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方法論記事

ヒトアデノウイルス5型に基づく高容量アデノウイルスベクターのクローニングおよび大規模生産

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DOI:

10.3791/52894

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2016年1月28日

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1Institute of Virology and Microbiology, Center for Biomedical Education and Research (ZBAF), Department of Human Medicine, Faculty of Health, University Witten/Herdecke

この記事について

サマリー

すべてのウイルスコード配列を欠く大容量のアデノウイルスベクターを生成するためのプロトコルが提示されます。ベクターゲノムに含まれる導入遺伝子のクローニングは、ホーミングエンドヌクレアーゼに基づいています。接着細胞として増殖した産生細胞および懸濁細胞におけるウイルス増幅は、トランスでウイルス遺伝子を提供するヘルパーウイルスに依存しています。

要約

すべてのウイルスコード配列を欠いた大容量アデノウイルスベクター(HCAdV)は、その高いパッケージング容量(最大35 kb)、低免疫原性、および低毒性により、最も先進的な遺伝子導入ベクターの1つです。しかし、多くの研究室では、ベクターゲノムの構築とウイルス産生の複雑な手順により、HCAdVの使用が妨げられています。ここでは、HCAdVゲノムを含むプラスミドpAdFTCに基づくHCAdVの効率的なクローニングおよび産生のための詳細なプロトコールについて説明します。HCAdVゲノムの構築は、ホーミングエンドヌクレアーゼ(I-CeuIおよびPI-SceI)を利用したクローニングベクターシステムに基づいています。最大14 kbの目的の遺伝子を、I-CeuIとPI-SceIが隣接する複数のクローニング部位を含むシャトルベクターpHM5にサブクローニングできます。I-CeuIおよびPI-SceIを介したシャトルベクターからの導入遺伝子の放出後、導入遺伝子をHCAdVクローニングベクターpAdFTCに挿入することができます。pAdFTCプラスミドのサイズが大きく、使用済み酵素の認識部位が長いため、DNAの強力な結合に関連するため、クローニングフラグメントの慎重な取り扱いが必要です。ウイルス産生では、NotI消化物によってHCAdVゲノムが放出され、安定的に発現するCreリコンビナーゼを発現するHEK293ベースの産生細胞株にトランスフェクションされます。アデノウイルス増幅のためのすべてのアデノウイルス遺伝子を提供するには、loxP部位に隣接するパッキングシグナルを含むヘルパーウイルスとの同時感染が必要です。ベクターのプレアンプ化は、表面上に増殖した生産者細胞で行い、ベクターの大規模増幅は、懸濁液中で増殖させた生産者細胞を用いてスピナーフラスコで行います。ウイルス精製では、塩化セシウム勾配に基づく2つの超遠心分離ステップとそれに続く透析が行われます。ここでは、このHCAdVベクターシステムを使用して過去数年間に開発されたヒント、コツ、ショートカットを紹介します。

概要

遺伝子治療用途のためには、ウイルスタンパク質の発現、トランス遺伝子単独で、または着信ウイルスタンパク質により引き起こされる細胞傷害性および免疫原性の副作用を回避するために非常に重要です。アデノウイルスベクター（ADVが）が広く導入遺伝子発現1,2の影響を調査するために多種多様な細胞に外来DNAを導入するために使用されます。 AdVの最も先進的なバージョンは、3,4、すべてのウイルスコード配列を欠くし、それによって、低免疫原性および低毒性5-8と合わせ35キロバイトまでのパッケージング能力を提供する高容量アデノウイルスベクター（HCAdV）で表されます。その高い包装能力に彼らは、単一のベクター用量を使用して、大規模または複数の導入遺伝子の送達を可能に。したがって、彼らは、研究コミュニティのための貴重なツールを表します。

初段または容易に市販のキットを用いて製造することができる初期遺伝子E1及び/又はE3を欠いている第二世代のAdVとは対照的に、VECTOR HCAdVのゲノム構造とウイルス生産はより複雑です。 HCAdVゲノムを構成するためのシステムは、全てのウイルスコード配列を欠いHCAdVゲノムを有するプラスミドのpAdFTCとシャトルプラスミドpHM5 9-12に基づいています。最大14キロベース（KB）の任意の目的の遺伝子がマルチクローニングサイトは、ホーミングエンドヌクレアーゼ部位を切断/認識によって隣接されたシャトルベクターpHM5にクローニングすることができるSCE IおよびI-CEU IをPI-そのため、目的のクローニングされた遺伝子は、連続したPI-SCE IとI-CEU私によって解除することができ、プラスミドpAdFTCに含まHCAdVのゲノム中に存在する同じ制限部位に後続導か挿入するためのダイジェスト。 pAdFTCではPI-SCE IとI-CEU私切断部位の間に位置する導入遺伝子の挿入部位は、スタッファーDNAと、そのような5 'および3'逆方向末端反復配列（ITR）としてゲノムパッケージングに必要な非コードアデノウイルス配列が隣接しています終了し5'ITRの下流のパッケージングシグナルの両方で。追加のスタッファーDNAは、ウイルス産生の間に効率的なパッケージングを確保するために、27〜36キロバイトの範囲の最終HCAdVゲノムの最適なサイズを提供します。 pAdFTCには、最大45キロバイト（挿入された導入遺伝子のサイズに依存）を持つ大規模なプラスミドであり、比較的長いDNA認識部位とのホーミングエンドヌクレアーゼの使用が強い結合するDNAを示し、いくつかのクリーンアップ手順は、pHM5から導入遺伝子の転写時に必要ですので、 pAdFTCへ。剪断力を避ける慎重な取り扱いが推奨されます。

