電気生理学的運動単位数の推定（MUNE）マウス後肢の筋肉に複合筋活動電位（CMAP）の測定

サマリー

我々は、マウスにおけるモータユニット機能の生体モニタリングに許可する洗練されたプロトコルを提示します。技術は、坐骨神経によって神経支配マウスの後肢筋の複合筋活動電位（CMAP）とモータユニット番号推定（MUNE）を測定することが記載されています。

要約

複合筋活動電位(CMAP)と運動単位数推定(MUNE)は、in vivoで運動単位プールの機能状態を監視するために使用できる電気生理学的手法です。これらの測定は、神経筋系の正常な発達と変性についての洞察を提供することができます。これらの測定は、診断的および臨床的なヒト研究に日常的に適用されているため、明確な翻訳の可能性を秘めています。私たちは、マウスの坐骨神経機能の記録を可能にするために、ヒトで採用されているのと同様の電気生理学的技術を提示します。CMAP応答は、末梢神経の超最大刺激後の筋肉または筋肉群からの電気生理学的出力を表します。MUNEは、CMAP応答の変更に基づく電気生理学的手法です。MUNEは、テスト対象の筋肉または筋肉のグループに供給する運動ニューロンまたは軸索(運動制御入力)の推定数を表す計算値です。マウスの坐骨神経刺激後の表面記録電極を用いて、近位下肢筋からのCMAP応答を記録する方法を提示する。インクリメンタルMUNE手法は、最大以下の刺激を使用して、平均単一運動単位電位(SMUP)サイズを決定するために説明されています。MUNE は、CMAP 振幅 (ピークツーピーク) を SMUP 振幅 (ピークツーピーク) で割ることによって計算されます。これらの電気生理学的手法により、新生児マウスと成体マウスの両方で繰り返し測定が可能になり、迅速な分析とデータ収集が容易になり、実験試験に必要な動物の数を減らすことができます。さらに、これらの測定値は人間の研究で記録されたものと類似しており、より直接的な比較が可能です。

概要

運動単位数推定法（MUNE）はもともとマコーマスらによって記載されました。 30年以上にわたり前に^1。オリジナルの技術は最大下の増分を取得するために、刺激の漸増を用いる複合筋活動電位（CMAP）記録技術の改変でした。これらの増分は加算され、単一のモータ部電位（SMUP）の推定サイズを決定するために平均化しました。このサイズは、モータユニットの数は、試験される筋肉を神経支配推定するCMAP応答に分けました。元の説明に続いて、電気生理学的応答および増分力（機械的）測定の両方を使用して多数のバリエーションがヒトの研究および動物モデル²の両方で使用されてきました。 MUNE技術は、筋萎縮性側索硬化症^{（ALS）、3,4}のマウスモデルを研究するためにShefnerらによって修正されました。

現在の説明では、我々詳細simplif実行するために迅速でMUNE技術のIED修正。重要なことは、CMAPとMUNEは、新生児および成体マウス^5-8の両方で信頼性の高い対策を可能にします。経験豊富な動物あたり10〜20分でこれらの施策を実行することができ、かつ反復測定は、長手方向の^データ 5の取得を可能にする実現可能です。現在の研究では、我々は、臨床electrodiagnosticシステムを採用しています。我々の経験では、臨床electrodiagnosticシステムは、生体内での電気生理学的データの迅速かつ効率的な捕獲のために最適化され、それにもかかわらず、標準的な電気生理学リグを簡単に、このアプリケーションに適合させることができます。

