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方法論記事

L-ロイシンメチルエステルを使用した小脳顆粒細胞培養物からのミクログリアの選択的枯渇

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DOI：

10.3791/52983

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2015年7月7日

 ,  , 
1Department of Neurology, University of Washington, 2Therapeutic Innovation Group, School of Life and Medical Sciences, University College London, 3Department of Neuroinflammation, University College London

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ミクログリアは、さまざまな非細胞自律メカニズムによって、培養中のニューロンや他のグリアに影響を与えることができます。ここでは、初代ニューロン培養細胞からミクログリアを選択的に枯渇させるためのプロトコルを紹介します。この方法は、ミクログリアとニューロンの相互作用の役割を解明する可能性を秘めており、神経炎症が特徴的な特徴である神経変性疾患にも影響を及ぼします。

要約

ミクログリアは、中枢神経系の免疫担当細胞に常在し、神経機能の調節と制御、および自然免疫の媒介において多面的な役割を果たしています。初代げっ歯類細胞培養モデルは、ニューロンとグリアの相互作用の理解を大きく前進させましたが、混合培養からミクログリアを特異的に除去する方法が利用されたのはごく最近のことです。そのような技術の1つ(ここで説明)は、マクロファージとミクログリアによって内在化されるリソモトロピック剤であるL-ロイシンメチルエステルの使用であり、リソソームの破壊とその後のアポトーシスを引き起こします13,14。L-ロイシンメチルエステルを用いた実験は、多様な培養条件下でのミクログリアの周辺細胞環境への寄与を明らかにする力を持っています。当研究室で最適化したプロトコールを用いて、P5げっ歯類の小脳顆粒細胞培養からミクログリアを除去する方法について解説します。このアプローチにより、ミクログリアが実験データに及ぼす相対的な影響を評価するだけでなく、脳卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病などの神経疾患の培養モデルにおいて、ミクログリアが神経保護的または神経毒性的な役割を果たしているかどうかを判断することができます。

概要

人間の脳は、推定850億のニューロンおよびグリア1を含むさらに850億非神経細胞を含みます。過去100年間の大部分のために神経科学者は、ニューロンのための構造的支持を提供した受動支持細胞より少しであることがグリア細胞を信じて、神経細胞集団に主に焦点を当てている - それ故に「グリア」のギリシャ語の語源は、英語に翻訳します「接着剤」。しかし最近では、それは、神経膠細胞の相互作用がはるかに根本的な神経生物学、神経生理学、および多くの神経変性疾患の発生および進行の基本的な側面になる可能性があることがますます明らかになりました。小脳顆粒細胞（CGCS）、ヒトの脳で最も豊富な均質なニューロン集団は、小脳を支配し、その細胞成分の90％以上を占めています。したがって、これらの細胞は、Tのためのモデル系として、in vitroで広範に使用されています彼は、神経発達、機能、および病理2-6の検討します。

しかし、CGC培養はまだ間違いなくかなりの割合でミクログリア及びその他のグリアが含まれています。その結果、推定される種々の細胞治療への直接神経細胞応答を表示するCGCデータは、実際に発生する可能性がある - 一部または全体で - 文化の中で、隣接するグリアの間接的な二次応答から。これを評価するために、我々は、選択的に、L-ロイシンメチルエステル（LME）の助けを借りてCGCニューロン培養物からミクログリアを除去しました。 LMEは、もともと選択マクロファージ7を破壊するために使用lysomotropic剤であり、以降も選択的神経、アストロサイト、および混合膠細胞培養8,9,10からミクログリアを枯渇させるために使用されてきました。 LMEは、リソソームを破砕した後、アポトーシス13,14を引き起こしており、マクロファージおよびミクログリアによって内在化されます。マクロファージおよびミクログリアは、彼らがparticulaであることを引き起こして、リソソームにおける特徴豊富ですLMEの治療に暴露されるとRLY脆弱。このプロトコルは、CGC、その他のグリア/ニューロンの培養系を利用した実験でミクログリアの貢献を把握するための強力な、まだシンプルで簡単な方法を提供します。

