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方法論記事

リン酸化ペプチドの強化充実のためのマクロポーラスポリマーモノリスの高度に多孔性配位高分子コーティングの製造

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DOI：

10.3791/52926

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2015年7月14日

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1The Molecular Foundry, E. O. Lawrence Berkeley National Laboratory, 2Institute of Chemical Sciences, Bahauddin Zakariya University, 3Department of Chemistry, University of the Balearic Islands, 4Beijing Key Lab of Bioprocess, College of Life Science and Technology, Beijing University of Chemical Technology

この記事について

サマリー

高表面積の微多孔性配位ポリマーによって内部にコーティングされたマクロ多孔性ポリマーモノリスで構成される多孔質ハイブリッド分離媒体の調製手順が提示されます。

要約

私たちは、マクロ多孔質ポリマーモノリスの内面に高多孔性配位ポリマーコーティングを基にしたハイブリッド材料を調製するためのプロトコルを記述します。開発されたアプローチは、カルボン酸官能基を含むマクロ多孔質ポリマーの調製と、それに続くポリマーモノリスの細孔の表面上の多孔性配位ポリマーの層の段階的な溶液ベースの制御成長に基づいています。調製された金属-有機ポリマーハイブリッドは、高い比微孔表面積を有する。鉄(III)部位の量は、機能性高分子支持体の細孔表面の金属有機配位によって増強されます。金属サイトの増加は、コーティングプロセスの反復回数に関連しています。

開発された調製スキームは、キャピラリーカラムのフォーマットに簡単に適合させることができます。機能性多孔質ポリマーは、キャピラリー内の自己完結型の単一ブロック多孔質モノリスとして調製され、優れた流動透過性と適度な背圧を備えたフロースルー分離デバイスが得られます。金属-有機ポリマーハイブリッドカラムは、消化されたタンパク質からのリン酸化ペプチドの濃縮と、その後のマトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析法による検出において優れた性能を示しました。提示された実験プロトコルは非常に汎用性が高く、多孔質配位ポリマーおよび複数の精製および/または分離アプリケーションのための金属有機フレームワークを多数使用して、さまざまな有機ポリマー支持体およびコーティングに容易に実装できます。

概要

多孔性配位高分子（のPCP）は、非晶質または結晶質であってもよい1-3 1、2または3次元に延びる調整エンティティを繰り返し、有機リガンドにより結合された金属中心に基づいて、配位化合物です。近年では、多孔性材料のこのクラスは、それらの高い多孔性、広い化学調整可能性、及びその安定性に広く注目を集めています。のPCPは、ガス貯蔵、ガス分離、および触媒3-6を含むアプリケーションの範囲について検討されており、非常に最近のPCPの最初の分析アプリケーションは、7に記載されています。

そのため、その強化された化学官能性と高気孔率のPCPの精製プロセスおよびクロマトグラフィー分離の改善のための巨大な潜在的な対象のされており、このトピックに関するレポートの数は7-13を公開されています。しかし、のPCPの性能はequivaleで、現在ではありませんそれらの粒子または結晶のそれらの一般的に不規則な形状の形態に起因するこれらの固体の充填床に大きな粒子間の空隙を介して高速拡散する可能性が高い既存のクロマトグラフィー材料とNTレベル。この不規則に分布パッキンが予想より低い性能だけでなく、高いカラム背圧、望ましくないピーク形状形態14,15につながります。

粒子間の空隙を介して高速拡散の問題を解決し、同時に分析アプリケーションのためのPCPの性能を高めるために、マクロ細孔の表面にPCPを含んでいるマクロ多孔性ポリマーモノリス16に基づいて、ハイブリッド材料の開発希望ことが望ましいこと。ポリマーモノリスは、それらパッキンをビーズに最も効率的な代替手段の一つであり、正常にいくつかのCによって商品化されていることができており、その孔を通して対流を維持することができる自己完結型、シングルピースの材料であります ompanies 17,18。多孔質ポリマーモノリスは、通常、モノマーの重合と、典型的には、有機溶媒の二成分混合物であるポロゲンの存在下で架橋剤に基づいています。得られたモノリス材料はmicroglobular構造と高気孔率と流れ透過性を有します。

