方法論記事

脳組織における測定細胞外イオンの信号のための、二連と同心微小電極

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DOI：

10.3791/53058

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2015年9月5日

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1Institute of Neurobiology, Heinrich Heine University Düsseldorf, 2Departments of Physiology and Neuroscience, New York University School of Medicine

この記事について

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サマリー

脳組織のイオン濃度を測定するための2種類のイオン選択性微小電極（ダブルバレルと同心円状）の作製、較正、および特性を実演します。次に、これらをマウス海馬スライス調製に用い、興奮活性が細胞外カリウム濃度とナトリウム濃度の両方を変化させることを示します。

要約

脳内の電気的活動は、膜を横切る大きなイオンフラックスを伴い、その結果、すべての主要なイオンの細胞外濃度に複雑な変化をもたらします。これらのイオンシフトは機能に重大な影響を与えるため、生理学的および病態生理学的条件下でのニューラルネットワークの機能と機能不全を理解するためには、その定量的な決定がしばしば必要となります。本研究では、脳組織におけるこのような測定のための優れたツールであることが証明されているダブルバレルイオン選択性微小電極の作製とキャリブレーションを実証します。さらに、いわゆる「同心円状」のイオン選択性微小電極についても説明されており、その設計の違いに基づいて、高速イオン変化の時間分解能がはるかに優れています。次に、これらの電極をマウス海馬の急性脳切片調製にどのように使用できるかを示します。ダブルバレルのカリウム選択性微小電極を使用して、グルタミン酸受容体アゴニストの外因性適用に応答して、またはてんかん様活性中の細胞外カリウム濃度([K+]o)の変化が実証されます。さらに、ナトリウム感受性、ダブルバレル電極、同心円電極の応答特性を示し、薬物の入浴または圧力適用によって誘発される細胞外ナトリウム濃度([Na+]o)の変化の検出を比較します。これらの測定値は、応答振幅は類似しているものの、同心円状のナトリウム微小電極は、ダブルバレル設計と比較して優れた信号対雑音比と応答時間を示すことを示しています。一般に、実証された手順は、pHやカルシウムなどの他のイオン種の測定に容易に移行でき、他の調製物にも適用できます。

概要

脳内の電気信号伝達は、原形質膜を横切るイオンのフラックスに基づいています。細胞外空間に出入りする主要なイオン移動は、電位依存性イオンチャネルの通過だけでなく、シナプス後イオントロピー受容体やイオントランスポーターによっても媒介されます。したがって、ニューロンの活動は、すべての主要なイオンの細胞外濃度の複雑な変化を伴います1。例えば、興奮性活動中にニューロンにナトリウムが流入すると、細胞外ナトリウム濃度([Na+]o)2が低下することが示されている。細胞外カルシウム濃度についても同じことが言え、カルシウムイオンはシナプス前構造とシナプス後構造の両方に急速に入ります3。同時に、カリウムは逆方向に動き、これが低mM範囲の細胞外カリウム濃度([K+]o)の増加を媒介します4,5。シナプス活性はまた、細胞外pHの変化を引き起こし、これはグリア内pHを変化させるグリア膜フラックスによって部分的に緩和されます6,7。細胞外イオン濃度のこれらの活性関連の変化は、重大な機能的影響を及ぼします。例えば、[K+]oのわずかな増加でさえ、ニューロンおよびグリア細胞を脱分極させ、それによってニューロンの興奮性を変化させ、過剰なカリウムを除去するいくつかのメカニズムが存在する8。これらに失敗すると、ニューロンのてんかん様活動やうつ病の広がりなどの現象を引き起こす可能性があります1。

その決定的な重要性のために、細胞外イオン濃度の定量的な決定は、生理学的および病態生理学的条件下での神経ネットワークの機能と機能不全を理解するためにしばしば必要であり、必要とされます。何十年もの間、ダブルバレルイオン選択性微小電極は、脳組織9のそのような測定のための優れたツールであることが証明されてきました。多くのイオンについて、他のイオンとの交差反応性が低い特異性の高いセンサーが利用可能です。従来のダブルバレル電極に加えて、いわゆる同心円電極が最近導入されました。後者は優れた時間分解能を提供しますが、10 を作成するには少し時間と労力がかかります。

以下では、これら2種類のイオン選択性微小電極の調製と校正について説明します。次に、これらの電極を脳スライス調製に使用して、薬物の入浴や圧力適用などのさまざまな刺激パラダイム後の興奮性活動によって誘発される[K +]oまたは[Na + ]oの変化を測定する方法を示します。

プロトコル

この研究は、ハインリッヒ・ハイネ大学デュッセルドルフ、ドイツだけでなく、欧州共同体理事会指令（609分の86 / EEC）の施設のガイドラインに厳密に従って行きました。すべての実験はに伝達し、ハインリヒ・ハイネ大学デュッセルドルフ、ドイツ（制度行為番号：O52 / 05）の動物実験施設で動物福祉事務所によって承認されました。ドイツの動物福祉法（Tierschutzgesetz記事4,7）によると、脳組織の死後の除去のための正式な追加の承認が必要ではなかったです。

二重のイオン選択微小電極の作製

  1. 7.5 cmでの長さを有するものとイオン感応バレルに使用される1.5mmの外径、及び6.5センチ長さを有するものと、後1.0ミリの外径フィラメントを有する2つのホウケイ酸ガラス毛細管を準備参照バレル。
  2. capilを清掃してくださいその後、12時間アセトン中lariesと腹筋で数回すすいでください。エタノール、それらを乾燥させてください。電極は、今デシケーター中で保存することができます。
  3. 両端で一緒にロングとショートの毛細血管を修正するために、二成分接着剤やアルミ箔の小さなストライプを使用してください。 1時間60℃で炉内で二重毛細管を加熱します。これは、硬化プロセスを加速します。デシケーター中で今の電極を保管してください。
  4. 旋回チャックと垂直プラーにダブルキャピラリーを中央に配置します。ガラスは、180°回転可能チャックの水平回転を可能にするのに十分に柔らかくなるまで静かにコイルを加熱します。このステップの間、チャック下チョックと毛細血管の伸長を防ぎます。
  5. 冷却した後、機械的なブレークを削除し、2シャープ、二重の毛細血管（ 図1）、その結果、キャピラリを引き出すために第二の加熱プロトコルを適用します。 1つの二キャピラリの先端径を1μmに近くなければなりません。
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イオン選択性微小電極の図1のアーキテクチャ。二重の微小電極の（A）写真。例示を目的と優れた視認性のために、参照バレル内部の液体が着色されました。同心の微小電極と、対応する参照電極の（B）写真。同心の微小電極の先端は、その左側に拡大して示されています。 （A）及び（B）においては、ピペットの先端におけるイオンセンサの占有スペースは、後に着色されます。底部には、両方の電極タイプの先端部構成が概略的に示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

