします。

7.マッピングとインテグロンとカセット配列の特徴

注：人間が支配生態系から発するクラス1インテグロンは、すべてのサンプルの中で最も一般的なインテグロンである可能性が高いです。これらのインテグロンすべては、最近の単一起源を持っているため、高度に保存されたDNA配列^5を持っています。

1. クラスの間に1人のソースから発するインテグロンと行うことにより、環境試料中に天然に存在するものを区別プライマーを用いたPCRはintI1F165 / intI1R476 ^10（ 表1）を設定します。
   注：環境クラス1インテグロンが任意の製品を生成しませんしながら、臨床的または共生細菌からのクラス1インテグロンは、〜300 bpの産物を生成します。
2. プライマーセットHS458 / HS459とカセットの配列を増幅することにより、臨床インテグロンを特徴づけます。このPCRは、ほとんどのカセットの配列の末端にintI1および3 '保存されたセグメント間の領域を増幅します。カセットの数および同一性は可変であるので、PCR産物の大きさも変化するであろう。
3. アンプリコンを精製し、増幅プライマーのそれぞれを用いて、DNAを配列決定します。 BLASTN機能（使用して、DNAデータベースを調べるために配列を使用http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiを ）。
4. カセットの命名はインテグロン遺伝子カセットのための多くのデータ·堆積するので、標準化された命名法^9に従うことを確認Sは矛盾やあいまいな名前を使用します。これらは伝達、病原性や毒性^8,21を増加与える遺伝子を含む、新たな表現型をコードすることができるので、新規遺伝子カセットに特に注意を与えます。
   注：クラス1インテグロンの前臨床形態は、まだ自然環境に循環します。特に、アクティブテネシー402トランスポゾンにリンクされているものは、ほとんど関心²⁶のものです。これらのインテグロンのカセット配列はプライマーセットHS458 / HS459で増幅されませんが、カセットコンテンツに依存して可変サイズのアンプリコンを生成し、MRG284 / MRG285プライマーセット（ 表1）を用いて増幅することができます。 7.2に概説するようにPCR産物は精製されるべきであり、DNAを配列決定しました。

結果

intI1用混合培養し、細菌分離株のスクリーニング

プライマーセットHS463a / HS464 PCRは、クラス1インテグロン、インテグラーゼ遺伝子、intI1（ 図1）の存在を検出することができます。このプライマーセットは、混合培養でintI1を検出するためにうまく機能し、また、拡散板（ 図2）から回収した細菌コロニーをスクリーニングするために使用されます。正の分離株は、このプライマーセット（ 図3A）を用いて、471塩基対で、単一の強いバンドを生成する必要があります。正の分離株の大部分は、ヒトまたはそれらの農業や家畜に由来しているintI1を運ぶでしょう。これらの分離株はまた、311 bpのアンプリコン（ 図1）を生成する必要がある、プライマーF165 / R476を用いたPCRで陽性であることになります。 intI1の環境情報源は、一般的に、この第二のアッセイで陽性になりませ...

ディスカッション

インテグロンおよびそれらに関連する遺伝子カセットの同定は、潜在的に、新たな日和見病原体の出現を予測する人間の食物連鎖の中に病原体のための経路を追跡し、新たな耐性を特定する際に重要なステップであり、毒性は^8,21,26を決定因子。本稿の目的は、そのカセットの配列を特徴付けるし、それらが存在する細菌種を識別し、クラス1インテグロンのためのサンプルをスクリーニングするための効率的なアプローチを説明することでした。プロトコルにおける重要なステップは、良好な微生物学的実践を伴って、偽陽性を生成するPCRの汚染を防止します。

ここで説明するプロトコルは、簡単に、ヒトの病原体で発見されたクラス2およびクラス3インテグロンを含む他の臨床的に関連するインテグロンを検出するように修飾することができます。また、水、バイオフィルム、土壌または堆積物から微生物群集でインテグロンを検出するように修飾することができます。いくつかのlimitatioがあります細菌細胞の培養に依存から生じるこの技術では、ナノ秒。多くの環境細菌は容易に培養可能なものではなく、ここに記載されているプロトコルは、こ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
GoTaq Colourless Mastermix	Promega	M7132	すべてのPCRで使用
RNAse (ウシ膵臓からのリボヌクレアーゼA)	Sigma	R6513-10MG	すべてのPCRで使用
HinFI制限酵素	Promega	R6201	16S rDNA PCRの消化に使用されます。酵素は、最適な緩衝液とBSA
100 bpのはしご	GEヘルスケア	27400701	が付属しています すべてのアガロースゲル
GelRedDNAステイン	ビオチウム	41003	注意:この材料を取り扱うときは、個人用保護具を着用する必要があります
オシアン酸グアニジニウム	ライフテクノロジーAM9422		注意:この材料を取り扱うときは、個人用保護具を着用する必要があります
CLS-TC溶液	MP Biomedicals	6540409	ゲノムDNA抽出の開始時に使用される再懸濁液
Lysing Matrix E FastPrep チューブ	MP Biomedicals	116914500	細菌細胞壁の機械的破壊に必要なチューブ。このコードは500本のチューブのパックに使用され、少量が利用可能です。
結合マトリックス	MP Biomedicals	116540408	6 M グアニジニウムチオシアン酸で 1:5 に希釈し、ゲノム DNA 抽出法で使用します。
Fast Prepマシン	MP Biomedicals	利用可能なオプションの数	MP Biomedicalsは、購入可能なFastPrepマシンを多数ご用意しています。詳細については、http://www.mpbio.com をご覧ください

のサイズ標準として使用されます チ。