プロトコル

このプロトコルは、によって承認され、オハイオ州立大学Wexner医療センターの動物のケアと倫理ガイドラインに準拠しました。

1.動物の準備と麻酔

1. マウスの処理中に手袋を着用してください。
2. 腹臥位での吸入イソフルランと場所でマウスを麻酔。 3〜5％のイソフルランと分O _2流量あたり1 Lを使用して麻酔を誘導します。麻酔の導入に続いて、2〜3％で麻酔分、O _2流量あたり1 Lを維持します。
   1. 動物の疾患状態、年齢、および呼吸速度に応じて適切な麻酔のための_O 2流量およびイソフルランの割合を調整します。より小さいまたはより弱い動物は十分な麻酔（ すなわち 1.5〜2.5％イソフルラン）にはあまりイソフルランが必要な場合があります。
   2. このような離脱応答の欠如を示すために、鉗子などのオブジェクトの光後肢足蹠の圧力を適用することにより、十分な麻酔を確認してください。;
3. CMAPの大きさと持続時間に影響を与えることができ、温度の変化として恒温温暖化プレートで37℃の表面温度での温度を維持します。
4. 乾燥を防ぐために、目に獣医石油系軟膏を適用します。麻酔観察呼吸速度のレベルを監視し、鉗子を経由して足のパッドに印加された圧力以下の撤退応答について評価します。
5. バリカンを用いて検討する後肢から髪を削除します。後肢（複数）を研究することから毛を除去した後、軽く、膝で後肢を拡張腰に外転と、（ 図1に示されるように）粘着テープを使用して作業面に貼り付けます。
6. それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまでCMAPとMUNEレコーディングや麻酔の中止後、無人の動物を放置しないでください。完全に回復するまで、他の動物の会社に動物を返しません。

2. Recordingセットアップと機器

1. 図1の写真のようにCMAPとMUNE録音するための電極を配置します。
2. 記録電極のための2つの微細なリング電極を使用してください。
   1. 膝関節で後肢の腓腹筋の近位部を覆う皮膚上に活性（E1）リング電極と、足の半ば中足骨部分上の皮膚上の基準（E2）リング電極を配置します。
   2. インピーダンスを低減するために、コートゲルとリング電極の下にある皮膚が十分に残存髪を飽和させ、電極 - 皮膚接触を最大にします。これは、電極間の電気的ブリッジを引き起こす可能性があり、正確な記録を防ぐことができるように、電極ゲルの過剰な適用を避けてください。
3. 近位の後肢での坐骨神経の刺激のために、使用する2つの陰極と陽極と28 G単極針を絶縁しました。近位後肢の領域にカソードを挿入して、あのを挿入ドは、より近位に皮下組織に仙骨の上に重なります。
   1. 坐骨神経に過度に近いか、それが直接損傷坐骨神経または他の構造。 図1は、電極の配置を示しているであろうと、あまりにも深く刺激電極を挿入することは避けてください。
4. 接地電極の場合は、反対側の後肢や尾部に使い捨ての表面電極を配置します。

