ナノ粒子の毒性試験のためのクッパー細胞の単離

サマリー

肝臓マクロファージは、Kupffer細胞と名付けられ、循環するナノ粒子の捕捉に関与しています。ここでは、Kupffer細胞単離のための高い細胞純度と高収率の方法について説明します。ここでは、修飾LDHアッセイを使用して、Kupffer細胞のカーボンナノチューブによって誘発される毒性を測定します。

要約

インビトロ nanotoxicological研究の大多数は、その実用性のための不死化細胞株を使用しています。しかし、不死化細胞株または初代細胞中でのナノ粒子の毒性試験からの結果は、in vitroアッセイのための一次細胞の使用を拡張する必要性を強調し、不一致を示しています。このプロトコルは、マウス肝臓マクロファージの単離、というクッパー細胞、およびナノ粒子の毒性を研究するためのそれらの使用が記載されています。クッパー細胞は、体内で最も豊富なマクロファージ集団であり、循環するナノ粒子の取り込みを担う細網内皮系（RES）の一部を構成します。ここで報告されたクッパー細胞の単離方法は、密度勾配上で精製し、2段階灌流法に基づいています。コラゲナーゼ消化および密度遠心分離に基づく方法は、Smedsrød らによって開発されたオリジナルのプロトコルから適合されています。ラット肝細胞のために設計さisolationおよび高い収率を提供し、クッパー細胞の高純度（> 95％）（14×10 ⁶マウス当たりの細胞まで）。この分離方法は、洗練された、または高価な装置を必要とし、したがって、複雑さと細胞収量の間の理想的な妥協点を表していません。重いマウス（35〜45グラム）の使用は、単離方法の収率を向上させるだけでなく、非常に門脈カニュレーションの手順を容易にします。 -CNTs F官能基化カーボンナノチューブの毒性は、変性されたLDHアッセイにより、このモデルで測定しました。この方法は、F -CNTsとのインキュベーション後のクッパー細胞膜の構造的完全性の欠如を測定することによって、細胞の生存率を評価します。 F -CNTsにより誘発される毒性は、単離されたクッパー細胞は、ナノ粒子の毒性試験のために有用であることを強調し、このアッセイを使用して、一貫して測定することができます。 nanotoxicologyの全体的な理解は、臨床の翻訳よりEFFIためのナノ粒子の選択を行うこと、そのようなモデルから利益を得ることができますcient。

概要

nanotoxicology研究の分野は、ナノ粒子の生物学的効果を特徴づけることを目的とします。 in vivoでの調査に基づいて、毒性試験は、最も正確な方法のまま。しかし、その使用は、コスト、労力と時間の要件¹によって制限されます。その試験した条件の数を拡張する-代替案としては、in vitroアッセイであるため、そのシンプルさとインビトロ試験プラットフォーム² に高スループットの開発の可能性を使用されています。ほとんどnanotoxicological研究は、不死化細胞株を用いたin vitro アッセイを用いて実施されます。しかし、in vivoでの毒性効果³に、これらの実験結果の外挿に関する懸念があります。実際には、不死化細胞株の特性は、それらが由来した組織、 例えば、遺伝的形質転換^4、鍵の形態学的特徴の劣化が著しく異なる可能性が5、携帯極性⁶などの炎症性メディエーター⁷の調節などの機能変化の損失。

クッパー細胞は、体内で最も豊富なマクロファージ集団であり、肝臓の類洞の壁の内側を覆うことにより、血液と直接接触しています。細網内皮系（RES）の一環として、これらのマクロファージは....

プロトコル

全ての動物実験は、関連するすべてのガイドライン、規制、規制当局に準拠して実施されました。実証されているプロトコルは、英国のホームオフィスの規制の指導と承認の下で実施しました

1.灌流および細胞コレクション（図1）

図1：肝灌流マウスを麻酔した後に、消化管は、横方向に門脈（PV）がアクセスできるようにするために、腹部の左側に移動します。 PVはすぐに肝臓内の任意の過剰な圧力を避けるために、破壊されるEGTA / HBSSソリューションと劣るveina静脈（IVC）の遅い流速（1-3 ml /分）を用いてカニューレを挿入します。灌流の最初の分以内、流速は徐々に7ml /分に増加させます。その完全な消化が達成されるまで、コラゲナーゼ溶液を、次いで、10 ml /分で灌流されます。

1. Prepaたての材料表に記載されているすべての試薬を再度。
2. EGTA（エチレングリコール四酢酸）/ HBSS（ハンクス液）溶液（マウス当たり50ml）と40℃で30分間、コラゲナーゼ溶液（マウス当たり100ミリリットル）を温めます。
3. 最初の70％エタノー....