  1. 旋回チャックと垂直プラーを使用できない場合は、二重のイオンセレクを準備シータガラスを使用して水平プラーで的微小電極。
    1. この目的のために、2つのバレルそれぞれに二つの電極をもたらすことがシータガラス（外径1.5mm、長さ7.5センチメートル）を引き抜いてください。それらのマーク1は、将来の参照バレルとして機能します。将来のイオン選択バレルとして機能するように以下の手順で他の類似のシラン化。
      注：二重のシータガラス電極の準備がねじれた二重の電極の準備よりもはるかに簡単ですが、それらの間の薄い分離ガラスの壁が多孔質になる傾向があるように、彼らは両方のバレルとの間の相互作用になりやすいです最大限の先端。
      注：センサーカクテル（下記参照）は、疎水性であるため、後にイオン感受性バレルの内面はシラン化と呼ばれるプロセスによっても同様に疎水性にする必要があります。次のステップで説明したように、このために、ヘキサメチルジシラザン（HMDS）が（ 図2）が用いられます。

「図2」SRC
図2ピペットのシラン化は、（A）、ヘキサメチルジシラザン（HMDS）は、内側のガラス表面のSi-OH基と反応して、疎水性を与えます。 （B）左の写真は、全シラン化ユニットを示しています。 HMDSを含む広口瓶を40℃に設定した加熱プレートの上に配置されます。ボトルの上部に、毛細管（キャップ​​）を有するホルダ（PH）が搭載されています。右の写真は、毛細血管（キャップ​​）を有するピペットホルダー（PH）の拡大図です。 （C）広口瓶に搭載されたとして、二連（左）または同心（右）毛細血管（キャップ）のためのカスタムメイドのピペットホルダー（PH）の概略側面図。 の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてくださいこの図。

  1. ただPU前lling電極は、約記入してください。広口ボトルに20ミリリットルのHMDS。注意：HMDSのみ、蒸気は健康に有害でドラフト内で使用するためのものです！瓶を閉じ、加熱プレート上にそれを置く、40℃にプリセットします。 200℃まで、同様にボンネットの下に配置された炉を、予熱。
  2. 以下の手順の間、そのシラン化を防止するために、蒸留水で、その先端に参照バレルを埋めます。
  3. 特別、カスタムメイドのホルダー（ 図2B、2C）にその先端を上にして、二重の毛細血管を入れてください。ブラント開放端は、ホルダ（ 図2C、左）の底部を通って自由に到達しなければなりません。その後、70分間予熱したHMDSを含む広口瓶に、このホルダーを配置します。
    注：HMDS蒸気が自由に毛細血管を流れることができることを確認してください。 1シラン化プロセス中に、HMDS 20mlを完全に蒸発せず、ボトルは、このように複数回使用することができます。
  4. 戦後のDSは、金属スタンドにし、2時間、予熱された炉内に毛細血管を転送します。これは、両方のバレルを乾燥します。
  5. シラン化した後、使用するまで乾燥毛細血管を保ちます。前者の手順は、合計で約3.5時間を必要としながら、電極がここ数週間デシケーター中で保存することができます。
  6. その実験的な使用の日に、イオン選択センサー（ 図1A）の1-2μlのシラン化バレルの先端を充填することによってイオン選択電極を準備します。カリウムに敏感な微小電極の場合、キャリアバリノマイシンを使用します。ナトリウムに敏感な微小電極のために、キャリアとしてETH 157を使用しています。
  7. 先端が適切に記入するために、イオン選択センサーは、それが困難に非常に粘性であることを確認します。
  8. HEPES緩衝生理食塩水の基準を満たすバレル（下記参照）。
    注：他の、より単純な等浸透圧の生理食塩水を同様に用いることができるが、我々は、生理食塩水を使用することを好むの組成と本質的に類似しています灌流生理食塩水（ACSF、3.6を参照してください。）、それが外に漏出し、実験中の組織に浸透する可能性があるため。したがって、この生理食塩水は、イオンのより高い濃度を使用ACSFより決定することが含まれていないことも重要です。
  9. 検出されるイオンの高濃度に含まれている生理食塩水で、センサのバックフィル。したがって、（ナトリウムに敏感な微小電極用）100mMのNaClの生理食塩水または（カリウムに敏感な微小電極用）100mMのKClでセンサーを埋め戻します。この手順の間に追加の気泡を入れないようにしてください。
  10. シラン化が成功したとセンサが適切に満たされている場合、センサー表面を観察埋め戻し（ 図1A）に対してはっきりと見える凹面を形成します。それ以外の場合、センサーは毛細血管壁から後退している可能性があり、先端が満たされることはありません。このような電極は機能しません。
  11. （両方のバレルに塩素化銀線を挿入銭を触れないように注意してくださいSOR）と歯科用ワックス（ 図1A）と、各バレルをシール。