HCAdVのゲノムのITRは5'ITRの上流に直接的に配置され、3'ITR 12の下流にNot I制限酵素認識部位に隣接されます。したがって、HCAdV わけではありません、私はHCAdVのプロデューサー細胞株へのウイルスゲノムのその後のトランスフェクションのためにダイジェストによって解除することができます。なお、制限酵素の使用はありません私のrelのためのプラスミドpAdFTCからウイルスゲノムの容易さは、挿入された導入遺伝子ではなく、私のDNA認識部位を欠いていることを意味します。 HEK293細胞ベースのプロデューサー細胞（116細胞）を安定的にCreリコンビナーゼを発現します。ウイルス増幅のために116細胞は 、トランス3,4 で複製およびパッケージングに必要なすべてのADV遺伝子を提供するヘルパーウイルス（HV）と同時感染しています。 HVが116 セル 4内で発現Creリコンビナーゼによるウイルス増幅中に除去されるflox化パッキング信号と第一世代のAdVです。これは、完全なパッケージングシグナルを含む主にHCAdVゲノムがキャプシド化されることが保証されます。

HCAdVの前増幅は、組織培養皿内の表面上に成長させた116細胞における連続継代工程を行うことによって行われます。それぞれの継代後、ウイル​​ス粒子は、3つの連続した​​凍結融解工程を行うことにより、感染細胞から放出されます。細胞の数を増加させるあらゆる通路はに感染していると前の通路からの細胞溶解物の1/3。最後に、前増幅ステップが、大規模な増幅のためのスピナーフラスコ中の懸濁液中で増殖させたプロデューサー細胞を感染させるために使用されてから最終的に溶解物。ビリオンは、塩化セシウム密度勾配超遠心分離に4,12を行うことにより、懸濁細胞から精製されます。この手順で空の粒子と完全に組み立てられた粒子は、2つの別個の帯域に分割されています。さらにHCAdVを濃縮し、第2の非段階的な超遠心分離工程が実施される粒子。その後HCAdVを含む得られたバンドを回収し、生理的な緩衝液に対して透析します。最終ベクター調製物は、絶対的なウイルス粒子の感染性粒子およびHVの汚染レベルの数に関して特徴付けられます。絶対的なウイルス粒子は、ウイルス粒子を溶解し、260nmの吸光度を測定することにより、または定量的リアルタイムPCR（定量PCR）12を実行することによって決定することができます。 PURの感染ifiedウイルス粒子は、感染した細胞3時間後、感染中に存在HCAdVゲノムを測定するqPCRにより決定することができます。

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プロトコル

1.プラスミドpAdFTCに基づく組換えHCAdVゲノムの構築

注：全てのプラスミドは、11,12、以前に説明され、リクエストに応じてご利用いただけますされています。クローニング手順は、 図 1に概略的に示されています。

  1. pHM5-GOIを生成するために、選択肢のクローニング戦略を使用して、シャトルプラスミドpHM5にプロモーターおよびポリアデニル化シグナル（PA）を含む、目的の遺伝子（GOI）を複製します。
    注：pAdFTCが比較的大きいプラスミドであるので、古典的なプラスミド調製プロトコルはシリカ膜に基づいている商業用プラスミド精製キットを用いて、プラスミドDNAのSheeringのを避けることをお勧めします。 I-CEU IとPI -Sce私は強く、DNAに結合し、消化し ​​たDNAの電気泳動移動度を変更します。したがって、フェノール - クロロホルム抽出およびエタノール沈殿（ステップ1.3）をアガロースゲル電気泳動の前に必要とされます。
  2. PHM20μgのダイジェスト5-GOI、37℃で3時間のI-CeuI（10 U）によりpAdFTC10μgのプラスミド（それぞれ〜2.8キロバイト+ GOI ORF配列と〜31キロバイトなど）を線形化する全量100μlインチ
  3. エタノール（エタノール）の沈殿13に続くフェノール-クロロホルム抽出を使用して、線状化プラスミドを精製します。
    1. クロロホルム：フェノール100μlの追加イソアミルアルコールを、チューブを数回転倒混和します。 15,000×gで2分間遠心。
    2. 上清を新しいチューブに移し、酢酸ナトリウム20μlの液（pH 5,3 M）と氷冷EtOH（99.8％）の400μlを添加し、激しくサスペンションを混ぜます。 15,000×gで10分間遠心。
