生理活性、PCLベースの「セルフフィット」形状記憶ポリマー足場の作製

Summary

骨伝導性と生物活性を示しながら、頭蓋顎顔面(CMF)の骨欠損に適合できるスキャフォールドは興味深いものです。このプロトコルは、溶融塩テンプレートを使用する溶媒鋳造微粒子浸出(SCPL)法および生物活性ポリドーパミンコーティングの適用を使用して、ポリカプロラクトンジアクリレート(PCL-DA)に基づく形状記憶足場の調製について説明します。

Abstract

組織工学は、臨界サイズの頭蓋顎顔面(CMF)骨欠損の治療のための代替戦略として探求されてきました。このアプローチの成功に不可欠なのは、不規則な欠陥にコンフォーマルに収まると同時に、必要な生分解性、細孔の相互接続性、および生物活性を備えた足場です。形状記憶ポリマー (SMP) 足場は、その形状回復性と固定性の性質上、欠陥の "自己適合" を達成できます。このようにして、温かい生理食塩水 (~60 °C) にさらされると、SMP 足場は可鍛性になり、手で押し付けて不規則な欠陥にすることができます。その後の冷却 (~37 °C) により、足場は欠陥内で比較的硬い状態に戻ります。これらの要件を満たすために、このプロトコルでは、溶媒キャッシング微粒子浸出(SCPL)法を使用して、生分解性ポリカプロラクトンジアクリレート(PCL-DA)の光化学硬化を介して調製されたSMPスキャフォールドの調製について説明します。溶融塩テンプレートは、細孔の相互接続性を実現するために利用されます。生理活性を実現するために、足場の細孔壁の表面にポリドーパミンコーティングが施されています。自己適合および形状記憶挙動、細孔の相互接続性、およびin vitro生物活性の特性評価についても説明します。

Introduction

現在、頭蓋顎顔面（CMF）骨欠損治療のゴールドスタンダードと考えられ、収穫自家移植片の移植は複雑な移植手順、ドナー部位の罹患率と限られた可用性¹によって妨げられています。特定の困難は、オッセオインテグレーションを得るために、グラフトの再吸収を防止するために、欠陥にしっかり剛性自家移植片を成形し、固定されています。組織工学は、自家移植の代替戦略と合成骨代替物（ 例えば、骨セメント^）-2,3-として研究されてきました。組織工学的アプローチの成功に重要なプロパティの特定のセットとの足場です。まず、オッセオインテグレーションを得るために、足場は、隣接する骨組織⁴との密接な接触を形成しなければなりません。足場はまた、細胞移動、栄養拡散とneotissue堆積^4,5を可能にして、骨伝導性でなければなりません。この動作は、一般的に、生分解性、SCAで達成されます高度に相互接続孔の形態を呈するffolds。骨組織^5を周囲との統合との結合を促進するために、最後に、足場は、生物活性であるべきです。

ここでは、これらの特性を持つ組織工学の足場を準備するためのプロトコルを提示します。重要なことには、この足場は、形状記憶挙動⁶による不規則なCMF欠陥に「自己適合」する能力を示します。温度応答性形状記憶ポリマー（SMPS）は^、7,8の熱への暴露時に形状変化を起こすことが知られています。 SMPSが永続的形状および一時的形状を維持し、永続的形状を回復する「スイッチングセグメントを「決定」netpoints」（ すなわち 、化学的または物理的架橋）から構成されています。スイッチングセグメントは_ガラス転移（T g）のいずれかに相当する熱転移温度（T _{トランス）を示す}か、ポリマーの転移（T _mを）溶かします。として結果は、SMPSが順次T トランスで一時的な形状に固定し、T> T _トランスでの一時的な形状に変形し、T> T _トランスで永続的形状に回復することができます。 ^6を次のようにこのように、SMP足場は、CMFの欠損内に「自己フィッティング」を達成できました。生理食塩水（T> T _{トランス）を}温めるに暴露した後、SMP足場は、形状回復が不良境界に足場の拡大を推進して、凹凸欠陥に手で押したように一般的に準備された円筒状の足場を許可する、可鍛性になります。 （T トランス）を冷却すると、足場は形状固定性が欠損内に、新しい一時的な形状を維持しながら、その比較的より剛性の状態に戻ることになります。このプロトコルでは、SMPの足場は、生分解性ポリマーは、組織再生、および他の生物医学的用途のために広く研究^9-11、ポリカプロラクトン（PCL）から調製されます。形状記憶のために、目PCLのEのT _mは、T _トランスとして機能し、PCL ¹²の分子量に応じて、43〜60ºCの間で変化します。このプロトコルでは、足場のT _トランス （ すなわち T _m）は^{56.6±0.3ºC6}です。

