この記事では、マウスを用いた胃食道逆流症の手術手順を示します。これらのモデルは、胃食道逆流症のメカニズムと治療、そして潜在的なバレット食道と食道腺癌の研究に役立つツールです。
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この記事について
サマリー
要約
複数の手術処置が動物で胃食道逆流を誘発することが報告されています。ここでは、胃内容物、十二指腸内容物、または混合内容物の逆流を誘発することを目的としたマウスを用いた3つの外科モデルを報告します。手術処置と一般的な原則は詳細に記述されています。外科経験のある研究者は、短期間の実践の後でこの技術を把握できるはずです。手術後、ほとんどのマウスは生存し、ヒトと同様の逆流性食道炎を発症します。ただし、これらの外科モデルの固有の制限として、マウスとヒトの食道にヒストロジカルな違いがあることに注意する必要があります。バレット食道と腺癌の研究に使用される場合、これらの処置は遺伝子操作と組み合わせる必要があるかもしれません。
概要
胃食道逆流症（GERD）は、遠位食道が胃内容物または胃十二指腸内容物に長期間さらされることで引き起こされる慢性疾患です1。これらの有害な逆流性内容物に長期間さらされると、食道上皮内の固有の防御機能が損なわれ、食道炎2が生じます。バレット食道は慢性逆流の状況下で発生し、食道腺がん3,4のリスクが高い前がん性病変です。臨床的に重要であるにもかかわらず、GERD、バレット食道、および腺がんのメカニズムは十分には理解されていません。
動物モデルは、ヒトの疾患の病因、病理、分子メカニズム、予防、治療の研究に不可欠です。これまで、GERD、バレット食道、および腺がんのさまざまな動物モデルがモデル動物を使用して開発されてきました5,6。マウスの食道は層状扁平上皮で裏打ちされており、組織学的にはヒトの食道に類似しています。マウスの食道は角質化と粘膜下腺の欠如という点でヒトの食道とは異なりますが、比較的低コストでの維持と高度な遺伝子操作の可能性があるため、魅力的なモデル動物です。マウスでGERD、バレット食道、および腺がんをモデル化するために一般的に使用される2つのアプローチは、逆流手術と遺伝子操作です。逆流手術は逆流を誘発するのに最適な方法であり、遺伝子操作は分子レベルの変化を模倣します5,7。逆流手術は遺伝子操作と組み合わせて、疾患メカニズムをさらに理解することができます8。
多くの外科的処置が当方や他の研究者によって報告されています6,9：（1）胃内容物逆流：幽門結紮、幽門縛りおよび森林胃結紮、Wendel心形成術、および食道胃吻合術；（2）混合逆流：食道胃十二指腸吻合術、食道十二指腸吻合術（または食道空腸吻合術）；（3）十二指腸内容物逆流：食道胃十二指腸吻合術と胃切除；（4）化学成分逆流：胆汁性逆流、膵液性逆流、食道内注入；および（5）食道移植5。最近、マグネットを用いた空腸食道吻合術による小腸内容物逆流を生じるマウスの微小手術モデルが報告されています10。これらの外科モデルは、in vitroの細胞培養またはオルガノタイプ培養モデルよりも利点があります。in vitroでは、食道細胞は高い酸性度または高濃度の胆汁酸を含む培地に耐えることができません。in vitroで食道上皮細胞の変化を生じさせるために一般的に使用される非抱合型胆汁酸は、in vivoの十二指腸逆流性内容物には通常存在しません。したがって、このようなin vitro研究から得られた結論は慎重に受け止める必要があります。
マウスの食道に対する手術は、その小さなサイズのため技術的な課題です。術後の生存率が低いため、特定の標本サイズを必要とする実験で統計的に有意な結論を得ることはできません。過去には、長期実験で胃内容物逆流、混合逆流、および十二指腸内容物逆流の外科モデルを開発し、特徴付けることに成功しています9,11,12。また、他の研究グループのマウス手術についてもコンサルティングを提供しています。ここでは、これらのモデルを研究室で確立するために、マウスにおける3つの外科的処置について説明します。
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プロトコル
全ての動物実験は、施設内動物管理使用委員会により承認されています。
1.マウスの準備
- 体重や手術の時代に〜6週間以上〜20グラムの上にマウスを使用してください。
- 手術前に、マウスを実験用固形飼料および水を自由に与え、12時12分時間の明暗サイクルで維持しています。
- バリカンで手術領域を剃ります。 80ミリグラム/ kgのケタミンおよび12 mgの/ kgのキシラジンの腹腔内注射によりマウスを麻酔。この用量は、数分で眠りにマウスを置くと、次の外科的処置のための十分な麻酔を提供します。