3.データ集録

1. 坐骨CMAP
   1. 方形波0.1ミリ秒の持続時間のパルスとミリアンペア1-10の範囲の強度で坐骨神経を刺激することによって坐骨CMAP応答を取得します。
   2. もはやが増加応答の振幅まで刺激強度の増加に伴ってCMAP応答を取得します。その後、超最大刺激を確保するために、最大の応答を得るために利用される刺激強度の〜120％の刺激を増大させ、追加の応答を得ます。何の更なる増加iが存在しない場合nはCMAPのサイズは、最大のCMAPとして、この応答を記録します。
   3. レコードのベースライン・ツー・ピークmV単位とピーク・ツー・ピークCMAP振幅（ 図2）。
2. 普通の単一運動単位電位（SMUP）サイズとMUNEの計算
   1. インクリメンタル刺激技術¹と平均単モータ部電位（SMUP）サイズを決定します。最小の全か無か応答を得るために、0.03 mAのステップで強度を増加させながら増分応答を得るために、1ヘルツの周波数で0.1ミリ秒の持続時間の最大下刺激を送達します。 0.21ミリアンペアと0.70ミリアンペアの間の刺激強度との最初の応答を取得します。
      1. 初期応答は0.21ミリアンペアと0.70ミリアンペアの間の刺激強度では発生していない場合は、どちらか近いか遠くにそれぞれ、必要な刺激強度を減少または増加させるために、近位大腿部における坐骨神経の位置から刺激陰極位置を調整します。
      2. 最初の私の場合ncremental応答は0.21ミリアンペアと0.70ミリアンペアの間の刺激強度を得て、（3.2.2）以下に記載する基準を満たす、ストアとその9追加の増分の合計を得るために、0.03ミリアンペアの手順により調整増加刺激強度と追加増分を記録しています確立された基準を満たしています。
   2. インクリメンタル応答の測定中、各増分は、次の基準を満たしていることを確認してください。
      1. インクリメンタル応答の最初の負のピークは、 図2の CMAPイラストの網掛け部分として示す最大CMAP応答の負のピーク内に一時的に整合していることを確認します。
      2. 各増分応答が安定して分別することなくなっていることを確認し、3重複応答を観察することによって確立しました。 （以前に記録刻みに重畳）をリアルタイムで視覚的に増分応答を区別する。
         注：各増分は視覚的に区別すべきです前の応答（ 図3）と比較し、大きいです。リアルタイムでの解析は、従来の反応と比較して大きな振幅（増分）応答の認識を可能にし、バックグラウンドノイズに起因する小さな変化を無視することができます。 10単位の重畳表示はこの点をさらに説明するために、図4（B及びD）に示されています。
      3. 視覚的に各増分を確認した後、測定された振幅差（前の応答の確認応答振幅=振幅差）が少なくとも25μVであることを確認してください。
      4. 増分が25未満μVの場合、破棄し、応答を再測定します。 10インクリメンタル応答を記録した後、それぞれの個々の増分応答の振幅はすべて10インクリメント（最終応答の全振幅IE）の和の1/3以下であることを確認するために増分を評価します。この条件が満たされない場合、増分の応答を再測定します。
   3. 平均単モータ部電位（SMUP）振幅（ 図3）の推定値を与えるために10の増分の値の平均。注： 図3は、平均 SMUP計算の基礎を詳述するが、平均SMUP振幅は、単に増分の総数（ すなわち、10）による最終増分応答の全体の振幅を除して算出することができます。
      （ 図3に示す ）の例個々のSMUPの計算：
      増分1のSMUP 1 =ピーク・ツー・ピーク振幅
      SMUP 1 = 0.050 mVで
      SMUP 2 =（増分2のピーク・ツー・ピーク振幅） - （増分のピーク・ツー・ピーク振幅1）
      SMUP 2 = 0.150 mVの-0.050 mVの= 0.100 mVの
      1. （10の合計まで）後続の各増分を計算し、10単位の平均を作ります。
   4. 平均SMUP振幅により最高CMAP振幅（ピーク・ツー・ピーク）を分周してMUNEを計算する（ピークツーピーク）。 （MUNE = CMAP /平均SMUP）。 CMAPは、典型的には、mVのに設けられているのに対し、いくつかの電気システムでは、SMUP単位はμVで測定されます。必要な場合には、MUNE計算の前に同様のユニットにCMAPとSMUP結果を変換します。

結果

CMAPとMUNEの技術は、低侵襲性の電極配置（ 図1）を利用し 、坐骨神経支配後肢の筋肉の神経筋機能の記録を可能にする、このレポートに記載しました。筋肉群からの全出力を表しCMAP超最大サイズは、振幅および面積のパラメータを用いて記述することができる（ 図2）しかしながら、現在の方法では、CMAPとSMUP大きさを定量化するために振幅を使用します。 CMAPの対応策は、筋肉内筋線維の脱分極を合計されるので、任意の場所に筋繊維に運動ニューロンからの病理はCMAPの大きさの減少をもたらすことができます。したがって、CMAPは、全機能状態の優れた尺度を与えます。予想されるように、CMAPのサイズは、開発⁵の間に増加します。除神経（ すなわち担保発芽）以下の発生する可能性があります代償変化に、CMAPのサイズは、モータneurのプロセスにもかかわらず維持することができます上またはモーター軸索の損失。したがって、MUNEの技術は、試験されている筋肉の筋肉またはグループに運動ニューロンまたは軸索の入力を決定するために必要とされます。個々のインクリメント（ 図3）の記録は、単一運動単位（SMUPサイズ）の平均出力の推定はモータユニットの機能状態に関する詳細な情報を与えることができます。

