方法論記事

振動圧力潅流装置内のラット肝臓の脱細胞化のための手順

DOI：

10.3791/53029

⸱

2015年8月10日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1General, Visceral, and Transplantation Surgery, Charité – Universitätsmedizin Berlin

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

私たち独自のデバイスを使用した肝臓採取、カニューレ挿入、灌流のための提示された技術は、ラット肝臓の脱細胞化と再細胞化実験を改善するための洗練された灌流セットアップを可能にします。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

実質臓器の脱細胞化と再細胞化は、in vitroでの機能的な臓器の生成を可能にする可能性があり、げっ歯類の肝脱細胞化のためのいくつかのプロトコルがすでに発表されています。私たちは、門脈や肝動脈を介した選択的灌流を可能にする独自の灌流装置を構築することにより、脱細胞化プロセスの改善を目指しました。さらに、振動する周辺圧力条件下で灌流を行うことで、脱細胞化の均一性を向上させることを目指しました。灌流脱細胞化の均質性は、これまで過小評価されてきた要因でした。脱細胞化中、灌流が不十分な臓器内の領域にはまだ細胞が含まれている可能性がありますが、灌流が良好な領域の細胞外マトリックス(ECM)はすでにアルカリ性洗剤の影響を受けている可能性があります。振動する圧力変化は、呼吸中に発生する腹腔内圧力変化を模倣して、肝臓内の微小灌流を最適化することができます。ここで紹介する研究では、脱細胞化ラットの肝臓マトリックスを組織学的染色、DNA含量分析、および腐食キャスティングによって分析しました。肝動脈を介した灌流は、門脈灌流よりも均質な結果を示しました。振動圧力条件の適用により、灌流脱細胞化の有効性が向上しました。肝臓を肝動脈を介して灌流し、振動圧力条件下で灌流した肝臓は、最良の結果を示しました。当社独自のデバイスを使用した肝臓採取、カニューレ挿入、灌流の提示された技術により、ラット肝臓の脱細胞化および再細胞化実験を改善するための高度な灌流セットアップが可能になります。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

脱細胞化および再細胞化は、in vitro 1 における機能性、移植臓器の生成を可能にすることができます。器官からの細胞および抗原性物質（ 例えば 、DNA、α-GALエピトープ）を除去することにより、以下の非免疫原性細胞外マトリックス（ECM）を得ることができます。この行列は、臓器の三次元ミクロ解剖学を節約し、別の、おそらく異種起源2の細胞を用いた再増殖のための理想的なバイオマトリックスとして機能することができます。このように、脱細胞化ラット肝臓マトリックスは、ヒト肝細胞で再増殖することができます。このヒト化マイクロ肝臓疾患の研究のために（ 例えば 、先天性代謝性疾患、ウイルス性疾患または悪性腫瘍）または前臨床医薬品試験3のためのex vivoでのモデルとして役立つことができます。

ラット肝灌流脱細胞化するためのいくつかの異なるプロトコルは、すでに4-13を公開されています。すべてのプロトコルでは、decellular化は、カニューレを挿入し、門脈を介してアルカリイオン性または非イオン性界面活性剤の灌流によって達成されました。我々の知る限り、我々は門脈および/ ​​またはラットの肝動脈14を介して選択的灌流によりラット肝脱細胞化を報告する最初のグループでした。肝臓内の異なる血管系の選択的灌流を有効にすると、よりよい脱細胞化した結果を可能にして、さらに、細胞再生に重要な役割を果たしている可能性があります。

ここで詳細な研究では、肝臓は、振動圧力条件下で灌流を可能にする、カスタムメイドの独自の灌流装置で灌流しました。これらの圧力条件は、肝臓の生理的な呼吸器依存灌流を模倣する： その場で 、肝臓は動き、呼吸時の肝灌流に直接影響を与え、振動板のコピュラの下でハングアップします。インスピレーションは、具体的に最適化し、肝臓の振動板と絞りの低下につながります肝静脈流出が、一方、有効期限は、肝臓の上昇とポータル静脈流入15を最適化するために、腹腔内圧の低下につながります。

私たちの目的は、振動圧力条件は、ex vivoでの腹腔内条件を模倣することによって、ラット肝灌流脱細胞化の均一性に影響を与えるかどうかを評価することでした。脱細胞化プロセスの均一性は灌流脱細胞化で過小評価要因になることがあります。 ECMに肝臓の脱細胞化の原因の変更のために使用されるすべての知られている薬剤。他の領域がすでに完全に脱細胞化されているのに対し、乏しい灌流領域の細胞は、ECM内に残ります。残りの細胞を溶解するために、灌流期間または圧力が十分に灌流領域に複数の変化を引き起こし、上昇する必要があります。このように、脱細胞化のための界面活性剤は、臓器内に均一に分布されるべきです。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