    3. 15,000 X gで上清を除去し、70％エタノールの300μlを添加し、2分間遠心します。その後、上澄み液と空気乾燥DNAペレットを削除します。 dH 2 Oの10〜20μlのペレットを溶解それは、溶液中のDNAを取得するには困難であるように、あまりにも長い間乾燥していないDNAペレットを実行してください。
  4. ダイジェストI-CEU私（10 U）は全量50μl中で37℃で制限酵素PI -Sceで少なくとも3時間またはO / N用）ステップ1.3からpHM5-GOIとpAdFTCプラスミドを-digested、その後、 私を浄化-CeuI と PI -Sce私は（ステップ1.3を参照）をエタノール沈殿に続くフェノール-クロロホルム抽出を使用してプラスミドを消化し ​​ました。ヌクレアーゼ無料のdH 2 O20μlのDNAを溶解
  5. 個別のpHM5プラスミドバックボーン（2.8キロバイト）とGOI（ステップ1.4）から調製アガロースゲル上および商業ゲル状とPCR-クリーンアップキットを用いてGOIをゲル精製し。消化物の代表的なアガロースゲルを図2Aに示されています。
  6. 脱リン酸化I- CEU私 そして子牛腸アルカリホスファターゼCIP（10U）とPI -Sce I-消化pAdFTC（ステップ1.4から）、37℃で1時間25μlの総容量で、フェノール-クロロホルム抽出とその後のエタノールにより脱リン酸化プラスミドpAdFTCを浄化PRecipitation（ステップ1.3）。ヌクレアーゼ無料のdH 2 O20μlのDNAを溶出
  7. ダイジェストが完了していると予想される断片の大きさは、線形化pAdFTCの正しい（〜31キロバイトであるかどうかを分析するために（ステップ1.6から）脱リン酸化pAdFTCプラスミドのアリコートと（ステップ1.5）から精製されたGOI-フラグメントから分析ゲル電気泳動を行います）。
    注 ：GOIのサイズは、導入遺伝子発現カセットのサイズに応じて可変です。その後のライゲーションのために、それぞれの断片の相対濃度を推定します。精製断片の代表的なアガロースゲルを、 図2Bに示されています。
  8. 400 UのT4 DNAリガーゼと1の挿入するためのベクターのモル比を用いて20μlの総容量でライゲーション反応を設定します3。
    メモ ：図2（b）に示すアガロースゲルと一致では通常、6μlのベクトルに、2-と20μlの総容量で、8〜12μLを連結します挿入し、T4 DNAリガーゼの400 U。 DNA濃度は、いくつかのフェノール化ステップの後、通常は低いように20μlの最終体積に達するように、追加のH 2 Oを添加しなければならないように、できるだけ多くのDNAを使用します。 16°のCO / Nで連結し、その後、エタノール沈殿（ステップ1.3）に続くフェノール - クロロホルム抽出を行います。
    1. ヌクレアーゼ無料のdH 2 Oを15μlのDNAを溶出し、20μlの総容量で、25℃で2時間の制限酵素のSwaI（10 U）で精製し、ライゲーション反応を消化。次いで濃縮し、EtOH沈殿（ステップ1.3）に続くフェノール - クロロホルム抽出を行うことによって、DNAを精製します。ヌクレアーゼ無料のdH 2 O10μlにDNAを溶出
  9. 私はDH10BまたはDH5αエレクトロ大腸菌にエレクトロポレーションによりライゲーション産物を消化し ​​、精製SWAの2μLを変換コリ及びアンピシリンを含むLB上で37℃で16〜24時間のためにクローンを選択プレート（50 mg / mlのアンピシリン）。 5〜10個のクローンを選択し、フェノール-クロロホルム抽出とその後のエタノール沈殿（ステップ1.3）13に続いてアルカリ溶解を用いてプラスミドDNAのミニ調製物を準備します。
  10. DNA断片のサイズを確認するためにアガロースゲル電気泳動に続いてプラスミドミニ調製物の分析ダイジェストを行います。推奨制限酵素はインスタンスI-CEU IおよびPI-SCEは、私が挿入、 のSpeIかのHinc II（ 図2C）を解放するためのものです。
  11. アンピシリンを含むLB培地中で正確なクローンを増幅し（50 mg / mlのアンピシリン）及び市販のプラスミド精製キットを使用して、MIDIまたはマキシプラスミド調製を行います。

