操作された血管柄マッスルフラップ

Summary

今日まで、厚い組織の欠陥は通常、自家組織フラップまたは人工組織を適用することによって再構築されています。このプロトコルでは、自家皮弁の代わりとして機能するために、自家椎弓根を持つ血管新生組織皮弁をエンジニアリングするための新しい方法を提示します。

Abstract

組織構築物の厚さとその結果としての生存率と生体内での適用性を制限する主な要因の一つは、細胞微小環境への酸素供給の制御です。これは、受動的な拡散が非常に薄い層に限定されているためです。腹壁の全層欠損の完全性を回復するためにさまざまな材料が説明されていますが、グラフト血管新生、組織拒絶反応、感染、または不十分な機械的特性のために、最適であることが証明された材料はまだありません。このプロトコルは、筋肉組織の再建に関連する厚さで、完全に血管新生されたフラップを設計する手段を説明しています。細胞に包埋されたポリL-乳酸/ポリ乳酸-co-グリコール酸コンストラクトは、マウスの大腿動脈と静脈の周囲に移植され、in vivoで1〜2週間維持されます。その後、血管新生された移植片は、腹部に作られた全層欠損に向かってフラップとして移植されます。この技術は、自家組織犠牲の必要性を置き換え、多くの外科的用途でin vitroで設計された血管新生フラップの使用を可能にする可能性があります。

Introduction

腹壁の欠陥は、多くの場合、重篤な外傷、癌治療、火傷、感染したメッシュを除去した後に発生します。これらの欠陥は、多くの場合、複雑な外科的処置を必要とし、プラスチック再建外科医^1-4のための主要な課題を提示し、重大な組織損失を伴います。人工組織のための新しいソースを求めている組織工学の研究者は、異なる材料、細胞源と成長因子が検討されています。設計組織の移植によるこのような気管^5,6、膀胱^7、角膜^8、骨⁹と皮膚¹⁰などの様々な組織の成功した修復は、以前に報告されました。しかし、太い血管が新生組織工学の製造は、特に大きな欠陥の再構築のために、組織工学における重要な課題です。

生存可能な組織構築物の厚さを制限する主な要因の一つは、その短所への酸素供給の制御でありますtituent細胞。拡散に依存する場合には、厚みが非常に薄い層に限定されている構築物。 生体内で酸素や栄養供給の毛細血管の間の最大距離は約200μmで、酸素^11,12の拡散限界と相関するです。不十分な血管新生は、組織虚血が生じ、組織の再吸収または壊死¹³にエスカレートすることができます。

また、組織の再構築に使用する理想的な材料は、生体適合性および非免疫原性である必要があります。また、生体材料による宿主細胞のさらなる統合を促進し、構造的完全性を維持することができなければなりません。様々な生物学的^14-16および合成^1,17,18行列は、以前に組織の再構築のために検討されている、しかし、彼らの使用は、効果的な血液供給、感染または不十分な組織強度の不足に限定されたまま。

本研究では、生体適合性、細胞EMB食品医薬品局（FDA）承認のポリL-乳酸（PLLA）/乳酸 - コ - グリコール酸（PLGA）、ポリで構成edded足場はヌードマウスの大腿動脈と静脈（AV）船の周りに移植したと唯一のAV血管から血管新生を確保し、周囲の組織から分離します。一週間移植後、移植片は、実行可能な厚さであり、十分に血管新生しました。 AV船でこの太い血管組織は、その後、同じマウスに腹部全層欠損に有茎フラップとして移しました。一週間後の転送、フラップは、実行可能な血管新生し、よく腹部内臓をサポートするために十分な強度をもつ、周囲の組織に統合されました。このように、自己の椎弓根ベアリング設計厚く、血管組織のフラップは、全層腹壁欠損を修復するための新規な方法を提供します。

Protocol

すべての動物実験は、テクニオンの動物実験の倫理委員会によって承認されました。この手順のために、無胸腺ヌードマウスを、免疫学的拒絶を回避するために使用しました。マウスの別のタイプを使用している場合、マウスは前にシクロスポリン（または他の抗拒絶代替）の外科的手順および管理に剃られるべきであることをお勧めします。