/ 0365レッグ号のO;動物は、実験医学（FEM、シャリテ、ベルリン、ドイツ）のための施設で維持し、全ての実験プロトコルが見直され、健康と地方事務のステートオフィス（LAGeSo、ベルリン、ドイツによって承認されました。 11）。

1.肝臓の収穫

  1. 手術前の準備
    1. 固定のためにコルク板を使用してください。プレートに医療ドレープを入れてください。 4針を使用して、術中の吸入麻酔のためのコルク板に吸入マスクを固定します。
  2. ポータル静脈カニューレの前準備
    1. 三方活栓に末梢静脈カテーテル（G 20）を接続します。静脈カテーテルは、約の長さで、斜めにカットされるべきです。 1.5センチメートル。
    2. デ空気リンゲル液を充填した10mLのシリンジを使用してシステム。ガス塞栓症が否定灌流脱細胞化に影響を与える可能性があるので、慎重に脱空気に非常に重要です。
  3. 談合動脈カニューレの
    1. 蝶のカニューレを使用し、5mmの長さに針をカット。 5ミリメートルの針にし、瞬間接着剤で固定し、5cmの管（外径0.96ミリメートルID 0.58ミリメートル）を取り付け。大きなチューブにし、瞬間接着剤で固定し2センチ長い管（OD 0.61ミリメートルID 0.28ミリメートル）を挿入します。
    2. アバットメントとしてこの構造の上に別のチューブをスリップし、瞬間接着剤で固定します。デ空気リンゲル液を充填した5mLのシリンジを用い動脈カニューレ。
  4. 麻酔や鎮痛
    1. 1.5 L /分の流量で酸素3.5％イソフルランによる麻酔誘導チャンバー内のラットの麻酔を誘導します。
    2. 動作中に安全な鎮痛を確保するために、腹腔内にメタミゾールた（100mg / kgの体重）及び低用量のケタミン/メデトミジン（10mg / kgの体重あたり0.1 mg）を注入します。
    3. 外科麻酔法のその後のメンテナンスのための吸入マスクを介して1リットル/分の酸素中の1.5％イソフルランを供給する。
  5. 術前アレンジメント<オール>
  6. 電気せん断機で自由に腹部を剃ります。消毒用の70％エタノールで腹部に剃毛切開部位を湿ら。
  7. 、準備されたプレート上に仰臥位で動物を置き吸入マスクにヘッドを挿入し、医療テープとピンと手足を固定します。ガーゼ湿布で過剰のエタノールや毛皮を削除します。
  • 麻酔評価
    1. 呼吸数を見て、麻酔の深さを評価します。麻酔は（40〜60呼吸/分）十分な深思わ場合には、鎮痛は、両方の後肢の足の指の間の皮膚を挟ま手術用鉗子を使用して、つま先のピンチ反射をトリガーしようとすることで十分であるかどうかを確認してください。
  • 腹部アプローチ
    1. 膀胱上記尾腹壁に正中切開を行います。 V字状に両側肋骨のアーチには、この点からカット。振動板に切断しないように注意してください。胸の上にカット腹壁を引き出します。
      2. 、オーバーホルトクランプで剣状突起を修正頭側に引き、ゴムバンドで固定します。腸を排出するために湿った綿棒を使用してください。濡れたガーゼ包帯で腸を包みます。また、濡れた包帯を持つすべての腹部のマージンをカバーしています。
  • 肝臓の準備
    1. 鎌状靭帯を解剖。頭側振動板のドームの下で内側と左肝葉を保持するために、湿ったガーゼの包帯を使用してください。肝十二指腸間膜および上部大網肝葉を公開します。
    2. ローブが携帯するまで慎重に上部大網葉に付着した靱帯を分析するために、2つのマイクロピンセットと春のはさみを使用してください。代わりに、内側と左葉を保持する、ガーゼ湿布の下ウェット綿棒を使って葉を移動します。
    3. 上部の大網肝葉の動員後、左に胃を移動します。クランプで胃を修正して、マイクロピンセットと春のはさみとマイナー大網を分析。
    4. 下omentumの複数形を動員L肝葉、モバイルであり、その後、その空洞内にバックローブを移動するまで。十二指腸を保持するために、バックハウスクランプを使用してください。ストレッチや肝十二指腸間膜を露出させるために左に十二指腸を移動します。延伸肝十二指腸間膜内の総胆管を取り囲みます。
    5. 脂肪および膵臓組織からの胆管を解剖。胆管分岐部から胆管1.5センチカット。周囲の脂肪組織から門脈を分析。胃十二指腸静脈を露出させます。
    6. シルク6-0で二回、胃十二指腸静脈を結紮し、2合字間の静脈を分割。すべての動脈枝が明らかにされるまで、周囲の組織から腹腔動脈と総肝動脈を解剖。
    7. 周囲の組織から胃十二指腸動脈を解放。互いに離れタイで、絹6-0で二回胃十二指腸動脈を結びます。 2合字の間に胃十二指腸動脈を解剖。
    8. 脾動脈を解放周囲の組織から。互いに離れタイで、絹6-0で二回脾動脈を結びます。 2合字の間に脾動脈を解剖。
    9. 周囲の組織からの左胃動脈を遊離。互いに離れタイで、絹6-0で二回、左胃動脈を結びます。 2合字間動脈を解剖。
    10. 右腎と右横肝葉の間の下大静脈を囲みます。後腹膜腔からの静脈を解剖。腹腔動脈に従うことによって大動脈を露出させます。
    11. 後腹膜脂肪組織を解剖。下大静脈に1ミリリットルの生理食塩水で千IEヘパリンを注入します。カニューレを撤回し、綿パッドで切開を閉じます。ヘパリンの全身的な効果のために1〜2分待ってください。
    12. ピンセットで大動脈を囲みます。大動脈を解剖し、ラットを放血。また、腎臓から遠位下大静脈を解剖。
  • 門脈カニューレ挿入（セクション1.2で調製したカニューレを使用してください）
    1. 遠位門脈魚口切開を行います。鉗子で切開を開き、門脈にカニューレを挿入。肝臓脱色するまで20ミリリットルリンゲル液で肝臓をフラッシュし、合字（絹6-0）でカニューレを固定します。
  • 動脈カニューレ挿入（セクション1.3で調製したカニューレを使用してください）
    1. 腹腔動脈上記の大動脈を解剖。後腹膜腔からの大動脈セグメントを解放します。大動脈パッチを生成するために、縦方向に大動脈セグメントをカットします。静的ホルダーに自作のカニューレを挿入します。
    2. カニューレを介して大動脈パッチをスリップする2ピンセットを使用してください。カニューレ上のシルク6-0と肝動脈を結紮し、突合せ部でパッチを修正。
  • 肝外植
    1. 、絞りを開いた円形の切開を行い、周囲の構造から肝臓を分析。
  • ストレージ
    1. STO使用するまで350ミリリットルリンゲル液で満たされた500mlの滅菌槽内の肝臓再。