プロデューサー細胞株116でpAdFTCプラスミドとHCAdVベクターのプレ増幅からHCAdV-ゲノムの2リリース

  1. ステップ1.11からクローニングされたGOIを含むpAdFTCベースのアデノウイルスの生産プラスミド）中の20μgのダイジェスト私は> 37℃で2時間（20 U） はありません使用して、全量100μlと二回エタノール沈殿に続くフェノール-クロロホルム抽出を行います。 20〜30μlの滅菌のdH 2 Oに溶解させ、
  2. ゲル電気泳動により1:10に希釈消化pAdFTC-GOI-DNAのアリコートを確認してください。プラスミド骨格9 kb断片と、GOIのサイズに応じて、HCAdVゲノム（サイズ：28〜36キロバイト）のための第二のDNA断片が検出可能です。
    注：ない私ダイジェストの代表例を図2Dで表示されます。線状化DNAを数週間4℃または-20℃で数日間保存することができます。
  3. プロトコルに進む前に、ヘルパーウイルスAdNG163R-2は4増幅されたことを確認してください。
    注意 ：pAdFTC派生HCAdVベクターでトランスフェクトされた細胞は、バイオセーフティレベル2（BSL-2）、適切な封じ込めおよび廃棄物の処理を使用してくださいと分類遺伝的に改変された生物でありますBSL-2層流フードの下の個人用保護具、作業などの対策。
  4. 10％FBSおよびハイグロマイシンB（100μg/ ml）を添加したMEMイーグル培地中で培養116細胞。 （通路10以下）シード低継代116細胞（〜0.4×10 6細胞 ）を60mm組織培養皿でトランスフェクションの1日前に、彼らは次の日に50〜80％の密集度に達することになります。
  5. このようなリン酸カルシウムトランスフェクション、または他の市販のトランスフェクション試薬（ 図3A）のような方法を使用して116細胞へのステップ（2.1）から、線形化HCAdVゲノムをトランスフェクトします。 16- 18時間トランスフェクション後、慎重にセル当たり（コンフルエントので、HV AdNG163R-2 4 5変換ユニットを適用する（TU）で細胞を3ミリリットルを追加し、新鮮な培地（MEM、5％FBS）を培地を除去し、感染60ミリメートル組織培養皿）は〜3.2倍10 6細胞を含む、HVの1.6倍〜10 7 TUを追加します。
    1. 静かに、感染後の最初の時間の間、皿ごとに20分を動かします同じHV分布を確保。 37℃で感染細胞を培養し、5％CO 2。ウイルス複製に起因する効率的なウイルス増幅細胞変性効果（CPE）の場合に観察された（細胞が切り上げと緩く付着または組織培養皿から剥離している）ポストinfection.If CPEが観察された48時間は、以前のHVの量は持っています削減すること。 CPEが後に起動した場合、より多くのヘルパーウイルスを使用しなければなりません。
  6. 培養培地を用いて培養皿から細胞をオフにフラッシュすることによって48時間の感染後の上清を含む収穫細胞。それらの培養培地中に懸濁された細胞を継代0（P0）と呼ばれます。 2つの画分に分割P0。
    1. 剥離した細胞を0.5 mlの2,000×gで3分間細胞をスピンダウンし、細胞ペレットから培地を除去し、それは後に、増幅プロセスの定量PCRベースの分析のためのゲノムDNA（gDNAの）を単離するために使用されます。さらに処理するまで-20℃で保存した細胞ペレットを。
    2. 2.5から剥離した細胞mlのは、その中の3〜4倍に再懸濁された細胞を（℃または液体窒素中で-80で）凍結し（室温でまたは37℃の水浴中で）解凍することによってウイルス粒子を放出します。この画分は、P0の溶解物と呼ばれるよりもあります。
  7. FBS（10％）およびハイグロマイシンB（100μg/ ml）およびHVを補ったMEM培地を用いて、90〜95％の集密度まで増殖させ、116細胞とその組織培養ディッシュを確認し、次の継代の手順で使用できます。
  8. 60ミリメートル組織ので、（セルあたり2 TUを適用HVを追加し、3.5ミリリットルの最終体積に先行する通路（ステップ2.6.2）からの溶解物を2.5 mlの新鮮な培地（MEM、5％FBS）の1ミリリットルを混ぜます90〜95％の集密度で培養皿は〜3.2倍10 6細胞を含む、HVの〜6.4xは10 6 TUを追加します）。 （ 図3B）。慎重に116細胞の60ミリメートル皿から培地を除去し、細胞へのウイルスの混合物を追加します。繰り返しステップ2.6） - 2.8）で2回パスの溶解物を得るために、年齢P1とP2。
  9. 80〜100％の密集度での150mm組織培養皿が2倍​​10 7〜含まれているので（P2からの溶解物を2.5 mlの17.5ミリリットルを新鮮な培地（MEM、5％FBS）を混合し、細胞当たり2 TUを適用HVを追加細胞、〜4倍10 HVの7 TU）を追加します。 116細胞を150 mmディッシュから培地を除去し、ウイルス混合物を細胞に感染します。 37℃で感染細胞を培養し、5％CO 2。
  10. ステップ2.6に記載のように48時間感染後の収穫細胞）継代P3（ 図3B）を得ました 。
    1. 繰り返しステップ2.6）1。
    2. 再懸濁細胞からP3リリースウイルス粒子の残りの19.5ミリリットルから3〜4回凍結および解凍することによって。この画分P3の溶解物と呼ばれるよりもあります。
      注：彼らは十分に増幅されるまで、いくつかのベクターは、最終的に150ミリメートル皿に追加の通路が必要な場合があります。したがって、プリ増幅プロセスの有効性は、シリアルパス中に監視する必要がありますエージング。セクション3（また、 図4Aを参照）に記載されているように、増幅プロセスの定量PCRベースの分析を行うことができます。緑色蛍光タンパク質（GFP）のための発現カセットを有するHCAdVの前増幅を容易に蛍光顕微鏡（ 図4B）を使用して GFP flourecscent信号を観察することによって評価することができます。

定量的リアルタイムPCR（定量PCR）を使用して、増幅プロセスのモニタリング3（また、図4Aを参照）。

  1. 2.10）培養細胞からのgDNAの単離または選択した別の方法は、任意の市販のDNA単離キットを使用して - preamplifaction（2.6ステップ）の各路から細胞ペレットからのgDNAを分離します。最適なPCRの結果については、できるだけ新鮮としてのgDNAを使用しています。さもなければのgDNAは、さらに使用するまで-20℃で保存することができます。
  2. qPCR分析により各通路の細胞中に存在HCAdVゲノムの数を決定するには、<10 1を使用して標準曲線を作成/ SUP> - 10 HCAdVゲノムに含まれるGOIを有するプラスミドのコピー9。
  3. HCAdVゲノムに含まれるGOIに特異的なプライマー400 nMのを使用して定量PCRを適用P0- P3（ステップ2.6- 2.10）からのgDNAの同じ量を分析します。それぞれの定量PCR化学物質の定量PCRフォローメーカーの指示を行います。プレインキュベーションを95℃で10分間、20秒間15秒Cと72°C 55〜60°、10秒間95℃の40サイクルで増幅を、以下のように定量PCRプログラムを設定します。標準曲線に基づいて、反応におけるHCAdVゲノムの数を補間することができます。