骨伝導性を達成するために、プロトコルは、溶媒キャスティング微粒子浸出（SCPL）法^6,13,14に基づいて高度に相互接続された細孔を有するPCLベースSMP足場を作るために開発されました。ポリカプロラクトンジアクリレート（PCL-DA）（M = _N〜10,000グラム/モル）を急速な、光化学的な架橋を可能にするために利用された塩のテンプレート上溶剤キャストを可能にするために、ジクロロメタン（DCM）に溶解しました。光化学硬化、溶媒の蒸発の後、塩のテンプレートを水に浸出することによって除去しました。平均塩サイズは足場の細孔サイズを調節します。重要なことには、塩テンプレート前細孔interconnectiviを達成するために、キャスティング溶媒を水と融合しましたTY。

生物活性は、細孔壁^6上にポリドーパミンコーティングのその場形成のことで、SMPの足場に付与しました。生物活性は、多くの場合、ガラスまたはガラス-セラミック充填材¹⁵を含めることによって足場に導入されます。しかし、これらは、望ましくない脆性、機械的特性を生じ得ます。ドーパミンは、基板^16〜19の様々な上に付着し、薄いポリドーパミン層を形成することが示されています。このプロトコルでは、SMPの足場は、すべての細孔壁面⁶にポリドーパミンのnanothickコーティングを形成するためにドーパミンのわずかに塩基性液（pH = 8.5）に供しました。改善された細胞接着のための表面の親水性を向上させ、拡散に加えて、ポリドーパミンは、擬似体液^{（SBF）18,20,21}への曝露の際に、ハイドロキシアパタイト（HAP）を形成するという点で生物活性であることが示されています。最後のステップでは、コートされた足場は、85ºC（T> T _{トランス）WH}で熱処理を露出させますICHは、足場の高密度化につながります。熱処理は、以前おそらく近接¹⁴に再編成するPCLの結晶ドメインに、足場形状記憶動作のために必須であることが認められました。

我々はさらに、孔の形態を、不規則なモデル欠陥内のセルフフィット挙動を特徴づけるための方法を記載するという点でひずみ制御環状の熱機械的圧縮試験を形状記憶挙動（ すなわち形状回復と定着性を形作る）、 および in vitro生物活性に 。足場の特性を調整するための戦略も提供されます。

Protocol

1. PCL-DAマクロマーの合成

1. アクリルの反応を実行します。
   1. テフロンで覆われた磁気撹拌棒を備えた250mlの丸底フラスコにPCLジオール_（N = M〜10,000グラム/モル）を20gを秤量します。
   2. DCM中のPCLジオールを溶解します。
      1. フラスコ（濃度= 0.17グラム/ミリリットル）に120 mLlof DCMを追加します。
      2. 圧力上昇を避けるためにも、DCMの蒸発を防止しながら、フラスコの首に緩くゴム隔膜を配置します。
      3. 〜250rpmで30分間〜攪拌溶液がポリマーを完全に溶解しました。
   3. 溶液に4-ジメチルアミノピリジン（DMAP）の〜6.6ミリグラムを加え、撹拌しながら溶解します。
   4. フラスコの首にしっかりとゴム隔膜を配置します。ソリューションは、攪拌を継続することを許可します。
   5. ゴム隔膜を介して、優しく、正N ₂圧力針入口とオープン針を使用して〜3分間_N 2でフラスコをパージアウトレットとして。
   6. N ₂入口と出口を削除します。
   7. ゴム製セプタムを通して挿入された針を備えたガラス製シリンジを介して滴下し、トリエチルアミン_（Et 3 Nを）の0.56ミリリットル（4.0ミリモル）を追加します。
   8. ゴム製セプタムを通して挿入された針を備えたガラス製シリンジを介して塩化アクリロイルを滴下の0.65ミリリットル（8.0ミリモル）を追加します。
   9. フラスコに、N _2注入口を返し、その内容は〜のために、正N ₂圧下で30分間攪拌することができます。
   10. 55ºCにオイルバスを事前に加熱します。
   11. 割り当てられた〜30分後、N _2注入口を削除し、凝縮器をセプタムを交換してください。
   12. 予備加熱した油浴中にフラスコを浸し。
   13. フラスコの内容物を20時間撹拌します。
   14. 割り当てられた20時間後、油浴からフラスコを除去し、内容物を室温に冷却します。
   15. ロータリーエバポレーターを使用して、フラスコからDCMの溶媒を除去します。
2. P粗製のPCL-DA製品をurify。
   1. フラスコに、酢酸エチル〜135ミリリットルを加え、粗PCL-DAを溶解します。
   2. 重力はきれいな250ミリリットル丸底フラスコにろ紙を通して溶液をフィルタリングします。 （注：ソリューションを容易に通過しない、ろ紙上に厚くすることができるので、慎重に加熱銃で穏やかな熱を適用する場合。。）
   3. ロータリーエバポレーターを使用して、フラスコから酢酸エチルの溶媒を除去します。
   4. フラスコに、DCMの〜140ミリリットルを加え、粗PCL-DAを溶解します。
   5. 500ミリリットル分液漏斗にコンテンツを転送します。
   6. ロートに、2 M炭酸カリウム_（K 2 CO _3）の13.5ミリリットルを追加します。
   7. ファンネルキャップ。ゆっくりコックを介して圧力を解放するように注意しながら、漏斗を反転し、穏やかに一度か二度旋回することにより、2層を混合。 3回繰り返します。
   8. パラフィルムの層でキャップを交換し、混合物は、O / N（〜12時間）を分離することができます。
   9. 底を収集し、または250ミリリットルの三角フラスコにganic層。
   10. フラスコに_無水硫酸マグネシウム（MgSO 4）の〜5グラムを加え、穏やかに渦巻きます。
   11. 重力は丸底フラスコ定性濾紙とクリーン250ml中に混合物をフィルタリングします。
   12. ロータリーエバポレーターを使用して、フラスコからDCMの溶媒を除去します。
   13. 残留DCMを除去し、高真空下で乾燥。 （注：PCL-DAは光から離して保管する必要があります。）
   14. ¹ H NMR ^22,23とアクリルを確認してください。