PCPを含むポリマーモノリスを調製するために、これらの材料を統一するための単純なアプローチは、モノリスの重合混合物のような合成のPCPの直接添加に基づいています。このアプローチは、主にポリマー骨格内に埋め込 ​​まのPCPをもたらし、最終的な材料14,15のさらなる適用のためにアクティブではありません。別の合成アプローチは、明らかに、例えば、結晶中に含まれる気孔の大部分は、ポリマーモノリスのマクロ孔からアクセス可能であるのPCP、または結晶質の金属有機構造体（MOF）の均一な膜を開発するために必要とされます。

tは ">ここで、我々は簡単に自己完結型の単として実装することができるのPCPの取り付けに適した官能基を有するマクロ多孔性ポリマー支持体に基づく有機金属ポリマーハイブリッド材料（MOPH）の調製のための簡単​​なプロトコルを報告しますフロースルーのアプリケーションに最適な特性を有する列形式で-pieceポリマーモノリス。ポリマー合成手順は、単純な室温の溶液系が続きます モノリス19-20の孔の内面にPCPコーティングを成長させる方法。第1の例として、我々は、マクロ孔質ポリ（スチレン - ジビニルベンゼン - メタクリル酸）モノリス内の鉄（III）benzenetricarboxylate（FeBTC）配位ポリマーフィルムの調製を記載します。この方法は、バルク粉末の調製並びにキャピラリカラムのために効果的であると記載されているプロトコルは、他のPCPに容易に実装可能です。フローthrouのための機能性材料としてMOPHsの電位の例として、GHアプリケーションでは、我々は、Fe（III）の緻密なコーティングは、Fe（III）へのリン酸化の結合親和性を利用する消化されたタンパク質の混合物からリン酸化ペプチドを豊かにする中心含まれている開発FeBTC MOPHを適用しました。開発されたプロトコル21は、3つの主要部分を含む：マクロポーラス有機ポリマーモノリス担体の調製;モノリスの細孔の表面にPCPコーティングの成長;ホスホペプチドの濃縮のためのアプリケーションです。

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プロトコル

注：開始する前に、関連するすべての材料データシート（MSDSを）を確認します。合成およびアプリケーションの手順で使用される化学物質のいくつかは有毒です。すべての適切な安全対策に従って、適切な保護具（白衣、フルレングスのパンツ、閉じたつま先の靴、安全眼鏡、手袋）を使用してください。窒素吸着測定のために液体窒素（絶縁手袋、フェースシールド）を取り扱う際は、すべての極低温個人用保護具を使用してください。

