Method Article

蛍光生体膜フォースプローブ：単一細胞上の受容体 - リガンド速度論の同時定量との結合によって誘導される細胞内シグナル伝達

DOI:

10.3791/52975

⸱

August 4th, 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Woodruff School of Mechanical Engineering, Petit Institute for Bioengineering and Biosciences, Georgia Institute of Technology, 2Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology, 3Charles Perkins Centre, The University of Sydney, 4Institute of Biophysics, Laboratory of RNA Biology, Chinese Academy of Sciences, 5University of Chinese Academy of Sciences, 6School of Medicine and Collaborative Innovation Center for Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases, Zhejiang University

In This Article

Summary

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私たちは、単一のTリンパ球におけるカルシウムシグナル伝達のリアルタイムイメージングと、力制御された単一の受容体-リガンド結合速度の測定を同時に行うための技術について説明します。

Abstract

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膜受容体 - リガンド相互作用は、多くの細胞機能を媒介します。これらの分子の相互作用によって引き起こさ結合動態および下流のシグナル伝達は、おそらく結合し、場所を取るシグナル伝達する機械的な環境の影響を受けています。最近の研究では、機械的な力により、抗原認識を調節し、T細胞受容体（TCR）をトリガすることができることを実証しました。これは、我々が開発した新技術によって可能になったし、蛍光顕微鏡で単一分子力分光法を組み合わせた蛍光生体膜力プローブ（fBFPを）、と呼ばれました。敏感な力センサー、高速度カメラとリアルタイムイメージング追跡技術として、超ソフトヒト赤血球を用いて、fBFPは約3 nmおよび〜0.5秒で約1 PN（10 -12 N）であります力、空間的および時間的分解能。 fBFPで、1は正確に力調節の下で単一の受容体 - リガンド結合反応速度と同時に、画像結合トリガー細胞内CALを測定することができます単一の生細胞上でシグナリングcium。この新技術は、機械的な規制の下に他のセルにおける他の膜受容体 - リガンド相互作用およびシグナル伝達を研究するために使用することができます。

Introduction

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細胞-細胞及び細胞-細胞外マトリックス（ECM）接着は、細胞表面受容体、ECMタンパク質、および/ ​​または脂質の1との間の結合によって媒介されます。結合は、細胞が機能構造1を形成し、同様に認識し、通信し、環境1-3に対応することができます。可溶性タンパク質（ 例えば 、サイトカインおよび成長因子）、3次元（3D）から結合する細胞表面受容体への液相とは異なり、細胞接着受容体は、分子拘束二つの対向面をブリッジする狭い接合ギャップを横切るそのリガンドとの結合を形成します2次元（2D）インターフェース4-7の拡散。一般的に、伝統的な結合アッセイ（ 例えば 、表面プラズモン共鳴またはSPR）によって測定された3次元動態とは対照的に、2D速度は、原子間力顕微鏡（AFM）8-10のような特殊な技術を用いて定量化されなければならない、チャンバ11,12を流れ、マイクロピペット13,14、光ピンセット15と生体膜力プローブ（BFP）16-21。

単に携帯凝集のための物理的結合を提供するよりも、接着分子は、その周囲と通信するセルのシグナル伝達機構の主要な構成要素です。接着分子のリガンド係合は、細胞内シグナル伝達とどのように初期信号が細胞内に伝達されるがどのように....

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Protocol

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このプロトコルは、のガイドラインに従っており、ジョージア工科大学の人間研究倫理委員会によって承認されています。

1.ヒト赤血球の分離、ビオチン化および浸透圧の調整

注：治験審査委員会は、プロトコルを承認したとステップ1.1は、訓練を受けた医療専門家のような看護師が行ってください。

  1. 指穿刺から血液の8-10μL（1滴）を入手し、炭酸/重炭酸塩緩衝液1mlに追加（ 表1及び2）。ゆっくり900 X gで1分間混合し、遠心分離をボルテックスまたはピペット。上清を捨て、もう一度洗浄します。
  2. 小さ ​​なビーカーにビオチンPEG3500-NHSリンカー（ 表1）の3.5-4 mgの重量を量ります。最終濃度を3mg / mlとするために、炭酸/重炭酸塩緩衝液中に溶解します。
  3. 炭酸/重炭酸塩緩衝液の171μlを、RBCパックを10μlとの1049μLをミックスビオチン-PEG3500-NHSリンカー溶液と室温で30分間インキュベートします。炭酸塩/重炭酸塩緩衝液で1回RBCを洗浄し、2回N2-5％緩衝液（ 表1および2）を有します。
  4. 一方、5分間の底部と真空中で乾燥剤を充填したガラス製の真空デシ....