懸濁物中で増殖している116細胞におけるHCAdVベクターの4大規模増幅

  1. 3リットルのスピナー培養フラスコ（ 図3B）に、10％FBSおよびハイグロマイシンB（100μg/ ml）を補充した予め温め（37℃）新鮮なMEMの900ミリリットルを追加します。
  2. 1と少なくとも10個体の150mm組織培養皿から培地を除去16細胞を、90〜100％の集密度に増殖させ、血清学的ピペットを使用して、FBS（10％）及びハイグロマイシンB（100μg/ ml）を補充した新鮮な予め加温した（37℃）MEMの10mlで細胞をオフ洗い流します。均質な細胞懸濁液を得るためにアップピペット上下に数回。すでに）ステップ4.1から900ミリリットルを含むスピナーフラスコに細胞を直接転送します。
    注：それはマイナスの懸濁細胞の成長に影響を与える可能性があるとして、トリプシン/ EDTAを使用しないでください。培地を除去した後、すぐにスピナーフラスコに細胞を移します。一度に二つ以上の組織培養皿を処理しないでください。長い待ち時間がより困難に新鮮な培地を追加した後に、組織培養皿から細胞をデタッチすることになります。
  3. 37℃で24時間、5％CO 2組織培養インキュベーター中でマグネチックスターラー上で最適な細胞成長インキュベートスピナーフラスコを確保します。ガラス表面への細胞の付着を回避するために、70 rpmのに磁気撹拌機を調整します。
  4. スピナー培養フラスコ中で増殖した細胞が生存しているかどうか、それらが十分な量に成長するかどうかを調べるために、スピナー培養フラスコにおける細胞成長をモニターします。前の60mm組織培養皿にバイオリアクターから新鮮な培地転送を2ミリリットルを追加するたびに。顕微鏡で細胞形態を観察します。
    注：培地中に浮遊凝集塊を形成する細胞の最適な増殖と生存率を（また、 図4Cを参照）を示しています。 24時間後、それらを組織培養皿の表面にコロニーを形成します。 30〜50％コンフルエンスには最適密度を示しています。
  5. 24時間攪拌培養フラスコを設定した後、ハ​​イグロマイシンB（100μg/ ml）を補充した新鮮な培地の500ミリリットル（MEM、10％FBS）を加えます。 24時間後、この手順を繰り返します。
  6. 72時間撹拌培養を設定した後、細胞懸濁液の3リットルの総容量が得られハイグロマイシンB（100μg/ ml）を、新鮮なMEM培地（10％FBS）の千ミリリットルを追加します。
  7. AVに達した後、24時間室温で500×gで10分間の遠心分離により3リットル、収穫116懸濁細胞のolume。上清を捨てます。組織培養フードの下に空にスピナー培養フラスコを保管してください。
  8. 均質な細胞懸濁液を得るためにピペッティングすることによって約8〜10回上下5％FBSを補充した新鮮なMEM中に再懸濁細胞ペレット。媒体の体積は、ステップ2.10）2からの溶解物かどうかに依存します。 1（19.5 mlを、ステップ4.8を参照）。ステップ5.9からオプションa）またはHCAdVの精製されたウイルスストック）2。 （ウイルス力価にdepanding幾つかμlを、ステップ4.8参照）2、オプションB）細胞の感染のために使用されます。 150ミリリットルの全容量を使用してください。
    1. オプション：無菌磁気撹拌棒または250ミリリットル小規模スピナーフラスコとの共感染する細胞を備えた250mlの保存瓶にP3（一次増幅）ステップ4.8からの転送細胞）からの溶解物116懸濁細胞の感染P3（ステップ2.10.2）とセルあたりのHVの2 TUからの溶解物内でのウイルス。 3倍の密度を仮定10 5個の細胞 1ml当たり、総細胞数は、9X 10 8細胞です。したがって、HVの1.8倍10 9 TUを追加します。
    2. オプションB：精製されたウイルス株と116懸濁細胞の感染のために、ステップ4.8からの転送細胞）を滅菌磁気撹拌棒または250ミリリットル小規模スピナーフラスコと100ウイルス粒子との共感染する細胞を備えた250mlの保存瓶に（ステップ5.9から）以前は、精製HCAdV 2のセルあたり。）。精製されたHCAdVのとHVの1.8倍10 9 TU;（ステップ6 260nmでの吸光度により測定）このように物理的な力価に応じ9xの10 10 VPを追加します。
  9. 60 rpmで2時間、CO 2磁気37℃の組織培養インキュベーター中でスターラー及び5％で9月4.8.1細胞からウイルス混合物を攪拌）または4.8.2）です。ストレージボトルは空気の循環を可能にするために、完全に閉じていないことを確認してください。
  10. 2時間の感染後は、3リットルのスピナーカルトに戻し、細胞ウイルス混合物の全体積を転送UREフラスコおよび48時間で、37℃、5％CO 2の組織培養インキュベーター中に2 Lの全体積に対して5％FBSを補充した新鮮な予め加温した（37℃）MEM培地の1850ミリリットルを加え、インキュベート70 RPM。
  11. 500ミリリットル遠心管で室温、890x gで10分間の遠心分離によって細胞を回収。培地を除去し、DPBSの28ミリリットルの全容量でペレット化した細胞を再懸濁。均質な細胞懸濁液を得るために、上下にピペット。懸濁液が完全に凍結されていることを確認し、液体窒素中または-80℃で細胞ウイルス懸濁液をフリーズします。ウイルス精製を開始するまで-80℃で細胞ウイルス懸濁液を保管してください。