バルクとキャピラリカラム形式で1多孔質ポリマーモノリスの準備

  1. 特性評価のためのバルクポリマーモノリス
    1. 重合抑制剤を除去するために、塩基性アルミナのカラムに通し、スチレン、ジビニルベンゼン、メタクリル酸を精製します。シリンジチップに詰めたガラスウール繊維のプラグ付きの25ミリリットル使い捨てのプラスチック製注射器に塩基性アルミナ10gを配置します。カラムを通して単量体の約10ミリリットルを浸透。
    2. モノマー（50 mgのスチレン、100mgのジビニルベンゼンおよび50mgメタクリル酸）および1ミリリットルのガラスバイアルの孔形成剤（300 mgのトルエンと300ミリグラムイソオクタン）をロードします。重合開始剤、2,2'-アゾビスイソブチロニトリル（AIBN、モノマーに対して1％）の4ミリグラムを追加します。
    3. 10分間の超音波処理によってホモジナイズします。 10分間液体窒素をバブリングすることによって溶存酸素を除去します。パラフィンフィルムでバイアルキャップを密封し、混合物を重合するために6時間、60℃の水浴中に置き。
    4. 室温まで冷却し、慎重にバイアルを破ります。セルロース抽出シンブルにポリマーモノリスを転送します。ソックスレー抽出チャンバ内に抽出シンブルに入れ、抽出チャンバの少なくとも3倍の体積であるメタノールの量が含まれている丸底フラスコに組み立てます。抽出チャンバーの上部にコンデンサーを組み立てます。メタノールを沸騰させてソックスレー抽出を行います16時間、未反応モノマーおよび孔形成剤の完全な除去を確実にします。
    5. 60℃の真空オーブンで一晩乾燥。赤外分光法（FT-IR）をフーリエ変換することによりPCPを取り付けるためのカルボン酸官能基の存在を確認します。窒素吸着ポロシメータによって表面積を測定します。
  2. モノリシックカラムの作製のためのシリカキャピラリーの機能化
    1. ポリイミドコーティングされた100ミクロンのID溶融シリカキャピラリーの2メートルをカット。 0.25〜0.50ミリリットルのガラス製注射器に接続し、アセトンでキャピラリーを洗浄します。水でキャピラリーをすすぐことによりアセトンを除去。
    2. キャピラリーの内部シリカコーティングを活性化するために、30分間、0.25μL/分で0.2 M NaOH水溶液を流すシリンジポンプを使用。流出液が中性になるまで水で洗い流してください。
    3. 流出液のpHをチェックするためにpH試験紙ストリップを使用してください。キャピラリーのシラノール基をプロトン化するために、0.2 M aqueoポンプ30分間、0.25マイクロリットル/分でキャピラリーを通して私たちのHCl溶液。流出液が中性になるまで水で洗い流してください。エタノールですすいでください。
    4. 0.25μlの1時間/分で、3-（トリメトキシシリル）プロピルメタクリレート（pH5の酢酸で調節）の20％（w / w）のエタノール溶液をポンプ。このステップでは、シリカキャピラリーは、キャピラリー内表面にポリマーモノリスを取り付けるためにビニル基で官能化されます。
    5. 、アセトンですすぎ、窒素気流中で乾燥し、使用前に室温で一晩おきます。長さ20cmの短い断片にキャピラリをカット。
  3. モノリシックキャピラリカラムの調製
    1. ゴム隔壁を1ミリリットルのガラスバイアルにバルクポリマーモノリス（セクション1.1）のためのものと同一の重合混合物を準備します。モノマーに対する開始剤を1％AIBNを追加します。 10分間の超音波処理によってホモジナイズします。
    2. 非官能基化シリカキャピラリーを結合することによって、窒素で重合混合物をパージ窒素気流へ。
      1. バイアルのゴム隔壁を通して窒素流キャピラリーを挿入し、窒素が液体を介して気泡ように重合混合物にそれを浸します。過剰圧力を回避するために、少し緩いバイアルキャップを残します。 10分間パージします。
      2. バイアルのヘッドスペースに重合混合物から窒素流キャピラリーを持ち上げ、しっかりとキャップを閉じます。重合混合物中にセプタムを通して官能キャピラリを挿入します。ヘッドスペース内に注入窒素を介してキャピラリーに発生する圧力の過剰は、官能毛細管を通して重合混合物をポンプ。
      3. それが完全に満たされることを確実にするために、毛細管の流出物から重合混合物を数滴を収集し、ゴム隔膜で閉じます。非常に慎重にバイアルからキャピラリを取り、ゴム隔膜でキャピラリーの入口を閉じます。
    3. ミックスを重合6時間、60℃の水浴中でキャピラリー内に含まれるチャー。室温で冷却し、キャピラリーの両端の数ミリを切りました。 30分間の3μL/ minでHPLCポンプを用いてアセトニトリルでカラムを洗浄することにより未反応モノマーおよび孔形成剤を除去します。キャピラリカラムの背圧を確認してください。