    • 2.洗剤溶液

    1. 10％トリトンX-100の原液
      1. 900ミリリットルの水ビデと千ミリリットルのボトルを埋めます。 、100mlのトリトンX-100（99.9％）を追加します。トリトンX-100を溶解するために撹拌機を使用してください。水ビデでボトルを埋めます。千ミリリットルの全容量に達するまで。
    2. 1％トリトンX-100
      1. 千ミリリットルボトルにストック溶液100ml（10％）を加えます。 900ミリリットルの水ビデを追加します。二回ボトルを振ります。滅菌フィルターを介して、1％トリトンX-100液をフィルタリングします。
    3. 10％SDS原液
      1. 900ミリリットルの水ビデと千ミリリットルのボトルを埋めます。および66.99グラムのSDS（99.9％、密度0.67）を追加します。 SDSを溶解するために撹拌機を使用してください。水ビデでボトルを埋めます。千ミリリットルの全容量に達するまで。
    4. 1％SDS
      1. 千ミリリットルボットにストック溶液100ml（10％）を追加TLE。 900ミリリットルの水ビデを追加します。二回ボトルを振ります。滅菌フィルターを介して、1％SDS溶液をフィルタリングします。

    3.脱細胞化

    1. 潅流装置のセットアップfigure-protocol-1

    図1：発振の圧力条件の下で選択的動脈、フォーラット肝臓の門脈灌流のための灌流装置のスキーム （Struecker ら 14から変更されました。）。

    1. 三方活栓および充填レベルを調節し、500ミリリットル0.9％NaClで反応器に充填するハイデルベルグの拡張子にドレインをリンクします。
      figure-protocol-2