- フットパッドが挟まれたときに角膜反射と四肢後退の欠如に基づいて、適切な麻酔を確認してください。乾燥を防ぐために、目に眼軟膏を潤滑に適用します。
- ベタジン溶液で皮膚を滅菌します。
2.胃逆流モデル（図1B）
- アッパーを作ります肛門を指して剣状突起から始まる1〜2センチ正中切開。
- 正中線を通って腹腔を開きます。ハサミで露出を高めるために、剣状突起を外します。
- セパレート、肝臓と胃の間の結合組織をカット。眼底まで完全に解放するために脾臓および眼底間の維管束を連結し、カット。
- 少し左に眼底を回し、フィールドに胃食道接合部の左側を公開します。上皮を公開するために、鋭いハサミを使用して遠位食道に沿って筋肉の5ミリメートル縦切開を行います。
- 同じ方向（切開1、 図1B）に沿って上皮を開いてカットします。シャープな操作ハサミで胃のほとんどを遮断するために胃（切開2、図3、図4、 図1B）の3つの切開を行います。胃が空でない場合は、慎重に胃内容物を除去します。
- 8-0プロレンスツ語を配置再正確な粘膜とポイントを介して（胃の）（食道上）と点A '（テーパ点針で）反対粘膜します。同様に、それぞれ、点Bと点B 'を介して縫合糸を配置し、ポイントの他のペア。均等にスペースこれらの縫合糸互いに3〜4ミリメートル。
- 血液や胃内容物をクリーンアップするために生理食塩水で腹腔を洗浄します。絹縫合糸で腹壁と金属製のクリップで皮膚を閉じます。
3.混合還流モデル（図1C）
- フォローは胃食道接合部を露出させるために2.4から2.1を繰り返します。
- ゆっくり食道の後ろの血管から食道の背側を分離します。食道と血管との間の小さな綿棒を渡します。
注：コットンは、部分的にそのサイズを減少させるためにチップから除去することができます。これは綿の先端が食道を持ち上げ、血管を保護し、2つの目的があります。 - 2 5ミリメートル縦株式会社を作ります胃食道接合部とシャープな操作ハサミで幽門に隣接する十二指腸の近位端にisionsそれぞれ。十二指腸の切開は、血管を避け、抗腸間膜の国境に配置します。
- 中断8-0プロレン縫合糸で反対粘膜ために正確な粘膜に切開を吻合。通常前面に背側の3-4縫合糸および2-3縫合糸を配置します。
- 綿棒を削除します。通常の生理食塩水で腹腔を洗浄し、腹壁と皮膚を閉じます。
4.十二指腸還流モデル（図1D）
- 混合逆流を生成するために、3.4から3.1のステップに従ってください。
- 慎重にその裏面を露出させるために胃を持ち上げます。肝臓の葉は、肝臓と胃の背面との間に結合組織によって捕捉することができます。慎重に結合組織をカットし、適切に肝臓を保護し、食道の背側の血管を露出させます。
- で連結され、血管を切りました。胃食道接合部で食道を連結し、カット。
- 幽門で十二指腸を結紮。腸間膜を連結し、カット。胃全体を削除します。
- 通常の生理食塩水で腹腔を洗浄します。腹壁および皮膚を閉じます。
5.後の外科的治療
- 手術後に加熱パッドで体温を維持。のみ胸骨横臥位を取り戻した後、他の動物とバックマウスを置きます。
- 感染を予防し、痛みを緩和するための抗生物質や鎮痛剤を与えます。鎮痛剤としての感染を予防するバイトリル（3日間の10mg / kg、腹腔内、QD）、及びブプレノルフィン塩酸塩（0.05ミリグラム/ kg、皮下、入札 。2日間）を注入します。断食は、手術後の必要はありません。
液体またはソフト食事を与えられてもよいです。 - 毎日basis.Ifの一般的な健康状態を評価するマウスは、以下の兆候（劇的な体重減少> 15％、アプリの欠如を示しますetite、発声、口、鼻や目からの排出、猫背ジェスチャー、非アクティブ、異常なグルーミング活性）、マウスを安楽死させます。
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結果
ほとんどのマウス（> 95％）が手術に耐えることができます。周術期の期間中、死亡の主要な原因は、麻酔薬の過剰摂取、出血および未知の理由があります。
手術後4週間は、>十二指腸逆流と胃逆流または混合逆流および> 80％のマウスを用いた90％のマウスが生存することができます。この期間中、マウスは主に食道狭窄と食べることができないことで死にます。これらのマウスは、重度のストレス（猫背の姿勢、非アクティブ、嘔吐、くぼんだ目、発声など ）の兆候を示し、安楽死させる必要があります。通常、抗生物質や点滴での医療処置が死んでから、これらのマウスを保存することはできません。マウスは通常、手術後グラムのカップルが十二指腸逆流と特にを自分の体重を失います。それにも関わらず体重が回復すると、後に増加します。
フォーティ週間手術後、十二指腸逆流と胃と混合逆流および> 70％のマウスと> 80％のマウスが生存することができます。長調この期間をる、いくつかのマウスは、栄養不良または未知の理由で死ぬことがありま...