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Results

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BFP技術は1995 17エバンス研究所によって開発された。このpicoforceツールは広く、そのリガンド16,19,20と相互作用する接着分子の二次元の動態を解析するように、表面上に固定化されたタンパク質の相互作用を測定するために使用されています30、分子21,29弾性を測定するため、およびタンパク質コンホメーション変化21を決定します。 fBFPために、対応するソフトウェアシステム（ 表1）を用いてエピ蛍光関連デバイスの追加セットは、（ - C図1A）を添加します。

fBFPシステムは、ハードウェアシステム（光学的、機械的および電気的構成要素）と、ソフトウェアシステム（ 表1、図1A、B）からなります。明視野および落射蛍光顕微鏡を有効に光学部品との倒立顕微鏡（中央図1Aは 、）の本体を構.......

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Discussion

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成功fBFP実験は、いくつかの重要な考慮事項を必要とします。まず、力計算のために、マイクロピペット、RBC信頼性があるとし、プローブビーズはできるだけ同軸の近くに位置合わせされるべきです。 RBCとピペットとの間の摩擦が無視できるように、ピペット内のRBCの突起は、約1プローブピペット径でなければなりません。典型的なヒトRBCのために、最適なピペットの直径は、式1 17,30のベストフィットをもたらす2.0〜2.4μmです。第二に、力クランプアッセイおよび熱揺らぎアッセイでの測定は単結合のために主にであることを確認するために、20％未満の接着周波数は10,13,30を維持する必要があります。ここでは、非特異的な癒着は慎重に（BSAとの十分な遮断することにより、通常<5％）を制御する必要があります。また、データは、単一の力ドロップとの密着性事象からのみ収集する必要があります - シングルステップ消失に単一分子の挙動の特徴（類似）単一分子FRETの蛍光の。蛍光色素の第三に、添加濃度は、最良の結像性能を達成するために、ケースバイケースで最適化されるべきです。第四に、T細胞または関心のある他の細.......