    図2：（4）門静脈アクセスを介して気泡トラップ（5）（2）または動脈を介して交流先端に灌流セットアップスキーム灌流チャンバーのリンク（1400センチメートル3）（1）セス（3）。気泡トラップは、（5）先端の閉塞（4）とベント（6）を装備する必要があります。ハイデル拡張（7）に気泡トラップ（5）を接続します。ポンプセグメント（8）にハイデルベルグの拡張子をリンクします。また、別のハイデルベルグ拡張（9）にポンプセグメント（8）を接続してください。界面活性剤溶液（10）のボトルに最後のハイデル拡張（9）を挿入します。 （または複数の灌流の場合には圧力分配器）灌流チャンバーに人工呼吸器（11）を接続します。原子炉流体を排出するために、廃棄ボトル（12）への流出を接続します。

    1. ポンプ内にポンプセグメントを挿入します。 PBSでサイクルを埋めるためにポンプを起動し、気泡トラップの先端を閉じて、通気口を開きます。泡の底部がしっかりとPBS（2-3センチ）で覆われている場合には、通気孔を閉じて、気泡トラップの遠位端を開きます。
    2. 肝臓のインストール
      1. 関連リアクターアクセスに門脈カニューレの三方活栓をリンクします。 C言語動脈アクセスに動脈カニューレONNECT。全く空気がシステムに入らないことを保証するために注意してください。
    3. 振動の圧力条件の適用
      1. 15 BPMの周波数と26ミリバール（分4ミリバール、最大30ミリバール）の振幅と呼吸器を使用してください。圧力分布室に呼吸器を接続し、反応器に、チャンバを接続します。圧力アプリケーションを起動します。
    4. 脱細胞化プロトコル
      1. /分5ミリリットルの流量で灌流手順を実行します。 90分間、1％トリトンX-100と肝臓の灌流に脱細胞化を開始します。灌流チャンバーを一定の内側と灌流肝臓上記流体レベルを維持するために潅流装置の流出を介して廃棄物の流出を可能​​にします。 90分後、1％SDSに界面活性剤を変更します。
        figure-protocol-3
        figure-protocol-4

    図3：すべての実験グループの灌流プロトコル。

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    結果

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    均一性、したがって異なる脱細胞化プロトコルの有効性を肉眼観察し、組織学的分析、及び脱細胞化肝臓行列内の残りのDNA含量の分析によって評価しました。また、腐食鋳造は脱細胞化後の肝臓の無傷のミクロ解剖学を視覚化するために実施しました。

    肉眼検査

    脱細胞化の間に、肝臓は、携帯コンテンツの削除を示す、ルーセントとなります。門脈を介して灌流肝臓を脱細胞化中および後に肉眼で見える残っている細胞（白矢印）で、不均一な解明（従って、脱細胞化）を示しました。肝動脈を介して灌流肝臓は、より均質な脱細胞化の過程と目に見える残りの細胞を示しました。肝臓を振動圧力条件を適用して灌流した場合、残りの細胞は関係なく、灌流経路の、見えませんでした。

    figure-results-1
    図4：圧力条件を振動することなく、ラット肝脱細胞化の肉眼結果 。左：肝動脈を介して脱細胞化ラット肝臓...

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    ディスカッション

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    ラット肝収穫と脱細胞化のための提示の技術を容易に再現可能であるが、考慮すべき特定の重要なステップがあります：

    それは血液凝固を活性化し、肝臓内の血栓形成につながる可能性があるため、肝臓収穫の準備中に、重度の出血を回避することが重要です。私どもの意見では、門脈を介して灌流の間、肝動脈を介して血液流入を回避するために、門脈のカニューレ挿入直前に腹部大動脈を切開することが有利です。肝臓は、カニューレを挿入し、明確に灌流された後、血餅形成は、もはや問題ではありません。

    灌流円に気泡のエントリは、ガス塞栓症を防止するために避けなければならないので、潅流装置の肝臓収穫および輸送の後、潅流装置と肝臓の接続は、特に重要なステップです。これは、三方弁を事前入力することが有用である私PBSを灌流システムにバルブを接続する前に、直接注射器と細いカニューレを用いて、肝臓カニューレに接続されているのです。

    灌流後に再チェックする必要がありますが、すべてのチューブコネクタ、三方弁とチューブが完全に接...