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プロトコル

本明細書に記載の全ての実験は、1986年の英国動物（科学的手続）法に基づいて実施しました。

楽器、文化メディア、および料理の作製

  1. 2つのステンレス鋼実験室解剖ハサミと2つのステンレス鋼実験用鉗子を準備します。紫外線下で培養フードO / Nですべての機器と場所をオートクレーブ滅菌用（UV）光。
  2. 最小必須培地（MEM）培地（10％ウシ胎児血清[FBS]、20mMの塩化カリウム、25mMのNaHCO 3を、30mMのD-グルコース、2mMのL-グルタミン、100 U / mlペニシリン、100 500mlのを作ります/ mlのストレプトマイシンおよび6 / mlのアンピシリン）とフィルター滅菌します。ヶ月間4℃で保存してください。
  3. 14ミリメートル、数1の厚さのカバースリップを含む24ウェル培養プレートを準備します。先に説明したように3 100 mg / Lのポリ-D-リジン（PDL）でカバースリップおよびコーティングをオートクレーブ。 UV光はO / Nを殺菌します。

CGC培養液の調製

  1. 処理されたオートクレーブ処理、UV光の「溶液A」（100ミリリットル）、グルコース250mgのを含有する無菌のdH 2 O、ウシ血清アルブミン[BSA]、リン酸緩衝生理食塩水[PBS]（のCa 2+の955 mgの300 mgを準備し、 MG）+自由、および3.8％の1ミリリットルのMgSO 4·7H 2 O
  2. 5 mg / mlのトリプシン溶液Aの9ミリリットル中に希釈し、1 mlを含む準備「溶液B」（10ミリリットル）
  3. 「溶液C」1000個のDNアーゼ、大豆トリプシン阻害剤0.5mgの、溶液Aで10mlに希釈した3.8％のMgSO 4·7H 2 Oの100μLを含む（10ml）に準備
  4. 溶液C 3.2 mlを含有する「溶液D '（20ml）を溶液Aで20mlまで希釈し、準備します
  5. ·7H 2 O EBSS、25mMのNaHCO 3を、3 mMの硫酸マグネシウムを含むBSA /アールの平衡塩溶液（EBSS）溶液を調製し、4％BSA、pH7.4中で、先に説明した3。
  6. 、150mMのLMEの最終濃度を得MEM培地5mlに純粋LMEを追加することによってLMEを調製する卓上pHメーターを用いてpH 7.4溶液を返し、フィルタ28ミリポリエーテルスルホン（PES）、0.2μmのシリンジを使用して滅菌フィルター。

3. CGCSを培養

  1. 以前に3を説明したように4-7日齢のラットの子から小脳を収集します。氷上で5ミリリットル溶液Aを含むペトリ皿に直ちに置きます。
  2. シャーレのふたで小脳と場所組織から余分な溶液を捨てます。
  3. 少なくとも三つの異なる方向によく燃え上がっかみそりの刃で細かく組織をみじん切りに。
  4. 5分間37℃の水浴中で溶液（失われた制限された組織を確保するために溶液でペトリ皿をすすぐ）B及び場所にみじん切り組織を加えます。静か分おきに振ります。
  5. トリプシン、手ぶれやセントを中和するために、チューブに溶液D（20ミリリットル）を追加5分間、65×gでrifuge。
  6. 上清を捨てます。
  7. 直径を小さくする3燃え上がっガラスピペットで十分に溶液C.トリチュレート4mlの（約10回ずつ）で再懸濁し、懸濁液をできるだけ均一になるまで。
  8. ゆっくり、ゆっくりとBSA / EBSSの上にこのホモジネートを数滴を追加します。それはBSA / EBSSを通じてシンクを開始した場合は、より多くを粉砕するおよび/またはもう少し溶液Cを追加ホモジネートは、BSA / EBSSの上の層に座ってする必要があります。振らないでください。 5分間100×gでスピン。
  9. 上清およびMEM培地1mlでペレットを再懸濁し（ソフト）を取り外します。
  10. MEM培地500μlの80万細胞/カバーガラスで血球計数器およびプレートを用いて細胞数を計測します。 6％CO 2で37℃のインキュベーターに入れ。
  11. 培地を翌日（分取した後24〜36時間）を変更します。細胞周期阻害剤のアラビノフラノシルシチジン（のAraC）の10μMを含むMEM培地の溶液を作ります。
    1. それぞれについてカバーガラスにして、再び細胞とトップまでの古い培地を250μlを追加、通常のMEM培地250μlを添加し、細胞を洗浄するために、これを吸引し、残りの部分を吸引、新鮮な24ウェルプレートに古い培地250μlのを保持のAraC含有培地250μlのと。
      注意：細胞は、 インビトロ （DIV） で 6日間使用することができます。