結果

非精製実質細胞の数が一致したと（17単離を行った）は、マウスあたり10 ⁶ 8〜14×細胞の範囲でした。各マウスの単離は、16から28をプレートウェルに十分でした。トリパンブルー染色によって細胞生存率は、細胞生存率〜95％を示しました。クッパー細胞は、その不完全な接着形態（ 図4A）に関連し、37℃でのインキュベーションの30分以内に丸い形状を示しました。 4時間インキュベーションし、その後に、細胞を広げ、細胞クラスターを形成するために開始しました。

クッパー細胞は、その後、それらの純度および食作用活性を確認するために特徴付けました。細胞は、クッパー細胞の純度を証明するために、F4 / 80抗体で染色しました。フローサイトメトリー分析は、95％（ 図4B）の上にクッパー細胞の純度を示しました。細胞は、大きな粒子を取り込む能力を確認するために、1ミクロン蛍光ビーズ、メッキ後12時間、インキュベートしました。股関節を示したフローサイトメトリー分析Tクッパー細胞の85％以上が1ミクロンビーズ（

ディスカッション

次の手順では、高収率とクッパー細胞の高い生存率を達成することが重要です。無菌状態は、細菌および真菌の汚染の危険性を制限するために使用されるべきです。すべての器具は、使用前に滅菌する必要があります。試薬は、新たに単離手順を実行する前に準備する必要があります。

コラゲナーゼIVの選択は、低いトリプシン活性を有する、非常に重要です。同一の供給者からの異なるロットは、異なる酵素活性を有し、それらは、クッパー細胞の単離のために最も適切なバッチを選択するために、最初に比較する必要があるかもしれません。これは、細胞収量および細胞生存率を評価することによって判断することができます。また、同様の用途のために使用されているバッチを提供するために、サプライヤーに連絡することをお勧めします。一度使用するバッチを決定し、将来の使用のために予約。