1.足場の準備および細胞埋め込み

1. 以下のようにして、ポリ-L-乳酸（PLLA）およびポリ乳酸 - コ - グリコール酸の1：1混合物（PLGA）：1からなる足場を準備します。
   1. PLLAの500 mgを、10mlのクロロホルム中のPLGA 500mgの溶解します。
   2. テフロン鋳型に集まっ塩化ナトリウム粒子の0.4 gのポリマー溶液0.24 mLを加え。 212から600ミクロンの塩径を使用してください。クロロホルムは、O / Nを蒸発することを許可します。
   3. 相互接続された多孔質3D足場につながる蒸留水を用いて塩を浸出。
   4. ポリマー部分をカットはさみを使用して、その後30分間、70％エタノール（v / v）の中に浸漬し、使用前に2分間、PBSで3回洗浄します。
2. （1内皮細胞培地（EGM-2は、10％ウシ胎児血清を補充し、その弾丸キット及び筋細胞培地（ダルベッコ最小必須培地（DMEM）の成分を補充したFBS：1で以下の細胞の三培養を準備）、2.5％HEPES緩衝液、100 U / mlペニシリン、および0.1mg / mlのストレプトマイシン（ペニシリン - ストレプトマイシン溶液）。
   1. 0.5×10 ⁶ C2C12筋芽細胞、0.9×10 ^{6個のヒト}臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）、および0.2×10 ⁶正常ヒト皮膚線維芽細胞（NHDF）を使用します。
3. メディアを吸引、4分間200×gで遠心チューブと遠心分離機で一緒に細胞を混合し、4μlの氷冷した細胞外マトリックス溶液と4μlの細胞培地の混合物中に再懸濁ペレット。
4. ×7ミリメートル×1ミリメートル（長さ×幅×厚さ）、PLLA / PLG 10mmの部分をカット足場とは、4 mlの細胞培地を添加する前（30分、37℃、5％CO _2）を 、6ウェルプレート中の細胞懸濁液を播種細胞外マトリックス溶液を固化することを可能にします。
5. 移植前10日間の足場をインキュベートし、一日おきに培地を交換してください。

2.外科手順を開始する前に

1. （オートクレーブ）は、次の手術器具を準備し、滅菌：小さな、罰金、ストレートはさみ、春のはさみ、ストレート、先の細いピンセット、鋸歯状の鉗子やニードルホルダー。
2. 425μlのケタミンおよび1mlシリンジで75μlのキシラジンを混合することにより、マイクロチューブ内キシラジンソリューション：ケタミンの混合物を準備します。
3. 滅菌生理食塩水（午前1時20分）で0.3 mg / mlのブプレノルフィンを希釈します。

3.フラップ建設（グラフト移植）

1. インスリン注射器を使用して、ケタミンの腹腔内注射によりマウスを麻酔：キシラジン（35μLあたり体重20 g）を得ました。
2. 皮下opperation前にブプレノルフィン（0.05〜10mg / kgの最終濃度）を注入します。
3. 正常な体温を確保するために、37℃に加熱したステージ上にマウスを置き、その後、粘着包帯を用いてマウスを確保します。
4. 綿のヒントを使用して、（脱水を避けるために）マウスの目に眼軟膏を潤滑管理します。
5. 無菌作業領域を確立するために、70％エタノールで、次いで、綿の先端を使用してヨウ素を切開部位をきれい。
6. 大腿動脈と静脈（AV）血管が露出するまで、膝のレベルから鼠径靭帯に、大腿血管に平行に小さなハサミとピンセットを使用して、皮膚を​​介して切開を行います。
7. 組織へのより良いアクセスを得るために、リトラクターを使用して皮膚を押したままにします。
8. 春のはさみとピンセットを使用して、慎重に周囲の組織から大腿動脈と静脈の血管を隔離します。鼠径LIGのレベルから開始します優れた上腹部血管の分岐部に知的障害者。足への血流を維持し、その後の虚血を防ぐために、手つかずの深層を残します。
9. 深在以下および脛骨とproneal AVに分岐上に、露出した大腿骨のAV周り（第1節）からの移植片を折り、そして8-0絹縫合糸を使用して、その端部に参加します。
10. 唯一の大腿骨のAV血管から発芽毛細血管によって血管新生インプラントを確実にするために、移植片の周りに滅菌ラテックスの作品、および6-0縫合糸で縫合糸を包みます。
11. 4-0絹縫合糸を使用して覆っている皮膚を閉じます。
12. 移植片は、フラップとして転送されるまで、麻酔から回復した後、毎日まで密接にマウスを監視します。皮下に2~3日間一日二回ブプレノルフィン（0.05〜10mg / kgの最終濃度）を注入します。
    注：露出した組織の脱水を避けるために、いずれかの段階で生理食塩水を使用してください。