CMAPとMUNEは神経筋疾患の種々のマウスモデルにおける神経筋機能を測定するために利用することができます。 図4では 、成人の対照マウスと坐骨神経挫滅以下の成体マウス11週間における知見が対比されます。坐骨神経挫滅後、MUNEを厳しくコントロールマウスでは278の機能モーターユニットの通常の調査結果と比較して50推定機能運動単位で削減されます。これとは対照的に、砕いた動物（39.6 mVのベースライン・ツー・ピーク、74.9 mVのピーク・ツー・ピーク）でCMAP振幅は、対照と比較して軽度の減少を示す（49.0 mVのベースラインから- ピーク、84.2 mVのピーク・ツー・ピーク）による担保発芽します。

図1.電極の配置。黒（E1） "アクティブ"電極（A）と赤（E2）「参照」記録電極（B）は膝で腓腹筋の近位部に腓腹筋の上に配置されています。陰極刺激（黒）、（C）及び陽極（赤）、（D）は 、遠位の応答を生成するために、記録電極を皮下に近接して挿入されています。使い捨てディスク電極（D）はアーティファクトを最小限にするためにグランドとして後肢、尾や仙骨の上に置かれている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2.複合筋活動電位は画像が代表CMAP応答を示す図である。（A）は、ベースライン・ツー・ピーク振幅は（負の電圧がベースラインの上に描かれている）最初の負のピークに等電ベースラインから測定されます。（ B）は、ピーク・ツー・ピーク振幅は、正のピーク電圧と負のピーク電圧から測定されます。グレー網掛け部分は、負のピーク面積を示す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3インクリメンタル回答。2つの代表的な増分応答が重畳し、イゾラに示されていまする。各増分のMUNE算出振幅のピークツーピークを測定します。増分＃1は全か無か応答を記録しない初期であり、単一のモータ部電位（SMUP）を表します。その後の各増分（＃2-10）は、前の応答に重畳された量子の増加を表します。したがって刻み2-10用SMUP振幅を得るために、前の応答の振幅が得られる増分の振幅から減算される。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4の例坐骨CMAPとMUNE。（A）、成人における坐骨複合筋活動電位（CMAP）（生後6ヶ月）ベースライン・ツー・ピーク49.0 mVでの振幅値とピーク・ツーと対照マウス84.2 mVでのピーク振幅。画面の感度=部門につき10 mVの、画面の持続時間10ミリ秒。（B）（対照マウス）に対応する10増分応答3.028 mVでの全振幅と平均SMUPサイズ（0.3028 MV）を決定するために10で除しています。画面の感度= 0.5 mVの除算あたり1ミリ秒の掃引速度。計算MUNE = 278（MUNE = CMAP /平均SMUP（84.2 MV / 0.3028 MV））（C）坐骨CMAP軽度減少したベースライン・ツー・ピーク振幅を示す成体マウスにおける坐骨神経挫滅（生後6ヶ月）以下の11週間（ 39.6 MV）とピーク・ツー・ピーク振幅（74.9 mVで）。画面の感度=部門と部門ごとに1ミリ秒の掃引速度あたり10 mVの。（D）テン10で割っ14.923 mVでの総ピーク・ツー・ピーク振幅（神経挫滅とマウスで）増分応答を対応する平均SMUPを取得します1.4923 mVでのサイズ。部門ごとに= 2 mVの画面の感度および部門ごとに1ミリ秒の掃引速度。計算MUNE = 50（MUNE = CMAP/平均SMUP（74.9 MV / 1.4923 MV））。 （**坐骨クラッシュマウスの増分応答に対する異なる感度に注意してください）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ディスカッション