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Disclosures

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著者らは開示するものは何もない。

Acknowledgements

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この論文に関連する研究とZhu研究室でのfBFP技術の開発は、NIHの助成金AI044902、AI077343、AI038282、HL093723、HL091020、GM096187、およびTW008753によって支援されました。この力強い実験ツールを発明してくれたEvan Evans氏と、BFPの構築に協力してくれたEvans研究室のメンバー、Andrew Leung氏、木下浩二氏、Wesley Wong氏、Ken Halvorsen氏に感謝します。また、他のZhu研究室のメンバーであるFang Kong氏、Chenghao Ge氏、Kaitao Li氏にも、装置開発に協力していただいたことに感謝します。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
リン酸ナトリウム一塩基性一水和物(NaH2PO4 & bull;H2O)Sigma-AldrichS9638リン酸緩衝液調製
Anhy.リン酸ナトリウム 二塩基性 (Na2HPO4)Sigma-AldrichS7907リン酸緩衝液
炭酸ナトリウム (Na2CO3)Sigma-AldrichS2127炭酸塩/重炭酸塩緩衝液
重炭酸ナトリウム (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761炭酸塩/重炭酸塩緩衝液
塩化ナトリウム(NaCl)Sigma-AldrichS7653N2-5%緩衝液
塩化カリウム(KCl)Sigma-AldrichP9541N2-5%緩衝液
リン酸カリウム一塩基性(KH2PO4)Sigma-AldrichP5655N2-5%緩衝液
スクロースSigma-AldrichS0389N2-5% 緩衝液調製
MAL-PEG3500-NHSJenKemA5002-1ビーズ官能基化
ビオチン-PEG3500-NHSJenKemA5026-1RBC ビオチン化
ナイスタチンSigma-AldrichN6261RBC 浸透圧調整
水酸化アンモニウム (NH4OH)Sigma-AldrichA-6899ガラスビーズシラン化
メタノールBDH67-56-1ガラスビーズシリノイ化
30% 過酸化水素 (H2O2)J. T. BarkerJan-86ガラスビーズシラン化
酢酸 (氷河)Sigma-AldrichARK2183ガラスビーズシリノイ化
3-メルカプトプロピルトリメトキシシラン (MPTMS)Uct Specialties, llc4420-74-0ガラスビーズ機能化
ホウケイ酸ガラスビーズDistrilab粒子技術9002ガラスビーズ機能化
ストレプトアビジン&マイナス;マレイミドSigma-AldrichS9415ガラスビーズ 機能化
BSASigma-AldrichA0336リガンド 官能基化
Fura2-AMライフテクノロジーF-1201細胞内蛍光カルシウム色素ローディング
ジメチルスルホキシド(DMSO)Sigma-AldrichD2650細胞内蛍光カルシウム色素ローディング
Quantibrite PEビーズBD Biosciences340495密度定量化
フローサイトメーターBD BiosciencesBD LSR II密度定量
キャピラリーチューブ 0.7-1.0 mm x 30インチキンブルチェイス46485-1マイクロピペット製造
フレーミング/ブラウン マイクロピペット プーラーサッター器具P-97マイクロピペット製造
マイクロフォース成重MF-900マイクロピペット製造
鉱物油フィッシャー・サイエンティフィックBP2629-1チャンバーアッセンブリー
顕微鏡カバー ガラスフィッシャー・サイエンティフィック12-544-Gチャンバーアッセンブ
リー マイクロインジェクターワールド・プレシジョン・インスツルメンMF34G-5チャンバーアッセンブリー
1mlシリンジBD 309602チャンバーアッセンブリー
マイクロピペットホルダー成茂HI-7チャンバーアッセンブリー
自家設計の機械部品とアダプター CNC加工による製作 生物物理学機器すべての部品はCAD設計に従ってカスタマイズされています。BFPシステム
顕微鏡(TiE倒立)ニコンMEA53100BFPシステム
対物レンズ CFI Plan Fluor 40x (NA 0.75, WD 0.72 mm, Spg)ニコンMRH00401BFPシステム
カメラ, GE680, 640 x 480, GigE, 1/3" CCD, monoGraftek Imaging02-2020CBFPシステム
Prosilica GC1290 - ICX445, 1/3", C-Mount, 1280 x 960, Mono., CCD, 12 Bit ADCGraftek Imaging02-2185ABFPシステム
リモコン付き手動サブミクロンプローブヘッドカールサスPH400BFPシステム
防振テーブル(5フィート×3フィート)TMC77049089BFPシステム
3D手動並進ステージNewport462-XYZ-M
SolidWorksの3D CADソフトウェアSOLIDWORKS Corp.バージョン2012 SP5BFPシステム
LabVIEWソフトウェアNational Instrumentsバージョン2009BFPシステム、BFPプログラム
3Dピエゾ並進ステージPhysik InstrumenteM-105.3PBFPシステム
リニアピエゾアキュエーターPhysik InstrumenteP-753.1CDBFPシステム
Micromanagerソフトウェアバージョン1.4fBFPシステム、蛍光イメージングプログラム
デュアルカム (DC-2)フォトメトリクス77054724fBFPシステム
デュアルカム エミッションフィルター (T565LPXR)フォトメトリクス77054725fBFPシステム
蛍光カメラ浜松ORCA-R2 C10600-10BfBFPシステム
プラスチックパラフィンフィルム (パラフィルム)ビーミス社PM996ボトルシール
炭酸塩/重炭酸塩緩衝液(pH 8.5)8.4 g / L炭酸ナトリウム(Na2CO3)、10.6g / L重炭酸ナトリウム(NaHCO3)
リン酸緩衝液(pH 6.5-6.8)27.6 g / Lリン酸一塩基性(NaH2PO4•H2O)、28.4g/Lアンヒ。リン酸二塩基性Na(Na2HPO4)
N2-5%緩衝液(pH 7.2)20.77 g / L塩化カリウム(KCl)、2.38 g / L塩化ナトリウム(NaCl)、0.13 g / Lリン酸カリウム一塩基性(KH2< / sub>PO4)、 0.71 g/Lのアンヒ。リン酸二塩基性ナトリウム(Na2HPO4)、9.70g / Lショ糖
ズ ツ 高解像度

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aplin, A. E., Howe, A., Alahari, S. K., Juliano, R. L. Signal transduction and signal modulation by cell adhesion receptors: the role of integrins, cadherins, immunoglobulin-cell adhesion molecules, and selectins. Pharmacological reviews. 50, 197-263 (1998).
  2. Davis, M. M., Bjorkman, P. J.

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