同心イオン選択微小電極の作製

  1. 外筒は、フィラメント（外径2.0ミリメートル）7.5センチ長さの薄壁ガラスキャピラリーを使用しています。インナーバレルについては、フィラメントと1.2mmの外径10cmの長さを薄肉毛細血管を取ります。
  2. 12時間アセトン中の毛細血管を清掃してください。して、腹筋で数回すすいでください。エタノール、それらを乾燥させてください。電極は、今デシケーター中で保存することができます。
  3. 約記入してください。広口ボトルに20ミリリットルのHMDS。注意！ HMDSのみヒュームフードに使用するためのものである、蒸気は健康に危険です。瓶を閉じ、加熱プレート上にそれを置く、40℃にプリセットします。 200℃まで、同様にボンネットの下に配置された炉を、予熱。
  4. 水平プラーに2.0ミリメートルのキャピ​​ラリーを挿入し、短いテーパーと先端ディアメと毛細血管になるためにそれを引き出します〜4ミクロン（ 図1B）のター。
  5. カスタムメイド、特殊なホルダー（ 図2B、図2C）は、平滑末端（右、 図2C）ボトルのキャビティに開くようにその先端を上にして引き出された2.0ミリメートルのキャピラリーを置きます。その後70分間予熱したHMDSを含む広口瓶に、このホルダーを配置します。 HMDS蒸気はすべての毛細血管を流れることができることを確認してください。
  6. その後、金属スタンドにし、2時間、予熱された炉内に毛細血管を転送します。
  7. シラン化した後、使用するまで乾燥毛細血管を保ちます。前者の手順は、合計で約3.5時間が必要ですが、ここ数週間のデシケーター内の電極を格納します。
  8. 使用直前に、シラン化キャピラリー（ 図1B）にセンサーを少量（0.2μl）を記入してください。
  9. 内側のキャピラリーを製造するために、引き手に小径のキャピラリーを挿入し、2をもたらすことが引き出します長いテーパーと鋭い先端（ 図1B）と毛細血管。 100mMのNaCl（ナトリウムに敏感な微小電極）または100mMのKClを（カリウムに敏感な微小電極）生理食塩水で満たします。
  10. カバーガラスから作られたカスタムビルドストッパー上に互いに並んで直接センサーを充填した生理食塩水で満たされたキャピラリーを置きます。大きなキャピラリーに小さい毛細血管に短い道を挿入します。
  11. 粘土を使用して別のカバースリップ上に毛細血管を修正し、顕微鏡のステージに転送し、100倍の倍率を使用して視覚化します。それらの先端間の距離は約5ミクロン（ 図1B）になるまで、マイクロマニピュレーターで、顕微鏡のステージの細かなドライブを回して装着されたガラス棒の助けを借りて、ゆっくりと内側の毛細血管を介して外側の毛細血管を進めます。
  12. 歯科用ワックスを使用して、内側キャピラリーに外キャピラリーの開放端を固定してください。また、シアノアクリレート（クレイジー接着剤）インの小滴を適用ワックスのTEAD。
    注：水の小滴を添加すると、接着剤を重合し、所定の位置に電極を固定します。インナーバレルに塩素化銀線を挿入し、歯科用ワックス（ 図1B）でそれを封印。
  13. 基準電極を製造するために、フィラメントと1.5mmの外径を7.5センチの毛細血管を取ると垂直プラーを引き抜きます。ヒントは比較的長いが、（先端直径約1ミクロン）ではない、あまりにもシャープであることを確認してください。
  14. 、上部のピペットを破棄し、下部のチャックを開いて、5mm程度低いピペットを持ち上げます。再びチャックを閉じて、下部電極の先端が約5mm加熱コイルの上に配置されるまで持ち上げます。コイルを加熱し、約45°の側にすることにより、先端を曲げるために鉗子を使用しています。下のピペット約1〜2 mmです。バックメインシャフト（ 図1B）に平行に先端を向けるために約-45°によって再びベンド。この手順は、REFEREの先端の近くに配置を有効にする必要があります同心円状の電極にNCE電極。
  15. HEPES緩衝生理食塩水で参照バレルを満たす（以下を参照）、塩化銀線を挿入し、歯科用ワックス（ 図1B）でバレルを密封します。

3. Salinesの

  1. 100のKClから成るカリウムに敏感な電極（1.15を参照してください。）の埋め戻しのために生理食塩水を準備します。ナトリウム - 敏感な電極のバックフィル用生理食塩水を、100mMのNaClで構成されています。
  2. 参照バレルの埋め戻しのために生理食塩水を準備します（HEPES緩衝生理食塩水、1.16を参照してください。）（mm表示）で構成されている：125のNaCl、2.5のKCl、2 CaCl 2を、2 硫酸マグネシウム、1.25滴定のNaH 2 PO 4、および25 HEPES、 NaOHを用いて7.4のpHをもたらしました。
  3. カリウム感応性電極のキャリブレーションのための生理食塩水を調製するには、25mMのHEPESおよびNMDG-OH（N-メチル-D-グルカミン）で7.4に調整した150mMのNaClおよびKClを、pH値の合計で構成されています。ここでは、キャリブレーションは1、2、4、10 mMの含有Salinesのを行いました塩化カリウム; ACSFは、2.5 mMの塩化カリウム（ 図5）を含んでいました 。
  4. 次のようにナトリウムに敏感な電極の校正のために生理食塩水を準備します。 25 HEPES、3のKCl、NMDG-OHで7.4に調整160 NaClおよびNMDG-Clを、pH値の合計（単位mM）。 （MM）で70、100、130または160のNaClを含有する生理食塩水でキャリブレーションを実行します。 ACSFは、152のNaCl（ 図6）を含んでいました 。
  5. 他のイオンとのセンサの交差反応の決意について例えば 、pHは、一定のイオン濃度を有する追加の校正Salinesのが、様々なpH値を準備します。
    注：この手順は、本研究で実証されていないが、この問題（例えば11,12）をアドレス指定する以前の作業を参照してくださいしてください。
  6. （MMで）からなる生理食塩水に急性脳組織切片を準備し：125のNaCl、2.5のKCl、0.5のCaCl 2、6のMgCl 2、1.25のNaH 2 PO 4、26 NaHCO 3を、および20グルコース、95％O 2および5でバブリング％CO 2のpHをもたらします7.4。
  7. 125のNaCl、2.5のKCl、2のCaCl 2、1のMgCl 2、1.25のNaH 2 PO 4、26 NaHCO 3を、および20グルコース、95でバブリング（mm表示）からなる人工脳脊髄液（ACSF）中脳スライスにおける実験を行います7.4のpHをもたらす％O 2および5％CO 2、。
  8. ニューロンとグリア細胞の刺激のために、ACSFに溶解し0.2、0.3、0.4または0.5 mMのグルタミン酸または10mMのL-アスパラギン酸を含む溶液を準備します。加圧のために、HEPES緩衝生理食塩水で10mMのグルタミン酸を溶解します。
  9. 圧力アプリケーションのアプリケーションピペットを準備します。水平プラーにフィラメント（外径2.0ミリメートル）7.5センチ長さの薄壁ガラスキャピラリーを挿入し、〜1μMの先端径を生じるように引き出します。
  10. てんかん様活動の誘導のために、10μMのビククリンのオジを含むマグネシウムを含まないACSFを準備します。
  11. 活動電位の生成を阻害するために、10 mMのストックを調製solutテトロドトキシンのイオン蒸留水（TTX）。実験中、TTX直接0.5μMの最終濃度をもたらすようにACSFに添加されます。
  12. AMPA受容体の活性化を防止するために、ジメチルスルホキシド（DMSO）中シアノnitroquinoxalineジオン（CNQX）の50mMのストック溶液を調製します。実験中、これは直接に、100μMの最終濃度をもたらすようにACSFに添加されます。
  13. NMDA受容体の活性化を阻止するために、70mMの炭酸水素ナトリウムでアミノphosphonopentanoate（APV）の50 mMストック溶液を調製。実験中、これは直接に、100μMの最終濃度をもたらすようにACSFに添加されます。