5.精製およびHCAdVの透析

  1. 、塩化セシウム（CsClの）グラデーションのウイルス溶解物を準備し、37℃の4倍の水浴中で液体窒素と雪解けのステップ4.11から細胞ウイルス懸濁液）を凍結します。
  2. Rで8分間500×gでウイルス溶解物を遠心TとはHCAdVを含む上清を収集します。
  3. 超遠心がfollows.Weigh 37.5（1.5グラム/ cm 3）とグラム（1.35用のグラム/ cm 3）で、33.5グラム、およびそれぞれのCsCl粉末（1.25グラム/ cm 3のための）31,25 gと塩化セシウム溶液を調製し、埋めるためにdH 2 Oを25ミリリットルで最大。
    1. 解決までStirrは解決策を明確にし、滅菌フィルターになります。最後に、各溶液1mlを削除して、密度が正しい天気を確認するために細かい規模でそれを量ります。 1ミリリットルを、それぞれ1.5グラム、1.35および1.25グラムを重み付けする必要があります。
    2. 密度が高すぎる場合は、無菌のdH 2 Oの小容量（μL）を段階的に添加することによって、それを調整しますdH 2 Oを添加した後、再びdensitiyを測定します。必要に応じて、より多くののdH 2 Oを追加
    3. 密度が正しくなるまでの手順を繰り返します。密度が低すぎると塩化セシウムの粉末を少量添加することにより、それを調整します。滅菌フィルター再度、濃度をチェックしてください。濃度が高すぎるとアドインしてそれを調整しますグラムのdH 2 O前述したように。密度は依然として低すぎる追加MORのCsCl、滅菌フィルターをもう一度、濃度を確認した場合。密度が正しくなるまでの手順を繰り返します。
  4. 6明確な超遠心管に塩化セシウムステップ勾配を準備します。慎重に、ゆっくりと、次の順序を使用して、チューブに塩化セシウム溶液をピペット：1.5の0.5ミリリットルグラム/ cm 3の塩化セシウム溶液を、1.35グラム/ cm 3の塩化セシウム溶液及び1.25の3.5ミリリットルグラム/ cm 3の塩化セシウム溶液（ 図2C）の3ミリリットルを。
  5. 1.25グラム/ cm 3の塩化セシウム層の上にステップ5.2からオーバーレイクリアベクター上清の〜4.5ミリリットル）。遠心空の粒子や細胞からのウイルス粒子を含む別個のHCAdVゲノムに遅い加速と減速で226000 XG（35,000 rpm）で少なくとも2時間、12℃で、スイングアウトローター（SW-41）を使用して、超遠心分離でグラデーションデブリ。
    注：最適な条件の下では、細胞破片FORMESの拡散バンドの上にチューブ。 2白のバンドの下に観察することができます。下のバンドがHCAdV（ 図2Cおよび 5A）に等しいのに対し、上方のバンドは、空の粒子が含まれています。
  6. 慎重に細胞の破片と、空の粒子の層を除去し、滅菌した50 mlのチューブに清浄なピペットチップで各チューブと転写ウイルスから下側のバンドの1 mlの収集。 1.35 24mlの収集ウイルス粒子にグラム/ cm 3の塩化セシウム溶液にまで追加し、慎重に混合します。
  7. スイングアウトローターを使用して、超遠心分離機で12℃で226000 XG（35,000 rpm）でトップと遠心O / N（18〜20時間）に1.35グラム/ cm 3の塩化セシウム-ウイルス液を遠心管を埋める（SW-41 ）遅い加速と減速しています。
  8. 顕著な低域に存在HCAdVを収集します。潜在上のバンドが空の粒子がピペットを用いて、上から上位層を除去含んでいるので、下位バンドUSIを奪う（ 図2C および図5B を参照してください ）ピペットをngの。
  9. 緩衝液交換のために収集したウイルス粒子を透析。
    1. 透析チューブ（MWCO：50,000）のストリップカットオフ長さ約8cmのを、3回の無菌のdH 2 Oでそれを洗います。その後、プラスチック製のクランプで透析チューブの片側を閉じ、1 mlのピ​​ペットを用いてチューブ内に）ステップ5.8から収集したウイルスを転送します。チューブ内の気泡を避け、プラスチック製のクランプ透析閉鎖と反対側にそれを閉じます。
    2. 4°Cwithゆっくり撹拌しながら2時間の透析緩衝液（10mMトリス-HCl（pH7.5）、10％グリセロール、脱イオンH 2 O中の1mMのMgCl 2）1リットルに透析します。透析緩衝液の2リットルを使用してExchange透析緩衝液、ゆっくりと攪拌しながら4℃でO / Nを透析。あるいは、sucrosebuffer（140のNaCl、5mM の Na 2 HPO 4 x2H 2 O、1.5mMのKH 2 PO 4、730 mMのスクロース、pHは7.8）を使用します。
    3. ステップ5.9）2から透析ウイルス粒子を収集します。 1 mlのpを使用してipette。希望小容量（25〜100μl）を、複数のアリコートを調製し、-80℃で精製したウイルスを保管します。

6.光学密度（OD）によって最終HCAdV製剤の物理的な力価を測定します

  1. 溶解緩衝液475μL（10mMのトリス-HCl（pH7.5）、10mMのEDTA（pH8.0）でステップ5.9）2から最終のベクター調製物の25μlを、0.5％SDS））を希釈し、穏やかに20分間振とうRTと最終的には15,000×gで、室温で2分間遠心します。
  2. 260ナノメートル（A260）での吸光度の値は通常低いため、100μlの上清を用いて吸光度を4回測定し、4つの測定値の平均値を算出します。以下の式を用いて1ml当たりのウイルス粒子の数を（VP / ml -1の）計算します。キロバイトでVP / mlの-1 =（A260平均）×（20）×（1.1×10 12）×（36キロバイト/ HCAdVサイズ）。
    注：絶対ウイルス粒子（OD力価）の典型的な収量の結果を図7（a）に示されています。経験は、ODの力価は、ウイルス粒子の数を過大評価することを、示しています。 ODによって測定された絶対ウイルス粒子は、Q-PCRにより測定し感染性ウイルス粒子よりも100倍高い20-することができます。より正確なabsolteおよび感染HCAdV粒子の測定と同様に、Q-PCRによりHV汚染については、セクション7を参照してください。