MUNEとCMAPは頻繁に調査研究で、そのようなALSおよび脊髄性筋萎縮症^{（SMA）9、10}のような神経筋疾患の患者を監視するのに利用し、臨床的に関連する尺度である。例えば、SMAで、CMAPとMUNEは、年齢、重症度および臨床とよく相関します機能^10-14の措置。どちらの対策は、低侵襲性であり、同じ個体において縦方向に機能の評価を可能にします。重要なことは、これらの措置は、皮質運動ニューロンによる活性化やモータユニットの動員を測定することはできませんが、彼らは運動ニューロンの完全性とその機能的対応、モータユニットの臨床的に関連する評価を提供します。

神経筋疾患の動物モデルは、ヒト疾患の発症機構の理解に、潜在的に有効な治療薬の前臨床開発に重要です。アウトカム指標とすることができるバイオマーカーを変換する機能容易にし、ヒトの臨床試験への有望な前臨床所見の翻訳を早めることができ、種を超えて利用しました。いくつかのグループは、以前にマウスモデル^2-4、15-22モータユニット関数を推定するために電気力（機械的）測定の両方を利用しています。ための措置の相対的な複雑さのために、我々は、マウスにおけるより広範な使用と実装を可能にするために視覚的な形式で、これらの技術に磨きをかけてきました。ビデオデモおよび命令のフォーマットは、手順の重要なステップを強調表示すると潜在的な落とし穴に対処することができます。運動ニューロン疾患の潜在的な治療法の前臨床試験に、これらの技術の適用は、ヒト疾患のマウスからの推定上の治療の翻訳を改善することができます。

CMAPとMUNE応答を取得する過程でいくつかの重要なステップがあります。適切かつ一貫性のある記録電極の配置や後肢との十分な電極接触肢は、振幅の再現可能な測定のために重要であり、バックグラウンドノイズを減少させます。したがって、後肢の皮膚と電極との間の密接な接触は、一貫して確認する必要があります。我々は、表面電極は針電極より一貫性のCMAPとMUNEレコーディングを提供することを見出しました。これにより、非常に薄い皮下組織に、針の記録面の小さな動きは、CMAPの振幅の大きな変動につながる可能性があります。また、針電極のより侵襲的な性質は、新生仔マウスまたは潜在的な筋肉の破壊および損傷に起因する長期的な研究には最適ではありません。特定の筋肉が他と比べてより多くのまたはより少ない関与し、これは、ALSマウスモデル²¹で報告されている場合に、非選択的、表面電極記録の一つの潜在的な欠点は、減少表現型分解能の可能性に関する。

平均SMUPサイズを取得することはCMAPに比べて技術的に困難です。小さいRESPONSのためにバックグラウンドノイズ（μVなくmVの範囲内の）Eの大きさは、より問題となり得ます。バックグラウンドノイズは、接地電極、陰極、陽極を調整し、実験の近傍に他の電気機器をチェックすることによって低減することができます。典型的には、細胞内の電気生理学的用途に使用されるフ​​ァラデーケージは、必要とされません。個々SMUP応答の視覚決意を取得するための最も困難なスキルであり、十分な再現性と一貫性のある結果のための練習が必要です。これは、記録されているSMUPsが最大CMAP応答の時間内に開始することを確認することが重要です。我々は実行すると、細胞内および評価者間信頼性を向上させるために、このプロセスはより簡単にするために、個々の増分応答の受け入れのための基準を定義しています。