SMP足場（図1）を準備する。2.

1. 溶融塩のテンプレートを準備します。
   1. 直径〜460±70μmの塩化ナトリウム（NaCl）で粒子を得るために425ミクロンのふるいを使用してください。 （注：平均粒径は、ImageJソフトウェアを走査型電子顕微鏡[SEM]像から確認することができる^。）14
   2. 3ミリリットルのガラスバイアル（ID = 12.9ミリメートル）には、以前にふるいにかけNaClを1.8グラムを追加します。
   3. ゆっくりとバイアルに（塩の重量に基づく）、4回に分けて、DI水（0.146グラム）を7.5重量％を追加します。水の各部分を加えた後、金属へらで混ぜます。
   4. バイアルに蓋を、組織内にラップし、遠心分離管に垂直に配置します。 3,220×gで15分間遠心。
   5. キャップを外し、空気乾燥O / N（〜12時間）をしましょう​​。
2. 新しいガラスバイアルに、DCM 1ml当たりPCL-DA 0.15gのを組み合わせることにより、「マクロマー溶液」を調製します。 （注：1の足場のために、〜1mlの溶液を準備する必要があります）キャップとは〜1分間ボルテックスミキサー上で高速で溶液を混合。
3. 新しい3 mLのガラスバイアル中、1-ビニル-2-ピロリドン（NVP）10重量％の2,2-ジメトキシ-2-フェニルアセトフェノン（DMP）に基づいて、「開始剤溶液」を調製します。 NVP 1mlにDMPの0.115グラムを組み合わせます。 （注：1の足場のために、〜180μLが必要です。）キャップ、（光を遮断する）アルミホイルで包み、ボルテックスミキサーで高速で溶液を混合〜1分間。 （注：上級で製造した場合、溶液は冷蔵し、光から保護されるべきです。）
4. アルミホイルで（キャップ​​除く）マクロマー溶液を含むバイアルをラップ（光を遮断するために）、およびピペットで15体積％を追加の光開始剤溶液（マクロマー溶液の全体積に基づいて）。キャップと〜1分間ボルテックスミキサー上で高速で溶液を混合。
5. （光を遮断する）アルミホイルで（キャップ​​を除く）溶融塩テンプレートを含むバイアルをラップし、ピペットで先に調製したマクロマー/光開始剤溶液（〜0.6ミリリットルまたはテンプレートが完全に覆われるまで）を追加します。
6. バイアルに蓋を、組織内にラップし、遠心分離管に垂直に配置します。テンプレート全体マクロマー溶液を配布する1,260×gで10分間遠心。
7. 、アルミホイルを外し、バイアルをキャップを取ると3分間UV光（365nmの、25 W）に公開します。空気乾燥O / N。
8. 「塩含有scaffolを削除ガラスバイアルの上部を得点し、破砕した後、ピンセットでバイアルからD」。
9. （：1容量：容量1）400ミリリットルビーカーに、水/エタノールの溶媒〜200ミリリットルを準備します。
10. 毎日の溶媒変更で4日間水/エタノール溶媒中に沈め足場を維持します。
11. 溶剤や空気乾燥O / Nから足場を取り外します。