イオン選択微小電極の4キャリブレーション

  1. 各実験の前後に直接イオン選択微小電極を校正。
  2. マイクロマニピュレータに電極を取り付け、ACSF灌流実験室に挿入して、実体顕微鏡下に置かれた（ 図3 G>、4）。前室（ 図4A、B）に参照電極を配置します。バス灌流のスイッチをオンにし、フローは約2 ml /分であることを確認してください。

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図3.実験作業スペース。記録リグは実験槽、マイクロマニピュレーター、高品質の光学系を持つ実体顕微鏡とX / Y-翻訳段階を運ぶ振動減衰テーブルで構成されています。実体顕微鏡は、また、文書化のためのCCDカメラを搭載しています。また、焦点薬物適用のための加圧装置を用いています。記録電極は、差動増幅器のヘッドステージを介して接続されています。デジタル化されたデータ（A / D変換器）、コンピュータで記録されます。浴灌流は蠕動マイクロポンプ（図示せず）によって実現されます。>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

  1. A / Dコンバータ、差動アンプ、およびコンピュータのスイッチをオンにし、記録ソフトウェア（ 図3、4）を起動します。イオン感受性バレルの抵抗が非常に高いので（10〜20GΩ;下記参照）、高入力インピーダンスとの特別な電位計アンプを使用します（= 10TΩ のR）と小さなバイアス電流（I バイアス = 50 FA - 1 pA）で。

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図4.電子・セットアップ実験の空間デザイン。（A）記録装置の概略図。二重の微小電極（青）と同心の微小電極（赤）の先端を生理食塩水で満たされた実験槽内に配置されています。バス参照電極を模式的に示されています。 poten基準バレル（V 2）はV REFを検出するのに対し、イオン選択バレル（V 1）によって検出されたTiAlは、電場電位（V refの）イオン電位（V イオン ）から構成されています。 V イオンを分離するために 、V refが差動増幅器（DA）を用いてV 1から減算されます。 （B）所定の位置に同心円状の微小電極と実験段階の地形。実験段階の中心はスライス標本を含む実験槽で構成されています。バスを接地するには、参照バス電極も灌流入口をホストする前室に沈めています。ステージ自体は独立したグランドコネクタにより接地されています。同心の微小電極とその基準電極は、マイクロマニピュレーターで駆動される独立したピペットホルダーによって運ばれます。微小電極および参照電極を電子増幅器のヘッドステージに接続されています。e.com/files/ftp_upload/53058/53058fig4large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

  1. 差動アンプ（ 図4）のヘッドステージのそれぞれの入力に塩素化銀線を接続します。電極抵抗を決定します。参照バレルの抵抗値が30〜100MΩとイオン感応バレルの抵抗10〜20GΩの間にある間にあることを確認してください。
  2. ゼロに電圧信号を調整し、録音を開始します。
  3. 注参照バレル（V 2）はV REFを検出するのに対し、イオン選択バレル（V 1）によって検出された電位は、電界電位（V refと）から構成され、イオンの電位（V イオン ）されていること。 V イオンを分離するために 、V refが差動増幅器（DA）（ 図4A）により、V 1から減算されます。
  4. 安定なベースラインを得た後、イオンの定義された濃度を含有する較正Salinesのにスイッチが測定されます。
    メモ ：図5（a）は、二重のカリウムに敏感な微小電極のキャリブレーションを示しています。 図6Aのキャリブレーションでは、両方の二重のだけでなく、同心の Na +感受性微小電極が示されているように。私たちはここでの手順を説明していませんが、他のイオンとの可能な干渉が特定のイオノフォアを使用する前にテストする必要があることに注意してください（また、3.4を参照。）。

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図5.二重のカリウム選択的微小電極の校正。（A）参照バレル（のV REF）の電圧の変化と対応してK + -電位（V K +）の浴のK +濃度の変化に（ [Kが+] b）に示すように。 （B）半V K +対B [K +]の-logarithmicプロット。データの線形プロットは、約56 mVでの傾きを明らかにする。説明のために、トレースがSawitzky・ゴーレイフィルタ（幅20）で平滑化した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

  1. イオン濃度の既知の変化に応じて、イオン選択バレルの電圧応答を決定します。プロットデータ片対数プロット（ 図5B、6B）で、スロープを決定します。理想的なセンサは、ネルンストの式で表される関係を（例えば13を参照）、次のとおりです。

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V：電極電位測定。
V 0：標準電極電位、298.15 Kの温度で塩化銀線用などと101.325キロパスカル（絶対）の分圧
R：気体定数（8.314ジュール/ケルビン/モル）
T：（ケルビン）絶対温度
Z：イオンの電荷（+ 1カリウム、ナトリウムなど）
F：ファラデー定数（96.500クーロン）
C '：細胞外イオン濃度
C ''：細胞内のイオン濃度