4.を選択ミクログリアを枯渇（6 DIVに出演）

  1. 150mMのLMEの最終濃度が得られるようにMEM培地の別々のアリコートを5 mlに純粋なLMEを追加します。
  2. pHを7.4に解決策を戻し、フィルターは28ミリメートルのポリエーテルスルホン（PES）、0.2μmのシリンジフィルターを用いて滅菌します。
  3. コントロール培養のための通常のMEM培地と共に10分間37°Cの水浴中でMEM培地と場所での50mM（2×LME）の濃度に溶液を希釈。
  4. CGC培養から半分（250μl）をMEM培地を除去し、37℃で保持します。
  5. 細胞を処理します、または対照培養のためのLMEのない予め温めたMEM培地（250μl）を、25 mMとウェル濃度を与える1： すなわち 2×LME（250μl）を含むMEM培地で1希釈しました。
  6. 1時間、6％CO 2の加湿雰囲気中、37℃で細胞をインキュベートします。
  7. 洗浄細胞を2回新鮮予め温めたMEM培地中のLME含有培地を除去し、その後、対応するウェルに保持された培地と新鮮予め温めたMEM培地を等量置き換えます。
  8. （37℃で6％CO 2の加湿）インキュベーターに文化を戻し、任意のさらなる処理の前に24時間休ませるままにします。

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結果

選択的CGCおよび/または混合培養物からミクログリアを排除するために、この技術の能力を正確に識別し、その周囲の細胞からミクログリアを区別するために、研究者のその後の能力に依存しています。 図1に示されるように、これは、例えば、イソレクチンB4として、マイクログリア特異的細胞マーカーを使用して達成することができる。 図2に示すように、星状細胞およびニューロンの密度および形態学に対する観察可能な変化は、各メイン処理群に対して記録されませんでした。培養物は、化合物のミクログリア固有のアクションをサポートし、単独LMEで処理した場合重要なことは、神経細胞またはアストロサイトの形態に有意な変化は観察されなかった。 図3（a）は、一次げっ歯類アストロサイト培養物12からアストロサイトの密度と形態の観察可能な変化を示さないが、ありません汚染ミクログリアの損失が表示されます。 図3Bにおいて、Aのように、変更なしastrocyでTE密度と形態が見られました。しかし、ミクログリア数および反応性の汚染...

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ディスカッション

CGCからミクログリアの成功選択的除去を確実にするために最も重要なステップおよび/または混合培養物は、1）滅菌し、健康CGC文化を維持します。 2）フィルタは、LME含有培地を滅菌し、pHを7.4に溶液を戻します。 3）37に保持CGC媒体とLME含有培地を維持 ヒートショックを回避するため°C; 4）細胞をインキュベーターの外に保持される時間を短縮するために迅速に取り組ん。

以前に我々の研究室で最適化された濃度 - 私たちは、CGC培養物からミクログリアを枯渇させるために、25mMのLMEを使用していました。それにもかかわらず、いくつかのミクログリアは、まだいくつかの差別化、非増殖ミクログリアの人口を反映している可能性が信じているLME処理を、以下の培養中に残っています。実際、ハンビーら （2006）50-75 mMのLMEが高密度星状細胞単層13からミクログリアを除去するために必要であったことを発見しました。また、純粋なミクログリアCのことが以前に示されていますultures、10mMのLMEはなく、わずか24時間...

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開示事項

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

この研究は、英国のAims2CureとUCL Impact Awardの博士号取得者によるJMPへの支援と、MRCの認知症能力開発博士課程によるJMPへの支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
鉗子 Sigma-AldrichF4142湾曲した端部は小脳の除去を容易にします 
マイクロ解剖ハサミSigma-AldrichS3146まっすぐで鋭い先端がげっ歯類のP4-7解剖を容易にします 
L-ロイシンメチルエステル塩酸塩Sigma-Aldrich7517-19-3
EBSS溶液 Sigma-AldrichE7510-500 ml
Poly-D-lysineSigma-Aldrich27964-99-4使用1日前のコートカバースリップ 
ウシ血清アルブミン(BSA)Sigma-AldrichA9418
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)Sigma-AldrichP4417
DNaseSigma-AldrichD5025
大豆トリプシン阻害剤 Sigma-AldrichT6414
マウス抗ED1抗体 アブカムab31630

参考文献

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