3. SMP骨格にポリドーパミンコーティングを塗布する（図1）

1. テフロン被覆された撹拌棒を備えた400ミリリットルのビーカーでは、ドパミン塩酸塩溶液の〜200ミリリットル（10 mMトリス緩衝液中の2 mg / mlの、pH値= 8.5、25ºC）を準備します。 〜150rpmで攪拌​​します。
2. 距離の半分足場を介して足場に、〜;使い捨て針（ゲージ= 20の長さ= 40 mm）を配置します。針ハブの周りにワイヤーをラップします。
3. ビーカーの縁にワイヤーを固定することにより、攪拌ドーパミン溶液に（溶液表面上の針ハブ付き）足場を沈めます。
4. 針ハブにシリンジを配置し、足場から空気を引くためにそれを使用して足場を脱気。 （注：より多くの空気が除去できない場合に脱ガスが完了し、溶液を完全に足場に浸透しています。）
5. 16時間攪拌したドーパミン溶液中に沈め足場を維持します。
6. 溶液から足場を外し、針を取り除きます。 24時間室温で真空オーブン中でDI水とドライで洗い流してください。
7. 1時間85ºCオーブンに足場を置きます。
8. 足場を室温に冷却します。最終的な円筒状の足場は〜直径6mm X〜5ミリメ​​ートルの高さになります。

4.「セルフフィット」行動を評価します

1. 厚さ〜5mmである硬質プラスチックのシートを使用して、「不規則なCMF欠損モデル」を用意します。 図2Aに示されたように、〜6ミリメートルよりもわずかに小さい平均直径を有するプラスチックシート内の空隙を作成するためにドリルを使用してください。
2. ABで（生理食塩水の臨床使用を表す）エーカー、熱DI水〜60ºCの温度。
3. 〜60ºC、水の入ったビーカーの中に足場を置きます。水にすべての領域を露出させ、水面下の足場をプッシュするためにピンセットを使用してください。 〜2分間、または足場が著しく（ 図2B）を軟化するまで続けます。
4. ビーカーから足場を取り外し、すぐにモデルの欠損部に（手で）を押します。
5. RT（〜5〜10分間）（ 図2C）に冷却してください。
6. 新しい、固定の一時的な形状と比較的より剛性の状態（ 図2D）のリターンを観察する欠陥から削除します。

5.テスト形状記憶挙動

1. 動的機械的分析器の使用（DMA;本明細書中で使用される、例えば 、TA InstrumentsのQ800）を、2サイクル（N）の形状固定性（ _式中、R _{f）を決定する}と、足場の上に歪み制御環式熱機械的圧縮試験を実行します形状回復（R _rの）（ 図3）。
   1. 5分間60℃（ _高 T）に平衡化。
   2. 50％/分で最大ひずみ_（εM = 50％）に圧縮します。
   3. _εmを （5分）でホールド。
   4. 25℃（ _低 T）に冷却し、一時的な形状を固定するための10分間維持します。
   5. 負荷を削除します。
   6. ストレスのない状態での究極のひずみ_（εU）を測定します。
   7. 60°C（T _高 ）に再加熱し、10分には永続的形状を回復するために維持します。
   8. 回収されたひずみ_（εpを ）を測定します。
   9. まだ（T _高 ）、60℃で、2 ^番目のサイクルを開始する（N = 2）1 ^回目のサイクルの後に回収され、高さ（N = 1）の50％に足場を圧縮しています。
   10. 5.1を繰り返します.3-5.1.8、N = 2のため。
   11. 以下の式を使用して、N = 1および2のR _fおよびR _rを計算します。
       _式中、R f（N）= _{[U（N）/εm}のε]のR _{R（N）= [εm}を - _εP（N）] / _[εmを - _εpを（N-1）]