実用的な目的、および自然対数のために、その後、所定のイオンと温度のために有効であるネルンストスロープ Sに変換されます。

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注：カリウム、ナトリウム、電極​​、センサの理想的な電圧応答は、このように、室温で約-58 mVでの直線の傾きを示します。このいくつかの偏差が（ 図5B、6B）受け入れることができます。それは、与えられた電極の応答特性は、実験の前後に（下記参照、10％以上）が有意に変化しないことが不可欠です。

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。図6.ナトリウム選択微小電極と、（A）はトップトレース二重の同心円状の電極との比較校正：二重の電極の参照バレル（のV REF）の電圧の変化（黒の点線のトレース）とお風呂の Na + 濃度の変化に応じて、同心円状の電極（グレーのトレース）（[ の Na +] b）に示すように。両電極の電圧応答が実質的に同一であることに注意してください。ボトムトレース：[ の Na +] Bの変化に応じて、二重の電極（黒のトレース）と同心円状の電極（グレーのトレース）のの Na + -電位（V のNa +）の電圧の変化。 （B）両電極のV のNa +対B [ の Na +]の半対数プロット。データの線形プロットは、両方の電極のための約48 mVでの傾きを明らかにしました。70 mmの152 mMのから[ の Na +] Bの急速な変化に二重の（黒のトレース）のV のNa +（C）の対応と同心電極（グレーのトレース）。同心円状電極の応答時間が大幅に高速であることに注意してください。説明のために、トレースがSawitzky・ゴーレイフィルタ（幅20）で平滑化した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

  1. 先端径、先端の形でだけでなく、電極先端のセンサ相の厚さに依存する、電極の応答時間を決定します。
    注：この実験（交換は500ミリ秒以内に電極の先端で完了）を設定し、異なる潅流Salinesの間に急激な変化を利用するには、二重のナトリウムに敏感な微小電極は、秒時9.7±4.5以内に安定した電位に達しました152 mMのから70 mMの[ の Na +]に切り替えた（n = 6）。同じ設定内では、同心円状のナトリウムに敏感な微小電極（図6C）は0.8±0.3秒以内に安定した電位に達した（n = 6）。これは二重の微小電極と比較して、同心の優れた時間分解能を強調しています。

組織の5.解剖

  1. 急性スライスの世代のために、CO 2で生後日のマウス16-20を麻酔し、迅速に断頭（欧州委員会の勧告以下に発表された：実験動物の安楽死、ルクセンブルグ：欧州共同体、1997年の公式出版物のために、Officeを、ISBN 92-827-9694-9）。
  2. 標準的な手順（参照例14）以下の海馬組織切片（厚さ250μm）を、準備します。

6.実験手順

  1. 実験室にスライスを転送し、それを修正グリッド。
  2. スライス面にキャリブレーションイオン選択性微小電極を下げ、約50μmの電極との深さにCA1領域の放線層を突き刺します。
    注：イオン感応バレルにおける特性変動に微小電極のリードでスライス面に触れます。さらに、組織の中に突き刺し、細胞へのダメージも同様に変動が発生します。ベースラインが安定するまで待ちます。
  3. トランスミッタアゴニストの加圧のために、化合物（例えば、0.5 mMのグルタミン酸）を使用してアプリケーションピペットを埋めます。加圧装置へのマイクロマニピュレーターやカップル、それをにピペットを取り付けます。
  4. 慎重に低いアプリケーションの組織へのピペットとイオン選択性微小電極（〜20〜40ミクロ​​ン）の先端の近くに配置します。加圧（例えば、10秒、40ミリバール）とイオン選択微小電極でモニターして記録電圧の変化を開始します。
  5. 薬の浴アプリケーションの場合、SW定義された期間ごとに異なる​​潅流Salinesの間のかゆみ。
  6. 実験を終了するには、慎重に組織からのイオン選択性微小電極を撤回し、長時間の記録期間中に発生した可能性のある元のゼロ値から電位のドリフトを記録。
  7. 浴からスライス標本を削除し、イオン選択性微小電極の第2の校正を行います。
    注：電極先端が組織を通じて、移動中に詰まることができるので、これが必要です。したがって、電極は、依然としてイオン濃度の変化に適切に応答することを保証するために不可欠です。イオン濃度の10倍の変化に対する電極の応答が10％以上低下した場合の実験では、拒否されるべきです。よく作用電極は、原則的に、いくつかの実験に再利用することができます。これがあっても数日間続くことが同心円状電極に特に当てはまります。それは必須であるが、その較正手順は、再あります電極の適切な機能を確保するために、各単一の実験の前後にpeated。

7.データ解析

  1. 第1のアナログ手順がに適用される、K +感受性電極のためにここに示された（以下のように電位ΔV イオン （MV）の変化を決定するために式（2）に変換する、細胞外のイオン濃度の変化に対するイオン選択性電極の電圧応答を変換しますNA）は感受性の電極を+：

figure-protocol-9

V K +：バリノマイシンバレルの電位の変化（MV）

S：ネルンストスロープ

K +] B：カリウムのベースライン濃度（私たちの場合には2.5 mMのK +）

K +] O：[K +]の変化O実験中

  1. 片対数プロット由来斜面の算術平均を計算するO前と実験後のキャリブレーションF;「s」を取得するために（参照： 図5B、6Bは、ポイント4.8を参照）。
  2. [K +] O（MMにおけるΔ[K +] oは 、）に式（3）を再配置変化を計算するには：

figure-protocol-10

結果

[K +] o及び興奮活動に応答して、その中の変化を監視するには、二重のカリウム選択的微小電極は、CA1領域の放線層に挿入しました。数分突き刺した後、電極のイオン選択バレルは約2.8 mMで、使用ACSFの[K +]に近い値（のO [K +]に対応し、安定したベースライン（ 図7A）に達しました 2.5 mm）です。 10秒間0.5 mMのグルタミン酸のバスアプリケーションは、〜0.7ミリ（ 図7A）に相当するベースライン下のアンダーシュートに続いて、約4mmによってO [K +]で可逆的増加を誘導しました。 0.4、0.3にグルタミン酸濃度を下げる、および0.2 mMのは、一過性の上昇と[K +] O（ 図7A）でアンダーシュートの両方の振幅の対応する減少を引き起こしました。