4.フラップ転送

1. 1時か二週間の移植後は、ケタミンの腹腔内注射によりマウスを麻酔：キシラジン（35μL/ 20 g）を、インスリン注射器を用いて。
2. 皮下opperation前にブプレノルフィン（0.05〜10mg / kgの最終濃度）を注入します。
3. 正常な体温を確保するために、37℃に加熱したステージ上にマウスを置き、その後、粘着包帯を用いてマウスを確保します。
4. 綿のヒントを使用して、（脱水を避けるために）マウスの目に眼軟膏を潤滑に適用されます。
5. 無菌作業領域を確立するために、70％エタノールで、次いで、綿の先端を用いてヨウ素（膝部から腹部まで）切開部位をきれい。
6. 慎重にはさみを使用して、皮膚中の縫合糸を開いて、ハサミやピンセットを使用して、腹側皮膚を介して継続し、鼠径靱帯に皮膚パラレルを通して切開を作ります。
7. 慎重にピンセットでラテックス部分を削除して、血管新生したフラップを公開します。
8. scissを使用ORSと鉗子は、周囲の組織からの組織フラップを分析。
9. 鉗子やニードルホルダーを使用して、AVからの出血を防止するために、8-0絹縫合糸で大腿AVの遠位端を連結します。次に、遠位に折り畳まれた移植組織と8-0縫合糸に、膝のレベルでAVを焼灼。
10. 静かに全層欠陥がなされるべき距離で決定するために、動脈に損傷を回避、腹側腹壁に向けて、移植片に包ま大腿AVを転送します。
    注意：あまりにも遠く動脈を引っ張ることは動脈を損傷します。
11. 細かいハサミを使用して、腹側腹壁の切開を行います。
12. 春のはさみを使用して、腹直筋に切開を行います。覆っている皮膚で腹直筋の約1cm×0.8センチメートルのセグメントを削除します。
13. 腹abdomに全層欠陥に、軸方向のフラップとして、血管新生化移植片に包ま大腿AVを転送inal壁。
14. ヘルニアを防ぐために、8-0絹縫合糸を使用して、周囲の筋肉組織にフラップを縫合。
15. 腹筋にフラップを縫合する際に内臓を縫合回避するために、鉗子で筋肉を引き上げます。完全な腹壁欠損の効果を模倣するために露出した腹の皮膚を残します。
16. ヨウ素化ガーゼや露光部の汚染を防止するために、滅菌包帯で皮膚内の傷をカバー。
17. 4-0絹縫合糸を用いて、足の皮膚を縫合。
18. フラップの検索まで、麻酔から回復した後、毎日まで密接にマウスを監視します。皮下に2~3日間一日二回ブプレノルフィン（0.05〜10mg / kgの最終濃度）を注入します。
19. 注：露出した組織の脱水を避けるために、任意の段階で生理食塩水を使用してください。