鉄benzenetrycarboxylate 2.成長（FeBTC）PCP

  1. 特性評価のためのバルクポリマーモノリスのFeBTC MOPHの成長
    1. 乳鉢と乳棒を用いて予め乾燥モノリスを粉砕。
    2. 15分間、エタノール中の2mMのFeCl 3·6H 2 O 5ml中モノリス粉末100mgを浸し。ナイロンフィルター（0.22μm）を用いて、真空フィルター、エタノールで粉末を洗浄します。 15分間、エタノール中の2 mMの1,3,5-ベンゼントリカルボン酸（BTC）5ml中モノリス粉末を浸し。ナイロンフィルター（0.22μm）を用いて、真空フィルター、エタノールで粉末を洗浄します。
    3. 必要に応じて、ステップ数2を繰り返します。最終的な有機金属被膜の成長は、適用されたサイクル数によって定義されます。典型的には、10〜30サイクルが行われます。窒素吸着ポロシメータによる新たな細孔が存在することを確認してください。熱重量分析（TGA）によって、追加の金属部位の量を測定します。
  2. ホスホペプチドの濃縮のためのキャピラリーモノリスカラム上FeBTC MOPHの成長
    1. シリンジポンプを使用しました。 2μL/分で15分間、エタノール中の2mMのFeCl 3·6H 2 Oでキャピラリーモノリスをフラッシュします。 2μL/分で15分間、エタノールで洗浄します。 2μL/分で15分間、エタノール中の2 mMのBTCとキャピラリーモノリスをフラッシュします。 2μL/分で15分間、エタノールで洗浄します。
    2. 必要に応じて、ステップ1を繰り返します。最終的な有機金属被膜の成長を行うサイクルの数によって定義されます。

3.タンパク質消化およびEリン酸化ペプチドのnrichment

  1. タンパク消化
    1. 1mlの水に無脂乳0.5mlのを溶解し、200μlの画分に分割します。
    2. タンパク質消化のためのジスルフィド結合を切断するために、各画分に160μlの1 M重炭酸アンモニウムと50μlの45mMのジチオスレイトールを追加します。 15分間、サーモミキサーで50℃でインキュベートします。
    3. 溶液を室温まで冷却しながら、ヨードアセトアミドの100mM水溶液を徐々に50μlを添加します。ヨードアセトアミドは、新たなジスルフィド結合の形成を防ぐことができます。
    4. 室温で15分間、暗所でインキュベートします。脱イオン水1ミリリットルを追加します。 2μgのトリプシンを添加し、14時間、37℃でサーモ中のタンパク質を消化します。
    5. 1％トリフルオロ酢酸の10μlの酸性化によって消化を終了し、そして室温で5分間サーモミキサーに入れます。 -20℃で消化したタンパク質を保存します °C。
  2. キャピラリMOPHカラムを用いてリン酸化ペプチドの濃縮。
    1. 1μL/分の流速で10分間、0.1％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリルの4：1混合物100μlでカラムを洗浄します。 30分間、2μL/分でカラムに通してタンパク質消化ポンプ。
    2. 1μL/分の流速で10分間、0.1％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリルの混合物1：4で再び非リン酸化ペプチドを洗浄します。 1μL/分の流速で10分間水で洗浄します。
    3. 15分間、1μL/分でポンピング250mMのpH7のリン酸緩衝液を用いてリン酸化ペプチドを溶出させます。バイアルに溶離液を収集し、標準的なプロトコル19を用いて、溶液を脱塩します。マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析法（MALDI-TOF-MS）のためのマトリックスとして使用するために2 mg / mlの2,5-ジヒドロキシ安息香酸を調製します。 phosphopeを溶出するために、先端に2,5-ジヒドロキシ安息香酸の2μLを描かptidesとMALDIプレート上に直接それらを見つけます。
    4. MALDI-TOF-MSによるスポットを分析し、水、次いでメタノールで十分に洗い流すことによって列を再生成します。