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ディスカッション
様々な外科モデルは、げっ歯類で胃、十二指腸および混合逆流を模倣するために設立されました。ここに述べた3つの手順は、術後生存のリーズナブルな料金との長期的な実験に適しています。手術経験を持つ研究者は練習の短い期間の後に技術を把握することができるはずです。
出血は、手術前に麻酔薬の腹腔内注射から肝臓、胃、および血管の偶発的な損害との間に結合組織の分離の間、肝臓の裂傷を生じる可能性があります。これは可能な限り避けるべきです。バッテリ駆動のミニ焼灼は、適切な場合に出血を止めるために使用されてもよいです。器官および組織が操作されたときに過度の延伸は可能な限り避けるべきです。ピンセットの先端が綿で包まれてもよく、または綿のヒントは、ピンセットを交換するために箸のように使用することができます。マウスの食道は、2層または2＆＃を持っています8220;チューブ」、外側の赤みを帯びた「筋肉チューブ」と内側白っぽい「上皮チューブ」。切開が食道に行われると、両方の層を切開する必要があります。縫合糸は均等に反対粘膜ために正確な粘膜に間隔を置いて配置する必要があります。狭窄は、縫合糸の間の狭い距離に起因し開発...
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開示事項
著者のうちの1人（XC）は、テイカ製薬工業株式会社から胃食道逆流症に関連する基礎研究を支援する資金を受け取りました。この記事で使用されている試薬や機器は、この会社が製造したものではありません。
謝辞
私たちは、中国国家自然科学基金（NO. 81400590）、米国国立衛生研究所（U54 CA156735）および武田薬品工業株式会社（MA-NC-D-156）からの研究助成金によって支援されています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Dumont #1 Forceps Dumostar Tip | ロボズ外科器械会社 (メリーランド州ゲイザーズバーグ) | ||
| Micro Clip Applying Forceps 5.5" | ロボズ外科器械会社 (メリーランド州ゲイザーズバーグ) | ||
| Bonn Scissors 3.5" Straight 15 mm Sharp/Sharp Tungsten Carbide Blades | ロボズ外科器械会社 (メリーランド州ゲイザーズバーグ) | ||
| Operating Scissors 5.5" Straight Sharp/Sharp SureCut | ロボズ外科器械会社 (メリーランド州ゲイザーズバーグ) | ||
| 4-0 Silk Black Braid 100 Yard Spool | ロボズ外科器械会社 (メリーランド州ゲイザーズバーグ) | ||
| Surgeon's Needle 1/2 Circle Cutting Edge Size 12 (25 mm Chord Length) Pack 12 | ロボズ外科器械会社 (メリーランド州ゲイザーズバーグ) | ||
| Halsey Needle Holder 5" Smooth | ロボズ外科器械会社 (メリーランド州ゲイザーズバーグ) | ||
| Micro Needle Holder 5.125" Curved Lock.6 mm | ロボズ外科器械会社 (メリーランド州ゲイザーズバーグ) | ||
| Reflex 9 mm Wound Clip Applier | ロボズ外科器械会社 (メリーランド州ゲイザーズバーグ) | ||
| Reflex 9 mm Wound Clips Box Of 100 | ロボズ外科器械会社 (メリーランド州ゲイザーズバーグ) | ||
| PRONOVA Poly (hexafluoropropylene-VDF) Suture 8-0 | エチコンUS, LLC | ||
| リンガー液 | ヘンリー・シャイン株式会社 | ||
| ケタミン | ヘンリー・シャイン株式会社 | ||
| キシラジン | ヘンリー・シャイン株式会社 |
参考文献
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