グラフトの血管灌流の5超音波決意

注：転送する前に、血管灌流OF移植片は超音波検査により、移植後1〜2週間後に測定されます。

1. 2％イソフルランを用いてマウスを麻酔。
2. 正常な体温を確保するために、38℃に加熱した可動ステージ上でマウスを置き、その後、絆創膏を使用して、マウスを固定します。
3. Bモードに設定された非線形変換器を備えた大腿動脈と静脈の血管を検索します。
4. カラードプラモードに設定された変換器を使用して、移植片の大腿血管の開存性を調べます。
5. 製造業者の説明書に従って、非標的化造影剤を調製します。
6. 生理食塩水で満たした1mlシリンジに尾静脈カテーテル（27 G針12センチチューブ）を接続します。 （シリンジの動きを避けるために）加熱ステージ上でマウスの横に注射器を固定します。
7. マウスの尾静脈にカテーテルを接続し、針を固定します。
8. 注射は静脈に行われていることを確認するために両方と埋めるために生理食塩水の一部を注入（気泡を避けるために）生理食塩水チューブ。
9. 造影剤の70μlの1mlシリンジを記入し、造影剤シリンジで生理食塩水の注射器を交換してください。
10. 造影剤の画像注入に超音波を設定します。非線形モードのプロパティでフレームの30％に1500と破壊パルスにフレーム数を設定します。
    注：破壊パルスの後、マイクロバブルは毛細血管内のマイクロバブルの流量に依存し、マイクロバブルの注入速度とは独立した速度で、血管を再入力します。フレームの数は、充填時間^19,20に応じて変更することができます。
11. ゆっくり尾静脈内に造影剤を注入します。
12. 高解像度の超音波システムの非線形コントラストモードで画像を取り込みます。
13. 以前に^{19,20に記載されているように} 、ソフトウェアを使用して結果を分析します。
    1. 画像取得したIMに関心領域（ROI）を描きますコントラストモードで破壊パルス後mediately。 ROIは唯一、造影剤によって満たされた領域の輪郭を描く必要があります。
    2. ピークエンハンスメント（PE）を計算し、破壊パルスの後対マイクロバブルの注射後の非線形信号の平均強度の比であり、潅流量の尺度です。
    3. ピーク信号（P）までの時間（T）から決定された流量を、計算します。

グラフト血管新生の程度を6決意

注：組織移植片血管新生の程度は、1〜2週間移植後に決定されます。

1. インスリン注射器を用いて、ケタミンの腹腔内注射によりマウスを麻酔：キシラジン（35マイクロリットル/ 20グラム）。
2. 1mlシリンジを使用して、尾静脈内に10 mg / mlのフルオレセインイソチオシアネート結合デキストラン（FITC-デキストラン、MW =50万）の200μLを注入します。
3. 十秒の注入が完了した後、頚椎脱臼によりマウスを安楽死させます。
4. マウスの足を開いて、移植片を公開します。
5. リン酸緩衝生理食塩水（PBS）でグラフト領域を洗浄し、10％中性緩衝ホルマリンを適用します。
6. マウスの足の画像移植片を、共焦点顕微鏡を使用して。
7. 機能性血管密度（FVD）を定量化します。
   1. 共焦点顕微鏡画像の緑チャネル（励起= 488 nm）を分離します。
   2. 高コントラスト構造を強調するために、ハイパスフィルタを介して得られた画像を渡します。
   3. ハイパスフィルタによって増幅されている可能性があり、ノイズを除去するために、斑点除去フィルタを使用してください。
   4. 得られる画像のしきい値の値を設定します。元の画像内の特徴と構造が二値画像で表示されるように閾値が調整されます。
   5. サイズ閾値を適用するように定義されたSIZを超える連結画素のグループのみEしきい値はバイナリイメージのままです。
   6. 張-Suenのアルゴリズム^{21を使用して}移植片における血管の骨格を説明します。
   7. 各容器の中線の長さを合計し、ROIの面積で結果を分割してFVDを計算します。