インクリメンタルMUNE技術の一つの潜在的な欠点が原因モトの交互に機能的な運動単位の数を過大評価する可能性を含みますR単位。我々はShefner らと同様の手法を用いてきました。その中で各応答が再現可能に、この現象³の影響を軽減するために3回の合計を見られるべきです。

我々の経験では、臨床electrodiagnosticシステムが原因でコントロールのしやすさを可能にする改良された審査官-electrodiagnosticシステムインタフェース人間工学に、本明細書に記載された研究用に最適化されています。私たちの研究室で利用さ2チャンネルシステムは、デジタル変換器24ビットのアナログとアンプとチャンネルあたり48 kHzでのサンプリングレートを使用して、2つの非スイッチアンプチャンネルが装備されています。ハードウェアゲインは10nVから100 MV /分割に調整することができます。低域フィルタは、0.2ヘルツ、5 kHzの範囲であり、高周波フィルタの設定は、30ヘルツ、10 kHzの範囲です。定電流刺激装置は（：、：0.02〜1ミリ秒の持続時間0-100 mAの強度）が使用されます。ほとんどの臨床システムは、同様の適切な特徴を有しており、十分にCMAPとMUNE応答を記録するために調整することができます。 Additionally、標準電気生理学リグを十分にCMAPとMUNEを記録するために組み立てることができますが、インタフェースは、刺激調整とCMAPとSMUP応答の迅速な同定を容易にするために調整する必要があります。

我々は以前CMAPの技術を利用しているとMUNEは成人⁵に出生後早期の期間中に、マウスにおける後肢の坐骨神経支配筋の迅速かつ再現性の評価を可能にするために、ここで説明します。運動機能のための行動試験は現実的ではありませんか信頼性が低いときに、これらの技術は、マウスモデルにおいて評価を可能にします。新生マウスに、この技術の適用は、モータユニットの開発の研究を促進し、運動ニューロンの神経支配と剪定の我々の理解を拡大する可能性を秘めています。例えば、我々はMUNEで記録機能モーターユニットの数は、最初の2週間の間にpolyneuronalからmononeuronal神経支配に剪定時に増加することが示されています新生児マウス⁵での生活の秒。この技術を用いて長時間にわたってマウスをテストする能力は、末梢神経損傷、遺伝性神経筋障害および老化にモータユニットの応答の研究に役立ちます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
プロトリマー ペットグルーミングキット	オスター	078577-010-003	脱毛用バリカン
シナジー T2 EMGシステム	Natus Neurology	モデルはもう利用できません	ポータブル電気診断システム
モノポーラ針 28 G	Teca	017K121	陰極と陽極刺激電極
アルパインバイオメッド デジタルリング電極、ツイストワイヤーと1.5mm TPコネクタ付き。	Alpine Biomed	9013S0312	録音電極
鉄ベース付き Helping Hands ワニ口クリップ	Radio Shack	64-079	録音電極の配置の維持
Spectra 360 電極ゲル	パーカーラボラトリーズ	9013G5012	、皮膚インピーダンスモノ
ジェクト湾曲先端灌漑シリンジ	Covidien	81412012	アプリケーションのために利用される
		。	モノポーラ電極を電気診断刺激装置に接続するには
使い捨て2 "x 2"電極または必要に応じてトリミングされた同様の電極	Carefusion	019-415000	接地電極
RTDセンサーを内蔵した小型ヒーティングプレート、15 x 10 cm	World Precision Instruments	61830	ウォーミングプレートは、動物温度コントローラーと一緒に使用され、動物に熱を伝達します
ATC2000 World Precision Instruments	で使用するためのシリコンパッド	503573	導電性の取り外し可能なパッドで、清掃が簡単なウォーミングプレート
動物温度コントローラー	World Precision Instruments	ATC2000	動物の体温を維持するための低騒音動物暖房システム
医師の石油ベースの眼科用軟膏	Puralube	26870	、角膜の損傷を避けるために麻酔中に適用されます