7. qPCRにより総粒子、HCAdVの感染単位と最終ベクター準備中のHV汚染レベルを測定します。滴定手順のスキームは、図6に示されています

  1. 細胞が翌日に90％コンフルエントに達するように、6または12ウェル組織培養プレートでHEK293細胞を播種します。感染性ウイルス粒子の数（感染力価）を決定するために、1μlのステップ5.9から精製されたウイルスを10μlと第2のウェル）をマルチウェルプレートに1ウェルの細胞に感染する3。
  2. 細胞を回収し、3時間の感染後。培地を除去し、全体をよくカバーするために、トリプシンを追加し、3でインキュベート5分間、7℃、5％CO 2。ピペットを用いて、トリプシンで細胞をオフフラッシュし、室温で3分間890×gで細胞をスピンダウン。
  3. DPBS200μl中ペレット化した細胞を再懸濁し、自由（非感染性）ベクター粒子を除去するために、それらを徹底的に洗ってください。室温で890×gで3分間遠心します。上清を捨て、新鮮なDPBS200μlの細胞ペレットを再懸濁します。
    注意 ：感染力価の正確な決意するためには、治療と十分な洗浄をトリプシンにより細胞表面からすべての非感染性ウイルス粒子を除去することが重要です。
  4. ピペットを用いて、それらの培養培地で細胞をオフに洗浄することにより、トリプシンなし総ウイルス粒子数（感染性粒子と非感染性粒子=物理的な力価）、2つのウェルから収穫非感染HEK293細胞を決定すること。
  5. 室温で890×gで3分間細胞をスピンダウン。培地を捨て、DPBS200μlのペレット化した細胞を再懸濁します。蘇bsequentlyそれぞれ、細胞に直接1μlの精製HCAdV準備の10μlを添加します。 gDNAの単離およびその後のQ-PCRのための同じ条件を確実にするために、背景として非感染細胞を使用してください。
  6. ）ステップ7.3由来HEK293細胞）からのgDNAを単離し、7.5
    1. 3秒間DPBS（ステップ7.3および7.4）200μlに再懸濁した渦細胞は、SDS溶液200μlを添加します。 （10mMのトリス-HCl（pH7.5）、10mMのEDTA（pH8.0）で、0.5％SDS）および20μlのプロテ​​イナーゼK（20 mg / mlで）、および3秒間渦サスペンション。 55℃で12〜16時間インキュベートし、ゆっくりと振ります。その後RNアーゼAを2μl（20ミリグラム/ ml）を加え、37℃で30分間インキュベートします。
    2. 15,000×gで2分間のイソアミルアルコールおよび遠心分離機：クロロホルム：フェノールの350μLを加えます。上清を新しいチューブに移し、一度この手順を繰り返し
    3. 、上清を新しいチューブに移し、酢酸ナトリウム50μlの液（pH 5,3 M）および氷1mlの冷EtOH（99.8％）を追加し、懸濁液を混ぜます。 Centri15,000×gで10分間FUGEサンプルはゲノムDNAをペレット化します。
    4. その後、15,000 X gで、上清を除去し、70％エタノール500μlのを追加し、2分間遠心します。 、上清を除去し、70％エタノールの500μlを添加し、室温で30分間振とうします。その後、15,000×gで2分間遠心します。
    5. 上清と空気乾​​燥DNAペレットを削除します。それは、溶液中のgDNAを得るために困難であるように、長い時間のために乾燥していないDNAペレットを実行してください。 dH 2 Oを120μlのDNAペレットを再懸濁し、振とうしながら37℃で約1時間インキュベートします。 DNA溶液が粘稠表示された場合、37℃で数時間のためにそれを振る、または約1時間55℃でインキュベートします。
  7. HCAdVゲノムに含まれるGOIを有するプラスミドの10 8コピー-感染HCAdV粒子と絶対HCAdV粒子を決定するために、10 1の標準曲線を生成します。
  8. 感染したHEK293 cのgDNAを同量を分析することにより、全粒子および感染性粒子を決定ステップ7.3からells）および7.4）HCAdVゲノムに含まれるGOIに特異的なプライマー400 nMのを使用して定量PCRを適用します。
  9. 20秒、10秒、72℃でプレインキュベーションを95℃で10分間、10秒間95℃の40サイクルで増幅を、55°C以下のようにPCRプログラムを設定します。標準曲線（ステップ7.7）に基づいて、反応中のアデノウイルスゲノムの合計数を補間します。
  10. 次formularを使用して、最終ベクター調製物中のアデノウイルスゲノムの数を計算します。（反応中のgDNAのNGでHCAdV /重量の数）×（μlの感染ディッシュ/体積のウイルスのすべての細胞のDNAのNGで重量） 。
    注：絶対と感染性ウイルス粒子の収量のための典型的な範囲は、1×10 7 -1x10 8ウイルス粒子/μlの周りにあります。ここに示されたよりも10倍高いまたは低い力価は、正常とみなすことができます。より高い力価を改善することになります。絶対HCAdVの気難しいの比率に関してレ感染HCAdV粒子に、経験は絶対HCAdV粒子の約5〜10％が（ 図7A）感染性であることを示しています。
  11. HVと汚染レベルを決定するために、HVのゲノムに存在するアデノウイルス後期遺伝子3（L3）の一部を増幅することによって定量PCRを行います。標準曲線（ステップ7.7）を生成するために、アデノウイルス後期遺伝子3（L3）を有するプラスミドを使用してください。
  12. この反応では、プライマーL3の400 nMのフォワード5'-AGA AGC TTA GCA TCC GTT ACT CGA GTT GG-3 'およびL3逆5'-ATA AGC TTG CAT GTT GGT ATG CAG GAT GG-3'一緒に300 nMのとを適用L3特異的プローブ5'-FAM-CCA CCC GTG TGT ACC TGG TGG ACA-TAMRA-3 'の。
  13. 10分間95℃でプレインキュベーション/活性化を、1分15秒、60°C、95°Cの40サイクルの間増幅を次のようにPCRプログラムを設定します。定量PCR反応のために任意のユニバーサルプローブのPCRマスターミックスを使用してください。標準曲線（ステップ7.7）に基づいて、中の数を計算します最終ベクター調製物中のfectious HV粒子。 HV粒子のための典型的な収量のために（ 図7A）を参照してください。
  14. 最後に、ベクター調製物の品質を評価するためにHV汚染レベルにHCAdVの絶対的な感染性粒子の割合を算出します。
    注：これまで、残りのHVの小さな部分を除外することはできません。通常HV汚染の割合が許容される感染粒子以下の〜5％、（ 図7B）です 。もちろん、可能な限り少ないHVなどのベクター調製物は、動物実験のために使用されようとしている場合は特に、望ましいです。