6.可視化細孔サイズおよび細孔相互接続性

1. 走査型電子顕微鏡の使用（SEM;本明細書中で使用される例えば FEI QuantaがSEM）を、孔径および孔相互接続性を観察します。
   1. ピンセットを使用して、SMPの足場を保持1分間液体N ₂中に沈めました。
   2. きれいなカミソリの刃で足場の中央に沿って液体_N 2と骨折から削除します。
   3. カーボンテープを用いて、試料上にSMP足場半分の一方を固定破断面を上に​​向けてステージ。
   4. 金 - 白金（〜4 nm）のでコートをスパッタ。
   5. 10〜15 kVの（ 図4A）の推奨加速電圧でのSEM画像をキャプチャします。

インビトロ生物活性の7テスト

1. 50mlの遠心分離管に、〜1×SBF ²⁴の30ミリリットルを追加します。
2. 元の、円筒状に成形された永続的形状に足場を取得します。きれいなブレードを用いて（円形縁全体に）半分に足場をカットします。
3. 準備された遠心管とキャップ内に個々の足場半分を置きます。
4. 無SBF変更を静的条件下での水浴中で37℃でチューブを維持します。
5. 14日後、24時間SBF、空気乾燥から足場を取り外します。
6. カーボンテープを使用して、破断面を上に​​向けて試料ステージ上に足場を固定。
7. 金 - 白金（〜4 nm）のでコートをスパッタ。
8. 再でSEM画像をキャプチャ10〜15 kVの（ 図4B）の加速電圧を賞賛しました。

Results

得られたPCLベースSMP足場は自己フィッティングモデルCMF欠陥に（ 図2）が可能です。短時間の露光後の生理食塩水（〜60℃）を暖めるために、円筒状の足場は、足場が手動に押され、モデルの欠陥内で膨張することができるように柔らかく。室温まで冷却した後、足場が欠陥から除去する際に保持され、新しい一時的な形状に固定されています。

SMP足場の形状記憶挙動は、形状固定性（ _式中、R f）及び形状回復（R _rの）（ 図3）の条件で歪制御環式熱機械的圧縮試験によって定量化されます。このPCLベースのSMP足場については、サイクルの値（％）N = 1と2は、次のとおりです。 _式中、R f（1）= 102.5 0.7 _は 、R f（2）= 101.8 0.3、Rを_R（1）95.3 0.9、およびR _rを（2）99.8 0.2 ⁶ =。

Discussion

このプロトコルは、自己フィッティング行動だけでなく、骨誘導性および生物活性ポリドーパミン被覆された、PCLベースの足場の製造を記載し​​、不規則なCMFの骨欠損の治療に関心のそれを作ります。プロトコルの態様は、様々な骨格の機能を変更するために変更することができます。

プロトコルは、UV硬化を可能にするために、PCLジオールのアクリルから始まります。報告された例では、PCLジオールのM _nは〜10,000グラム/モルです。しかし、適切に_N塩化アクリロイルとPCL-DAの合成中に使用されるのEt _{3 N、}より高いまたはより低いMとPCLジオールの量を調整することにより、それぞれ、架橋密度を減少または増加させるために利用されてもよいです。

溶融塩テンプレートは、プロトコル（ 図1）への重要な構成要素です。平均的な塩分のサイズが得られた足場の孔のサイズを決定します。説明した例では、平均的な塩の大きさは460〜±70でした＆＃181;メー...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ポリカプロラクトンジオール (Mn ~ 10,000 g/mol)	Sigma-Aldrich	440752
ジクロロメタン (DCM)	Sigma-Aldrich	D65100	4Aモレキュラーシーブ4
-ジメチルアミノピリジン (DMAP)	Sigma-Aldrich	D5640
トリエチルアミン (Et3N)	Sigma-Aldrich	T0886
塩化アクリロイル	Sigma-Aldrich	A24109
酢酸エチル	Sigma-Aldrich	319902
炭酸カリウム (K2CO3)	Sigma-Aldrich	209619
無水硫酸マグネシウム (MgSO4)	Fisher	M65
塩化ナトリウム (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888
2,2-ジメトキシ-2-フェニルアセトフェノン (DMP)	Sigma-Aldrich	196118
1-ビニル-2-ピロリジノン(NVP)	Sigma-Aldrich	V3409
タノール	Sigma-Aldrich	459844
ドーパミン塩酸塩	Sigma-Aldrich	H8502
トリス緩衝液(2mol/L)	Fisher	BP1759	10 mM濃度、pH = 8.5
Sieve	VWR	47729-972
で使用UV-トランスイルミネーター (365 nm, 25 W)	UVP	95-0426-02
遠心分離機	Eppendorf	5810 R
ダイナミックメカニカルアナライザー (DMA)	TA Instruments	Q800
高分解能スパッタコーター	Cressington	208HR
走査型電子顕微鏡 (SEM)	FEI	Quanta 600