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興奮活動に応じて、図7.外カリウムトランジェント。（A）[K +] oをトランジェント、示されるように、10秒間のグルタミン酸の異なる濃度の浴アプリケーションによって誘発されるベースライン以下のアンダーシュートに続いて上昇、からなります。 （B）グルタミン酸受容体遮断薬と灌流の影響（CNQX、100μM; APV、100μM）およびテトロドトキシン（TTX; 0.5μM）[K +] oをトランジェントに10秒間0.5 mMのグルタミン酸の浴アプリケーションによって誘発されます。 0Mg 2+ / BICの存在下で、（C）自発[K +] oをトランジェント。 ACに示される実験は、二重バレルの電極を用いて行きました。説明のため、トレースはSawitzky・ゴーレイフィルタ（幅20）で平滑化した。 をクリアしてくださいこの図の拡大版を表示するには、こちらICK。

以前の実験では、このようなグルタミン酸誘発[K +] O信号が大幅にTTXの適用中に変更されていないことを示し、したがって、電位依存性ナトリウムチャネルおよび神経活動電位発生15,16の開口部に概ね独立しています。グルタミン酸に応答して観察された[K +] Oの変化の根底にあるメカニズムを研究するために、我々は、グルタミン酸受容体遮断薬、すなわちCNQX（100μM; AMPA受容体遮断薬）を適用し、APVを（100μM; NMDA受容体遮断薬）の存在下でTTX（0.5μM）。 （; 図7B 例えば 17）、これらの遮断薬と一緒にお風呂灌流時には、グルタミン酸誘発[K +] oが変化する前に報告されているようにイオンチャネル型グルタミン酸受容体チャンネルの開口部への依存度を確認し、事実上廃止されました。

さらにトンを実証するために、彼外[K +]信号を生成するためのグルタミン酸作動性興奮の関連性、スライスは10μMのビククリンのメチオダイド（0Mg 2+ / BIC）を含む名目上のMg 2+を含まない生理食塩水で灌流しました。これは、NMDA受容体の電位依存性Mg 2+を-blockを緩和し、ネットワーク（ 例えば、18,19）に自発的再発性てんかん様活動を引き起こし、GABA A受容体を遮断することによって阻害を弱めます。予想されたように20、自発的、再発[K +] oをトランジェント、約1.5mmに相当するが0Mg 2+ / BIC生理食塩水（ 図7C）で検出されました。これらの応答の間には、0.2mm程度が発生した（ 図7C）の平均振幅と[K +] oを過渡に小さいです。

第二の実験セットにおいて、我々は、の適用により誘発【のNa +] Oの変化を決定するために【のNa +]感受性微小電極を使用しグルタミン酸アゴニスト。ここで、我々はまた、2つの異なるアプリケーションのパラダイムを採用し、二連と同心の微小電極の応答特性を比較しました。 [ の Na +]感受性微小電極は、約50μmの深さで放線層に配置しました。安定なベースラインが達成された後、グルタミン酸アゴニスト、L-アスパラギン酸（2.5ml /分の10mM、120秒間、浴灌流）浴潅流ごとに適用しました。以前の21観察されたように、アスパラギン酸の適用は、約5分続いたし、その後ベースラインに戻った （図8A）を回収し始めた約15 mMのでO [ の Na +]でゆっくりと減少を引き起こしました。両電極により決定【のNa +] O信号のピーク振幅と速度は、これらの条件下で実質的に同一であった注目すべきことに、同心の電極は、より安定したベースラインと低ノイズレベル（ 図8A）を示しました 。

Rをテストするにはより迅速なアプリケーションパラダイムの下で異なる電極の特性をesponse、我々はイオン選択性微小電極の先端から20〜40ミクロンの距離で放線層に位置し、微細ガラスピペットを介してグルタミン酸を、適 ​​用される圧力。 21予想されたように、200ミリ秒のためのグルタミン酸の適用（10 mM）を[ の Na +] O（ 図8B）の低下を引き起こしました。減少O [ の Na +]のピーク振幅は、（二連：4.5から13.5 mMであり、n = 14;同心：2.0から19.1 mmであり、N = 15）は、電極の両方のタイプの同じ範囲にありました。しかし、遅い浴灌流（上記参照）、信号対雑音比だけでなく、電極の2つのタイプによって検出【のNa +] O信号の経時変化のみならずで得られた結果とは対照的に、有意に異なりました。ピークまでの平均時間は、同心円状の微小電極のための銃身、ダブル、わずか1.3秒3.5秒でした。

ve_content ">このように、これらの結果は、またのCa 2+及びpH選択的対応10のために注目されたように、二重のの Na +対同心選択性微小電極、（参照： 図6Cおよび図8B）の速い応答速度を確認しますショートバーストシナプス刺激が速いシナプスによって誘発されるイオンの過渡現象を喚起するために実施した。前者の研究とは対照的に、唯一の傾向が、私たちのアプリケーションと同心と二重の電極間の平均ピーク振幅に有意差は認められていますパラダイム。これはおそらく、事実による2（20-40ミクロ​​ン）の要因によって変えるイオン選択微小電極の先端からアプリケーションピペットの距離ということであり、その結果、標的領域における最大のグルタミン酸濃度そのピーク振幅の既存の違いを妨害、別の実験では同じではありませんでした。

（A）トップ痕跡：ボルタの変更二重の電極（黒の点線のトレース）とバスの Na + 濃度の変化に応じて、同心円状の電極（グレーのトレース）のリファレンス・バレル（のV REF）のGE（[ の Na +]は b）に示すように。両電極の電圧応答が実質的に同一であることに注意してください。ボトムトレース：[ の Na +] Bの変化に応じて、二重の電極（黒のトレース）と同心円状の電極（グレーのトレース）のの Na + -電位（V のNa +）の電圧の変化。 （B）両電極のV のNa +対B [ の Na +]の半対数プロット。データの線形プロットは、両方の電極のための約48 mVでの傾きを明らかにしました。 70 mmの152 mMのから[ の Na +] Bの急速な変化に二重の（黒のトレース）のV のNa +（C）の対応と同心電極（グレーのトレース）。同心円状の電極の応答時間は著しくFASであることに注意してくださいター。例示の目的のために、トレースはSawitzky-ゴレイフィルタで平滑化した（幅20）。

figure-results-1
図8：細胞外ナトリウムトランジェント・二連と同心の電極によって検出されました。
（A）過渡のV REFの変化や[ の Na +]バーで示されるように、O 120秒間の10mMアスパラギン酸と一緒にお風呂灌流により誘発されます。上部トレースは、二重の電極を用いて行った記録が、下側のトレースは、同心円状の電極を用いて記録した表示します。 （B）過渡のV REFの変化や[ の Na +]矢印で示すように、O 0.2秒間の10mMグルタミン酸と局所的な圧力の適用によって誘発されます。上部トレースは、二重の電極を用いて行った記録が、下側のトレースは、同心円状の電極を用いて記録した表示します。赤い点線の線は、その最大の信号の開始までの期間の線形フィットを表します。同心円状電極の応答時間は、この条件の下で大幅に高速であることに注意してください。説明のために、トレースがSawitzky・ゴーレイフィルタ（幅20）で平滑化した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ディスカッション