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結果

ここでHCAdV製剤のクローニング、増幅および精製のための代表的な例が示されています。酵素制限消化によってクローニング戦略（ 図1）とHCAdVゲノムのクローニングおよび放出のための代表的な例の概要は（ 図2）が設けられています。ダイジェスト私PI-SCE IとI-CEUによってpHM5からGOI-発現カセットおよびそれに続くフェノール-クロロホルム抽出およびエタノール沈殿のリリース後の典型的な制限パターン（ 図2A）に示されている（参照も1.2〜1.5ステップ）。典型的にpHM5プラスミドバックボーンとGOIの発現カセットに対応する第2のバンドに対応する約3 kbのバンドを観察することができます。 GOI発現カセットを含むバンドは、次いで、アガロースゲルから精製されます。精製されたGOI発現カセットを一緒に精製され、脱リン酸化pAdVFTCでアガロースゲル上で分析され、Wこと正確なサイズを確認するために、その後のライゲーション（

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ディスカッション

ここで紹介するプロトコルは、以前に記載された手順4,12に基づいて、ヒトアデノウイルス5型に基づくHCAdVベクターの精製を可能にします。 pAdFTCプラスミド内HCAdVゲノムは、すべてのアデノウイルス遺伝子を欠いているだけ5'-および3'-のITRおよびパッケージングシグナルを運びます。この戦略では、HV AdNG163R-2 4は、 トランスで 、効率的なウイルス産生に必要なすべての遺伝子を提供します。またはアデノ随伴ウイルス（AAV）ベースのベクター - これは明らかに第一および第二世代のADVSまたは広く使用されているレンチウイルス（LV）をoutcompetes最大35キロバイトの包装容量を提供しています。特にin vivoでのアプリケーションのためのHCAdVの第2の利点は、第一世代や第二世代のADVSとは対照的に、彼らは、細胞毒性のレベルが低下し、ウイルスタンパク質5-8の発現によって引き起こされる免疫原性の副作用が表示されているという事実です。

...

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開示事項

著者は、彼らが競合する金融利害関係を有していないことを宣言します。

謝辞

この作業は、DFG助成金EH 192/5-1 (A.E.)、EU(E-rare-2)プロジェクトTransposmart(A.E.)、UWH Forschungsförderung (E.S. and W.Z.)、およびUniversity Witten/Herdecke(P.B.)の博士課程プログラムによって支援されました。J.L.はChinese Scholarship councilの奨学金によって、T.B.とM.G.はElse Kröner-Fresenius foundation（EKFS）によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
I-CeuINew England BiolabsR0699Srestriction digest
PI-SceINew England BiolabsR0696Srestriction digest
T4 LigaseNew Engand BiolabsM0202Sligation
SwaINew England BiolabsR0604Srestriction digest
NotINew England BiolabsR0189Srestriction digest
子牛腸アルカリホスファターゼ(CIP)ニューイングランドバイオラボM0290S消化プラスミドの脱リン酸化
ハイグロマイシンBPANバイオテクノロジーP02-015116細胞を発現するCREの選択
DMEMPANバイオテクノロジーP04-03590   Hek293T細胞培養培地
Minimal Essential Medium (MEM) EaglePAN BiotechP04-08500116細胞培養培地  
ダルベッコ細胞のリン酸塩緩衝液(DPBS)PAN BiotechP04-36500の洗浄、細胞の再懸濁
250ml貯蔵ボトルシグマCLS430281-24EA懸濁液で成長した116細胞の感染
500mlPP遠心分離管シグマCLS431123-36EA懸濁液培養スピ
ナーフラスコBellco1965-61030116細胞の成長サスペンション
ウルトラクリア 超遠心チューブベックマン・コールター344059密度勾配遠心分離機
超遠心分離機ベックマン・コールター密度勾配遠心分離機
SW-41ローターベックマン・コールター密度勾配遠心分離機
スペクトラムラボラトリーズ スペクトラムラボラトリーズ スペクタプレン メンブレンVWR132129透析チューブ
すぐに使える透析カセット Thermo66383透析
1 ショット DH10B エレクトロコンピテント E. coliinvitrogenC4040-52ライゲーション反応の形質転換
PureYield プラスミド Midiprep SystemPromegaA2495midiprep
peqGOLD Tissue DNA Mini Kit Peqlab12-3396-02Isolation of genomic DNA
SuperFect Transfection ReagentQiagen301305transfection of 116 cells
opti MEM (10% FBS)Gibco31985-062transfection of 116 cells
iQ SYBR Green SupermixBioRad 170-8882q-PCR
CFX 96 C1000 タッチ バイオラッドqPCR 装置
フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール カールロスA156.1DNAの精製
セシウムカールロス8627.1密度勾配遠心分離
酸ナトリウム99%カールロス6773.2DNA沈殿
LB培地 カール・ロスX968.3細菌増殖培地
エタノール  純度99.8%・ロス9065.5 DNAの沈殿と洗浄
SDS 99.5%カール・ロス2326.2溶解  バッファー
EDTAカール・ロス8043.2溶解  バッファー
Tris-HCl 99%カール・ロス9090.3透析バッファー/溶解  バッファー
グリセロール 99.5%カール・ロス3783.1透析バッファー
MgCl2 98.5%カール・ロスKK36.2透析バッファー
NaClカール・ロス3957.1オプションの透析バッファー
KH2PO4カール・ロス3904.2オプションの透析バッファー
スクロースカール・ロス9286.1オプションの透析バッファー
Na2HPO4x2H2Oカール・ロス4984.2オプションの透析バッファー
1.5 ml チューブSARSTEDT72,730,005-80 °C でのウイルス調製物の保存;ハ
細胞液塩化酢カール

参考文献

  1. Benihoud, K., Yeh, P., Perricaudet, M. Adenovirus vectors for gene delivery. Curr Opin Biotechnol. 10 (5), 440-447 (1999).
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