移植の7免疫組織と組織染色

1. 免疫組織染色
   1. 共焦点イメージングの後、小さなハサミとピンセットを用いて、移植片を取り出します。移植片の両端にAV血管を解剖し、移植片を取り出します。
   2. 2時間 - 30分間、10％中性緩衝ホルマリン中に移植片を固定してください。
   3. パラフィン包埋まで70％エタノールで組織学カセットおよびストアに移植片を配置します。
   4. 標準の固定を使用して、プロトコル^{22を埋め込 ​​む}パラフィンに埋め込 ​​み、ミクロトームを用いて5μmの切片にパラフィン包埋組織をスライス。 AVに垂直に全組織をスライス船。
   5. 10分ごとに、二回100％キシレン中に浸漬してパラフィン包埋切片を脱パラフィン。
   6. 250ミリリットルのプラスチックコプリンジャーにスライドを配置します。
   7. 3分ごとに、エタノールの濃度（100％、96％、90％、80％、70％、50％、30％及び蒸留水（DDW））を減少させることで連続浸漬によって再水和します。
   8. DDW 250mLで抗原アンマスキング溶液を2.35ミリリットルを希釈することにより、抗原アンマスキング溶液を調製します。 95℃に設定し、電子レンジで2分間、抗原アンマスキング溶液を加熱します。
   9. 95℃に設定し、電子レンジで3分間、再び予備加熱抗原アンマスキング溶液と、熱にスライドを挿入します。 50℃にスライドを冷却します。
   10. 2分間、再び加熱し、室温まで冷却します。
   11. 内因性ペルオキシダーゼ活性をクエンチした後、PBSで2回リンスし、室温で、10分間、メタノール中_3.3％H 2 O ₂溶液にスライドをインキュベートします。
   12. インキュベーションチャンバーを準備します。場所濡れabso組織学ボックス内rbentシートとは、繊細なタスクワイパーを使用してスライドを乾燥させてください。
   13. 疎水性のペンを使用して、スライド上の円スライス領域およびヤギ血清の約50μlを、スライスごと（PBSで調製した2％）ブロッキング溶液で、RTで30分間インキュベートします。
   14. ブロッキング溶液中でウサギ抗CD31抗体1:50に希釈し、スライスあたり約50μlの抗体を適用し、4℃でO / Nを、インキュベートします。 PBSで3回、各5分洗浄します。
   15. スライドの上の場所、PBSでスライス当り抗体約50μLを400にし、室温で30分間インキュベートする。ビオチン化ヤギ抗ウサギ二次抗体を希釈1。
   16. PBSで3回、各5分洗浄します。
   17. 、PBS中で400スライスあたり約50μLを適用し、室温で、30分間、スライドをインキュベート：ストレプトアビジン - ペルオキシダーゼ1を希釈します。 PBSで3回、各5分洗浄します。
   18. メーカー＆＃によると、スライスあたり約アミノエチルカルバゾールを50μl（AEC）基板を適用します8217;の指示。反応を停止しDDWでスライドを浸し。
   19. 2分間マイヤーのヘマトキシリン​​溶液の約50μlのセクションを浸漬することにより、青色の中の核を染色します。静かに水に洗い流した後、マウンティング培地でのセクションをカバーしています。
   20. 二重盲検の手法を用いて、CD31陽性染色を定量化します。 CD31染色は茶色のシミのように表示されます。双眼顕微鏡下で40倍の倍率の視野で4-5異なるフィールドを選択してください。 CD31陽性のルーメンの数をカウントします。
       1. （両眼データによれば）フィールドの数とfieldareaでカウントルーメンの合計数を割ることによって足場あたりのCD31陽性ルーメンの平均数を計算します。
          注：適用される試薬量が全体の概説スライスをカバーするのに十分なものでなければなりません。
2. 組織染色
   1. 10％中性緩衝ホルマリン中に移植片を修正。
   2. 標準を使用して、パラフィンに埋め込む移植片固定と埋め込み手順。
   3. 10分間二回、100％キシレンに浸漬することによって、パラフィン包埋切片からパラフィンを除去します。
   4. 高速の100％イソプロパノールで再水和のために二回洗浄します。
   5. 高速洗浄回、95％エタノール。
   6. 水道水で3回洗浄します。
   7. 10分間ヘマトキシリン​​で浸します。
   8. 水道水で3回洗浄します。
   9. 2分間エオシンでImmere。
   10. 高速洗浄は二回、95％エタノールで脱水します。
   11. 高速回の100％イソプロパノールを洗います。
   12. 高速回100％のキシレンを洗います。
   13. 厚さ1.5mmのカバーガラスとDPX接着剤でカバー。
   14. 40X倍率の顕微鏡を用いた画像。

8.機械的特性評価

1. 小さなハサミとピンセットを用いて、移植片を取得します。
2. PBS中で移植片を洗浄します。
3. 移植片の幅と厚さを測定し、厚さを乗じた幅と断面積を計算します。
4. 米国水和した移植片の応力 - 歪み曲線を生成するために、テスト機器を電子。
   1. システムの引張グリップの間の移植片を取り付け、2グリップ（ すなわち 、最初の長さ）との間で最終的な長さを測定します。
   2. 失敗するまで、0.01ミリメートル/秒の歪率を適用します。
   3. 製造業者のプロトコルを使用して開発力と変位を記録します。
   4. MATLABでの応力 - ひずみ曲線を生成します。
      1. 最初の長さで割った変位に応じてひずみを計算します。応力は断面積で割った測定された力として算出されます。
      2. 応力 - ひずみ曲線の直線領域の傾き、曲線の極大点としての剛性を決定すると、極限引張強さです。