液体キャリアベースは、イオン選択電極が正常に何十年もの間、多くのイオンのために用いられてきた、非常に特異的なセンサは、22〜26が用意されています 。 ECSの幅はわずか約20〜50nmで、イオン選択の直径である間：脊椎動物の脳標本の細胞外空間（ECS）で使用する場合、一つは、これは非常に侵襲的技術であること、しかし、心に留めておく必要があります微小電極は、約1μm（二重の電極）以上（同心円状の電極）です。イオン選択性微小電極の先端は、このようにだけでなく、組織の彼らの突き刺しの間に組織を損傷するだけでなく、イオンの過渡現象の過小評価に有利、ECSを拡大します。これらの落とし穴にもかかわらず、神経活動に応じて、細胞外イオンの過渡現象は、この方法の信頼性を証明する、異なる研究室7,8間で著しく一致しています。

イオン選択性電極の性能と適合性使用されるセンサカクテル（ '液膜のイオノフォア'）によって定義され、それらの感度と選択性に依存します。センサーのカクテルは、 例えば 、カリウム27に対して高い選択性を示すK +選択微小電極のためのバリノマイシン、特別な担体分子が含まれています。それにもかかわらず、他のイオンとの交差反応性が発生する可能性がありますし、テストする必要があります。バリノマイシンは、結果を解釈する際に考慮しなければならアンモニウムに対する有意な交差反応性（例えば、11,12）を示します 。イオノフォアの電圧応答は、ネルンスト動作（参照方程式1）に従うため、また、信号対ノイズ比、検出閾値は、測定されるイオンの濃度に依存します。このように、しばらく小[K +] oをトランジェントトランジェントがはるかに難しいこんにちはに対して検出するようにしているoを低ベースライン[K +] oを、小さな[ の Na +]に対して大きな電圧変化を呼び起こしますGHベースライン[ の Na +] O（参照： 図5、図6）。

イオン選択性電極の性能も大きく、その電気的時定数によって支配される時間分解能によって決定されます。後者は主に、センサの軸方向の抵抗によって決定され、その内部の溶液と外部流体との間のピペットの長さに沿って分布容量によるものです。二重の構成では、抵抗が充填イオンセンサの長い列のために、高いです。 （この場合はホウケイ酸ガラスで）指定された絶縁誘電体の場合、容量は誘電体の厚さによって支配されます。二重の電極では、誘電体の幅は、ピペットのガラス壁に達します。ガラスが先端に近い薄くなるように、誘電体幅が低下し、静電容量が増加します。これらの要因には、数百ミリ秒から数の範囲の応答時間を有する電極を生成するために結合秒は、これらの要因は様々です。

同心の設計の主な利点は、軸方向の抵抗とバスの静電容量の両方が大幅に減少していることです。先端の前の最後の数マイクロメートルで唯一の名残を残して埋め戻しイオン交換体の抵抗の最も同心ピペットシャント、。また、同心のピペット内の充填液が物理的に非常に容量の低減、二枚のガラスの壁の厚さによって分離され、浴から離れています。 10先に示したように、低抵抗およびキャパシタンスの複合効果は、二桁の時間分解能の向上があります。同心の Ca 2+およびpH微小電極の場合には、90％の応答時間は10~20秒10と同様に低かったです。同心の設計の関連する利点は、より低いノイズレベル（参照： 図8）です。任意のアンビエンから大幅に減少し、抵抗のため、電圧過渡Tノイズが最小化されます。また、このような過渡状態からの回復が速いため、時定数の、迅速です。このようなアーティファクトは、したがって、小さく高速であり、生理的な録音（参照： 図8）にはあまり破壊的な効果を持っています。

同心の技術の欠点もあります。まず、それらのアセンブリは、より複雑で、時間がかかります。第2の欠点は、独立したマイクロマニピュレーターや特殊な二重のマニピュレータのいずれかの使用を伴う、その先端に別個の基準微小電極を配置する必要があることです。最後に、二重の微小電極は、同心電極に不可能であると同時に28、2つの異なるイオン種の検出を可能にする、三連の設計に拡張することができます。

最も一般的な落とし穴

非効率的なシラン化。

任意の液体-SENSの製造において最も重要なステップ、および主要な障害物またはベースのイオン選択微小電極は、シラン化手順です。電極は、特定のイオン濃度の変化に応答する、またはサブネルンスト応答（10倍の濃度差あたりすなわち 、よく未満58 mVの）に応答しない場合には、シラン化の乏しい有効性は、一般的な原因です。大気中の湿度がそれぞれ、夏の高さ、または冬の条件の典型的な、高すぎる、または低すぎると我々の経験では、これが発生する可能性があります。それは室内湿度をある程度制御を発揮することが可能である場合、これらの問題を克服することができます。

電極抵抗は高すぎます。

必要に応じて、イオン感受性バレルの抵抗が面取りによって低減することができます。この目的を達成するために、数秒間水に懸濁させた研磨の強いジェットへのヒントを公開します。これは、最上の先端が破損し、所望の値に抵抗を下げることになります。

塩橋。

ソルトイオンと参照バレル間のブリ​​ッジが不十分またはnone応答の電極をもたらし、ひいては大幅キャリブレーションでその性能を混乱することができます。 （ポイント1.6を参照してください）​​。上述したように、これは主に二重のシータガラスが選択されている問題ですが、ここで説明したオフセット、ツイストバレル技術を使用する場合にまれです。