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結果

有機ポリマーモノリスの細孔表面上のPCPの成長の概略図を図1に示す。この図では、我々は、カルボキシル官能基に配位し、元のポリマーモノリスの細孔表面上に保持され、初期のFe（III）原 ​​子を例示します。プロトコルを使用して、本明細書中に追加の有機配位子とを記載したFe（III）イオンは、ポリマーモノリス内の多孔性配位ネットワークを成形、表面に添加されている。また、概略的にするためのフロースルー支持されるように調製キャピラリMOPHカラムの使用を示す図1ホスホペプチドの濃縮。表面積と細孔分布の測定、走査型電子顕微鏡像（SEM）、FT-IR及びTGAを調製した材料（ 図2）のために収集しました。これらの特性評価実験はFeBTC PCP（ 図2A）の成長後の新たな孔の出現についての貴重な情報を提供しました。 MOFeBTC PCPと変更後の材料のrphologyは、 図2Bに示されています。結晶シミュレーションに基づいて、それぞれの個々のMOF層の厚さは、成長する結晶の配向...

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ディスカッション

元のポリマーモノリスは、金属に結合することができるカルボン酸官能基を含んでいます。元の材料に初期金属部位の調整、我々は、微孔性ネットワークを成形する付加的な金属部位の数を取り入れ、PCPコーティング（ 図1A）を増殖することができます。これは、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（IMAC）法などの金属種が関与している抽出または精製手順のための魅力的な提示MOPH材料を行います。ホスホペプチドの濃縮のためのキャピラリカラムを用いた一般的な手順は、 図1Bに示されています。

バルク粉末モノリスの製造は、元のモノリシック材料の特性評価およびその改変の対応を可能にしました。私たちは、主にO、低P / Pのそれは30 PCPサイクル後、N 2の取り込みを示しており、77 K（ 図2A）でN 2吸収等温線を測定しました材料中の新しいミクロ孔の存在を示す、増加しました。元のモノリス増加の表面積389メートル...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この作業は、ローレンス・バークレー国立研究所の分子鋳造所で行われ、米国エネルギー省の科学ユーザー施設部門、基礎エネルギー科学局の科学局の支援を受けています。DE-AC02-05CH11231。ME-フルブライトフェローシップによるFMとパキスタン高等教育委員会によるASの財政的支援に感謝しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ポリイミド被覆毛細血管Polymicro TechnologiesTSP100375100 μM.I.D.さん
3-(トリメトキシシリル)プロピルメタクリレート、98%シグマアルドリッチ440159
スチレン、99%シグマアルドリッチW323306テクニカルグレード
ジビニルベンゼン、80%シグマアルドリッチ414565
メタクリル酸、98%マリンクロットMK150659
トルエン、≥99.5%EMD化学物質MTX0735-6
イソオクタン、≥99.5%Sigma-Aldrich650439
2,2'-アゾビスイソブチロニトリル、98%Sigma-Aldrich441090
酸化アルミニウム(塩基性アルミナ)Sigma-Aldrich199443
塩化鉄(III)六水和物、97%Sigma-Aldrich236489
1,3,5-ベンゼントリカルボン酸、95%Sigma-Aldrich482749
アセトニトリル、≥99.5%シグマ・アルドリッチ360457
重炭酸アンモニウム、≥99.5%Sigma-Aldrich9830
トリフルオロ酢酸、≥99%Sigma-Aldrich302031
エタノール、≥99.8%Sigma-Aldrich2854
ヨードアセトアミド、≥99%シグマ-アルドリッチI1149
ジチオスレイトール、≥99%Sigma-Aldrich43819
一塩基性リン酸ナトリウム二水和物、≥99%Sigma-Aldrich71505
二塩基性リン酸ナトリウム二水和物、≥99%Sigma-Aldrich71643
リン酸、≥85%Sigma-Aldrich438081
2,5-ジヒドロキシ安息香酸、≥99%Sigma-Aldrich85707
トリプシンSigma-AldrichT8003牛膵臓
β-カゼインSigma-AldrichC6905牛ミルク
ZipTip ピペットチップメルク ミリポアZTC18S096C18 樹脂

参考文献

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