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    開示事項

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    著者らは開示するものは何もない。

    謝辞

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    このプロジェクト中の支援に対して、著者は感謝

    の意を表します。

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    材料

    この記事で使用された材料の一覧
    名前会社カタログ番号コメント
    自作の動脈カニューレ
     Portex非滅菌ポリエチレンチューブSIMS PortexREF 800/110/1000.28 mm ID 0.61 mm OD&
    nbsp;Portex 非滅菌ポリエチレンチューブSIMS PortexREF 800/110/2000.58 mm ID 0.96 mm OD
    Venodrop Safe butterfly catheterFresenius Kabi327585121 G
    portal vein cannula
    末梢静脈カテーテルBD393224BD Venflon Pro 20G
    三方活栓鍛冶屋医療888-101RE
    コットンスティックHecht-Assistent4302
    コットンパッド 紹興Zhengde外科ドレッシング13H118-03
    ガーゼ包帯湖北海歌 医療機器14388&
    nbsp;リンガー溶液フレゼニウスカビ13 HKP0221000 ml
    10 mlシリンジブラウン4606108V10 ml /ルアーソロ
    mlシリンジブラウン4606061V5 ml /ルアーソロ
    縫合糸(シルク6/0)ResorbaH1FLOT 105001.81
    医療用ドレープ紹興Zhengde外科ドレッシングD0613011
    外科器具
    ニードルホルダーGeuder17570
    マイクロ鉗子Inox-Electronic91150-20
    マイクロはさみティン11-740-11
    マイクロ鉗子S&T 
    クランプAesculapBH111R
    はさみFS T 14501-14
    外科用鉗子AesculapBD 557<
    ResmiratorResmed14.24.11.0004SmartAIR ST
    灌流装置Charite、医療工学研究所カスタムメイドデバイス脱細胞化装置
    蠕動ポンプismatec reglo ICCIDEXISM4408 4チャンネル
    ハイデルベルガーエクステンション75cm フレゼニウス・カビ287375 cm
    MS/CA ポンプセグメントIDEXIS 3510 MS / CA /クリック&ゴー/ POM-C
    CA 2ストッパーチューブPharmedBPT NSF-51
    バブルトラップ カスタムメイドアイテム
    ルアーロックホースコネクターNeolabNo. 02-1887
    洗剤
    SDSペレットカール・ロス CN30.4 2.5キロ
    トリトン X-100カール・ロス 3051.1 10リットル
    PBSの Gibco14190-094DPBS
    染色
    Eosin 1%Morphisto10177
    Mayer hematoxylinAppliChemA4840
    gomori 染色Morphisto11104
    AlcainBlue-PAS 染色Morphisto11388
    Direct Red 80 シグマ・アルドリッチ365548
    <td colspan="4">手術5 マー112314td colspan="4">Decellularisation

    参考文献

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Struecker, B., Raschzok, N., Sauer, I. M. Liver support strategies: cutting-edge technologies. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 11, 166-176 (2014).
    2. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).
    3. Wang, X., et al. Decellularized liver scaffolds effectively support the proliferation and differentiation of mouse fetal hepatic progenitors. J Biomed Mater Res A. , (2013).
    4. Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat Med. 16, 814-820 (2010).
    5. Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. Method for the decellularization of intact rat liver. Organogenesis. 6, 134-136 (2010).
    6. Bao, J., et al. Construction of a portal implantable functional tissue-engineered liver using perfusion-decellularized matrix and hepatocytes in rats. Cell transplantation. 20, 753-766 (2011).
    7. Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53, 604-617 (2011).
    8. Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand. J Clin Invest. 122, 3817-3823 (2012).
    9. Soto-Gutierrez, A., et al. A whole-organ regenerative medicine approach for liver replacement. Tissue engineering. Part C, Methods. 17, 677-686 (2011).
    10. De Kock, J., et al. Simple and quick method for whole-liver decellularization: a novel in vitro three-dimensional bioengineering tool. Archives of toxicology. 85, 607-612 (2011).
    11. Park, K. M., Woo, H. M. Systemic decellularization for multi-organ scaffolds in rats. Transplantation proceedings. 44, 1151-1154 (2012).
    12. Shirakigawa, N., Ijima, H., Takei, T. Decellularized liver as a practical scaffold with a vascular network template for liver tissue engineering. J Biosci Bioeng. , (2012).
    13. Ren, H., et al. Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold. Liver Int. 33, 448-458 (2013).
    14. Struecker, B., et al. Improved rat liver decellularization by arterial perfusion under oscillating pressure conditions. J Tissue Eng Regen Med. , (2014).
    15. Struecker, B., et al. Porcine Liver Decellularization Under Oscillating Pressure Conditions: A Technical Refinement to Improve the Homogeneity of the Decellularization Process. Tissue engineering. Part C, Methods. , (2014).

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