念頭に置いて製造の容易さで、ラックス29の元の二重のデザインは、多くの場合、有利に使用することができます。この方法は、（30,31参照）、また先端を経由して、イオン交換を組み込むことにより、以下の、先端からの吸引や除名によりシラン溶液への高速露出を塩溶液とイオンと参照バレルの事前充填を利用。これらの電極は、およそ10分で製造することができるが、その先端の大きさは、典型的には4μm以上であり、彼らは、実験中に失敗する傾向です。対照的に、その方法は、シラン化シラン蒸気および熱への暴露を含みますingが小さい日最後のヒント、そして時には数週間で電極を製造することができます。

まとめると、イオン選択性微小電極を準備する方法についてのいくつかのプロトコルとアプローチがあります。ここでは、100％に近いの全体的な成功率で、私たちの研究室でよく、かつ確実に動作ツイスト銃身のダブルと同様に同心円状の微小電極の製造のための2つの主要な手順を記載しています。重要なことは、これらの技術は、pH又はカルシウムを含む他のイオン種の測定に転送されます、また、一般的に液体で満たされた空洞または流体などの脳以外の製剤に適用されます。少なくとも最後のではなく、イオン選択的微小電極は、細胞内イオン濃度の決意を可能にします。なぜなら、それらの比較的大きなチップサイズ（約1ミクロン）で、これは、しかし、唯一の大きな細胞体を有する細胞に無脊椎動物の調製物28,32に見られるように、例えば 、そのようなことが可能となります。

開示事項

著者らは、競合する利益はないと宣言している。

謝辞

著者は、専門的な技術支援のためのC. Roderigoに感謝したいです。私たちは、ビデオ制作で助けをS.ケーラー（拡張イメージングのセンター、ハインリヒ・ハイネ大学デュッセルドルフ）をお願いいたします。著者の研究室での研究は、ドイツ研究協会（DFG：CRRにRoの2327 / 8-1）によって資金を供給されている（NH）は、ハインリッヒ・ハイネ大学デュッセルドルフと国立衛生研究所によって（MC）にR01NS032123を付与します。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
研磨剤  マイクロポリッシュ Buehler GmbHA.dest
ホウケイ酸ガラス キャピラリー1405059ヒルゲンベルグアプリケーション ピペット; 75 mm x 2 mm、壁厚 0.3 mm
ホウケイ酸ガラス キャピラリー、フィラメントGC 150 F-15 Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatusダブルバレル微小電極のセンサー用 
GC100-F-15クラーク電気医療機器、ハーバード装置ウケイ酸ガラスキャピバレル微小電極の参照用 
フィラメント付きホウケイ酸ガラスキャピラリーGB-200TF-15 Science Products同心円状、外側チャネル O.D. 2.0 mm  
フィラメント付きホウケイ酸ガラスキャピラリーGB-120TF-10サイエンスプロダクツ 同心円状、インナーチャネル 外径 1.2 mm
Digidata1322AAxon Instruments
ヘッドステージカスタムメイドRin = 10 TΩ and Ibias=50 fA-1pA (市販品  代替品: e.g. Dagan IX2-700, ヘッドステージ付き (10ギガフィードバック抵抗)またはEPMS-07、NPI、Tamm、Germany)
実験チャンバーカスタムメイド市販例 ワーナーインストゥルメンツ、米国; Scientifica、英国
ファーネスヘレウス200°Cで一定に保たなければなりません。C
硬質粘着ワックス/歯科用ワックス デイベリット502 Siladent Dr. Boehme &Schoeps GmbH
ホットプレートカスタムメイド40°Cで一定に保たなければなりません。C
プレキシガラスカスタムメイドダブルバレル:O.D.  キャピラリー1.5 mm、同心円:O.D. キャピラリー 2mm
マイクロマニピュレーターライツ
マイクロマニピュレーターMD4Rライカ
実体顕微鏡M205Cライカ
対物レンズプラン 0.8xLWDライカ
ピペットプーラーPP-830成重同心円状微小電極 
ピペットプーラーP-97サッターインスツルメンツ 同心円状微小電極のセンサ 
空気薬剤排出システムPicospritzter Type IIGeneral Valve TM Corporation
Travel dovetail stageDT 25/MThorlabs
2液型接着剤 AralditeHuntsman advanced materials GmbHOneは、アルミホイルの小さなストライプを使用して毛細管を貼り付けることもできます 
シルバーワイヤー99.9% Wieland Edelmetalle
スライサー / VibratomeMicrom HM 650 VThermo Scientific
SoftwareAxoScope 8.1 Axon Instruments
垂直プーラー PE-2型成重科学機器回転チャック付   ダブルバレル微小電極
x/y 並進ステージカスタムメイド
1(S),9(R)-(−)-ビキュクリンメチオジドSigma aldrich14343GABAA受容体の競合的アンタゴニスト(光感受性);注意 有毒
CNQXシグマアルドリッチC-127AMPA /カイニン酸受容体拮抗薬;注意 有毒
ジメチルスルホキシド(DMSO)Sigma aldrichD5879
DL-AP5Alfa AesarJ64210NMDA受容体拮抗薬;注意 有毒
ヘキサメチルジシラザン (HMDS)シグマ アルドリッチ440191注意: 可燃性、急性毒性 (経口、経皮、吸入) および金属および皮膚に対して腐食性
L-アスパラギン酸シグマ アルドリッチA9256NMDA および非 NMDA および EAAT を活性化します
L-グルタミン酸ナトリウム塩水和物シグマ アルドリッチG1626NMDA-R、AMPA-R、QA-R および KA-R) を活性化します)。
カリウムイオノフォアI - カクテルBフルカ 60403バリノマイシンに基づく;注意
ナトリウムイオノフォアII - カクテルAフルカ  71178ETH 157
TTXAscent ScientificAsc-055Inhibitor of voltage-dependent Na+ channelsに基づいています。注意 有毒
水、超高純度シグマアルドリッチW3500 
に溶解 フィラメント付きホラリーダブル付き電位計アンプ からは製マイクロ電極ホルダー 型 型 ななな有毒な

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Formal Correction: Erratum: Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue
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