Results

in vivoでの移植片血管新生及び灌流

移植片は、従来の軸方向のフラップとしての転送に1〜2週間移植しました。 1と2週間後、移植では、移植領域の総観察は、生存および血管組織移植片を明らかにしました。これらの移植片は、FITCデキストランの尾静脈注射及び超音波測定によって証明されるように、免疫染色陽性のCD31（ 図1A）によって決定されるように、高度に血管新生であることが証明され、そして高度に灌流しました。多くの船はすでに1週間移植後、AV血管の近くに追加の週後に有意に上昇した数で観察されました。機能性血管密度（FVD）（ 図1B）のFITCデキストランベースの決意は、移植片は非常に1週間移植後で、かつ有意な変化は、 生体内で追加の週に行われたことがない血管新生されたことを示しました。血管開通および灌流が実証されました図1Cは、グラフト移植後ホスト大腿血管開通と整合性を確認した超音波イメージングによって（それぞれ^1、1〜2

Discussion

組織工学の進歩は、様々な組織タイプの再構築のための代替組織の需要を満たしています。 ^1,17,18合成および生物学的材料^14-16ならびに製作方法の様々なこれらの要求に対処する能力について評価されています。しかし、臨床ケアにおけるおよび組織工学の進歩にもかかわらず、全層腹壁欠損の回復が課題です。そのような大規模な欠陥の再構成のための十分な組織が ​​厚いと、（2）血管新生（1）であって、時間かけて^23（3）機械的完全性、および（4）生存能力を示さなければなりません。

ここでは、自家組織フラップの代替として機能することができ、厚い実行可能な、および血管組織のフラップを作成するためのステップバイステップの詳細なプロトコールを提示します。製造されたフラップは、2ステップで構築した：（1）PLLA / PLGA足場は、MOUのAV容器の周りに移植しましたSE後肢のみのAV船による血管新生を可能にするために、周囲の組織から分離します。 （2）作成した血管新生し、厚い組織のフラップはその後、全層腹壁欠損部に、その肉茎を務めたAV...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
小さな細いまっすぐなはさみ	ファインサイエンスツール(FST)	14090-09
春のはさみ	ファインサイエンスツール(FST)	15003-08
細い先端のストレート鉗子	サイエンスツール(FST)	11251-20
鋸歯状鉗子	ファインサイエンスツール(FST)	11050-10
ニードルホルダー	ファインサイエンスツール(FST)	12500-12
小型血管焼灼器	ファインサイエンスツール(FST)	18000-00
Duratears	Alcon	5686
Sedaxylan	Euravet	DJ03
Clorketam 1000	Vetoquinol	4A0726B
Buprenorphine	vetmarket	B15100
4-0 silk	sutures Assut sutures	647
6-0ポリプロピレン縫合糸	Assut縫合糸	9351F
8-0シルク縫合糸Assut	合糸	684568
インスリン注射器(6mm針)	BD	324911
Vevo 2100高解像度超音波システム	VisualSonics inc.
MS250 非線形トランスデューサ	VisualSonics inc.
マイクロマーカー非標的造影剤	VisualSonics株式会社	VS-11694
尾静脈カテーテル	VisualSonics inc.	VS-11912
Vevo 2100ソフトウェア	VisualSonics inc.
フルオレセインイソチオシアネート結合デキストラン	Sigma	FD500S
Matlab	Mathworks, MA, USA
Kimwipes	Kimtech	34120
antigen unmasking solution	Vector laboratories	H-3300
anti-CD31 antibody	Abcam	ab28364
ビオチン化ヤギ抗ウサギ(二次)抗体	ベクター研究所	BA-1000
ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ	ジャクソン	016-030-084
メイヤーのハマトキシリン溶液	Sigma-Aldrich	MHS-16
アミノエチルカルバゾール (AEC) 基質キット	Life technologies, Invitrogen	00-2007
Vectamount	Vector laboratories	H-5501