カニューレ挿入手順は、トレーニングを必要とします。門脈と自信を持ってになるために、いくつかの動物の使用を計画カニューレ挿入手順。実践では、成功した挿管を容易に達成され、手続きは、一人で扱うことができます。重い動.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Euthatal(ペントバルビタールナトリウム)	Merial
CD1マウス	Charles River	-	マウスの体重は35〜45gの範囲で変化する必要があります。体重が急速に増加する(例:7週齢の雄CD1マウスの体重が35gを超える)ため、雄のCD1マウスの使用をお勧めします。また、高齢の動物の配送を手配するために、事前に動物の供給業者に連絡することをお勧めします。あるいは、動物を家に閉じ込めて、希望の体重にすることもできます。
HBSS(Ca2+ およびMg2+ フリー、重炭酸塩を含む)	ライフテクノロジーズ	14175-053	HBSSは Ca2+無料。
エチレングリコール四酢酸(EGTA)四ナトリウム塩	シグマ・アルドリッチ	E8145	EDTAも使用できますが、EGTAにはCa2+ 選択的にキレート化する利点があります。
HEPES(1メートル)	ライフテクノロジーズ	15630-056	100ミリリットル
コラゲナーゼIV型	ワージントン	CSL-4	コラゲナーゼの異なるバッチをテストするか、少なくとも製品が肝細胞の分離に適している必要があることをサプライヤーに言及することをお勧めします
低グルコースDMEM	シグマ・アルドリッチ	D5523	500ミリリットル
RPMI(ピルビン酸ナトリウムとグルタマックスを含む)	ライフテクノロジーズ	〒12633-012	500ミリリットル
ペニシリン/ステプトマイシン	ライフテクノロジーズ	15140-122	100 ml
シ胎児血清	ファーストリンク	60-00-850	500ミリリットル
トリパンブルー溶液	シグマ・アルドリッチ	T8154	100ミリリットル
シリカ被覆粒子溶液(パーコール)	GEホールトケア	〒17-0891-02	percoll®は非常に安定しており、数年間保管することができます
1x リン酸緩衝生理食塩水	ライフテクノロジーズ	10010-023	500ミリリットル
10x リン酸緩衝生理食塩水	ライフテクノロジーズ	70011-036	500 ml
ジメチルスルホキシド	フィッシャー	D/4120/PB08	500ミリリットル
LDHキット(CytoTox 96)	プロメガ	G1781	光から保護してください
DMEMフェノールレッドフリー	ライフテクノロジーズ	31053-028	500ミリリットル
F4/80抗体 (Alexa 488)	AbD Serotec	MCA497A488	希釈しないでください、フローサイトメトリーにきちんと使用
蛍光ビーズ	Sigma	L2778	ラテックスビーズ、アミン変性ポリスチレン、蛍光赤 1 ml
材料会社名		カタログ番号	コメント/説明
蝶採血セット(23 G / 305 mm長チューブ)	BD
シリンジフィルター (0.22 μm ブルーリム)	ミニサート	16534-K
遠心分離チューブ(50mlブルーキャップ)	BDバイオサイエンス、ファルコン	35 2070年
シャーレ(90×15mm)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	BSN 101VR20
100 μmセルストレーナー	BD	352360
蠕動ポンプ	ワトソン・マーロウ	SciQ 300	各使用の前後に、滅菌PBSと70%エタノールでチューブをすすぎます。
24ウェルプレート	コーニング	3526
96ウェルプレート	コーニング	3595
遠心分離機	Eppendorf	5810R
プレートリーダー	BMG Labtech	FLUOstar Omega
Serrefine 鉗子	Hammacher GmbH	Art.Nr.HSE 004-35 / Cat.Nr.221-0051	セレフィーン鉗子は、灌流処置中に鉗子を保持することなく、23G針でカニューレされた血管をクランプすることを可能にします。URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html)
フローサイトメトリーチューブ	BD Biosciences, Falcon
微量遠心チューブ (1.5 ml)	Elkay	000-MICR-150
Cell scraper	BD Biosciences, Falcon	353086	24ウェルプレートの細胞を掻き取るために、ハサミで刃の四肢を切断します。
試薬会社の名称		カタログ番号	コメント/説明
EGTA®(エチレングリコール四酢酸)/HBSS(ハンクス平衡塩溶液)液			0.5 mM EGTAおよび25 mM HEPESを含むHBSS。pHを7.4に調整します。灌流する肝臓ごとに50mlを準備します。
コラゲナーゼ溶液			100 UI/ml、15 mM HEPES、および 1% ペニクリン/ストレプタマイシン (v/v) のコラゲナーゼ IV 型を含む DMEM 低グルコース。pHを7.4に調整します。灌流する肝臓ごとに100mlを準備します。コラゲナーゼを追加した後、使用前に溶液を30分間温めることをお勧めします。これにより、コラゲナーゼ活性を最適にすることができます。
Kupffer細胞単離培地			RPMI含有、1%非必須アミノ酸(v / v)、1%グルタマックス®(v / v)および1%ペニクリン/ストレプトマイシン(v / v)。肝臓1〜3個分に少なくとも100mlを準備します。
Kupffer細胞培養培地			10%のウシ胎児血清、1%の非必須アミノ酸(v / v)、1%グルタマックスを含むRPMI®(v / v)および1%ペニクリン/ストレプタマイシン(v / v)。肝臓1〜3個分に少なくとも100mlを準備します。
SIP(等張コーティングされたシリカ粒子の溶液)			1.7 mlの10x Phosphate Buffered Saline と15.3 mlのPercoll®を混合して、17mLのSIPを取得します。
25%SIPソリューション			5 mlのSIPと15 mlの1xリン酸緩衝生理食塩水を混合します
50%SIPソリューション			10 mLのSIPと10 mLの1x Phosphate Buffered Salineを混合します
0.9% Triton X-100
新鮮なリン酸緩衝生理食塩水pH 7.4を1%ウシ血清アルブミンと共に調製します。