酵素微小電極バイオセンサーは、生物学的に関連性のある濃度での細胞外細胞シグナル伝達のリアルタイム測定を可能にします。 以下のプロトコルは、バイオセンサーのアプリケーションを、腎臓におけるATPおよびH2O2のex vivoおよびin vivo検出に拡張します。
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この記事について
サマリー
要約
酵素微小バイオセンサーは広くリアルタイムで細胞外シグナルを測定するために使用されてきました。それらの用途のほとんどは、脳切片および神経細胞培養物に限られていました。最近、この技術は、全体の臓器に適用されています。センサ設計の進歩は、血液灌流生体腎臓内での細胞のシグナル伝達の測定を可能にしました。現在のプロトコルは、ラット腎臓の間質におけるATP と H 2 O 2のシグナル伝達を測定するために必要な手順を示します。二つの別々のセンサ設計は、 エキソビボおよびインビボのプロトコールにおいて使用されます 。センサーの両方のタイプは、高速応答、高感度かつ選択的なバイオセンサーを与えるために選択透過性層の上に薄い酵素生物層で被覆されています。選択透過性膜は、生体組織内の干渉から信号を保護し、酵素層は、グリセロールキナーゼとグリセロール-3- PHOSの連続触媒反応を利用しATPの存在下で酸塩オキシダーゼはH 2 O 2を生成します。 ex vivoでの研究のために使用されるセンサのセットは、さらに、白金/イリジウム白金（Pt-IR）は、ワイヤ電極の上にH 2 O 2の酸化による分析物を検出しました。 in vivoでの研究のためのセンサーではなく、血液灌流組織のために設計されたメディエータコーティングされた金電極上のH 2 O 2の還元に基づいています。最終濃度の変化は、分析物の既知濃度のキャリブレーションに続いて、リアルタイムの電流測定により検出されます。また、電流測定信号の特異性は、それに対応し、H 2 O 2及びATPを分解し、そのようなカタラーゼやアピラーゼなどの酵素を添加することによって確認することができます。これらのセンサは、各実験の前と後の正確なキャリブレーションに大きく依存しています。次の2つのプロトコルは、ATPとH 2のリアルタイム検出の研究を確立します腎組織中のO 2は 、さらに他の生物学的製剤または全臓器での使用のために記載した方法を拡張するために改変することができます。
概要
（も、本原稿内のセンサとして参照）酵素微小電極のバイオセンサーは、生細胞や組織におけるダイナミックなシグナル伝達プロセスを研究するための貴重なツールとなっています。センサーは、生物学的に関連する濃度で、細胞シグナル伝達分子の時間的および空間分解能が向上してい。サンプリングと長期間にわたって間隔で採取した細胞外体液を分析する代わりに、これらのセンサは、高速、その酵素は、それによってリアルタイム測定1,2を製造 、分析物に反応するように反応します。高速プリンまたは過酸化水素のようなオートクリンおよびパラクリン因子の間質濃度の検出、及びそれらの放出の動力学は、正常および病的状態3における薬剤の効果のプロファイルを確立するために使用することができます。現在、センサを使用するアプリケーションの大部分は、脳組織切片および細胞培養物4-10にされています。この原稿を目的に詳細なプロトコル正確全体腎臓中の分析物のリアルタイムの濃度を測定する手段を確立します。
以下のプロトコルは、腎臓で間質ATP及びH 2 O 2シグナル伝達を研究するために開発されました。腎臓のネイティブ環境では、細胞外ATPは急速にその誘導体（ADP、AMPおよびアデノシン）に内因性ectonucleotidasesによって異化されます。ここで使用されるセンサは、他のプリンまたはATPの分解生成物11<....
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プロトコル
実験動物の管理と使用に関するNIHガイドに付着した以下の動物手順。事前承認は、施設内動物管理使用委員会（IACUC）から入手しました。
注：センサーメーカーの説明書のレビューは、実験の設計時およびそれらの使用前に行われるべきです。センサーを使用している場合、これらの命令に従うことで、最適な結果が得られます。
1.センサーのキャリブレーション
- 実験の開始前に、新鮮なストック溶液を準備します。
- 10mMのNaPi緩衝液、100mMのNaCl、1mMのMgCl 2、2mMのグリセロールを含む緩衝液Aを作成します。 NaOHを用いてpHを7.4に調整します。 2〜8℃で保存してください。
- -20℃で保存株式ATP濃度（100 mm）を使用して、緩衝液Aの90μlに10μlの株式を追加することにより、新鮮な10 mMのATP校正ソリューションを作成
- トンにその先端（ 図2）を配置することにより、ATPセンサーを再水和2〜8℃で少なくとも10分間、緩衝液Aを含む彼水分補給室。
注：再水和の後、センサは、以上20秒間空気に曝されるべきではないか、センサ感度が低下することがあります。空気に長時間露光が予想される場合は、グリセロールの溶液に簡単にセンサーを浸し。センサは、複数の実験のために使用することができるが、これらは、センサ水分補給....
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結果
酵素微小電極のバイオセンサーの設計は、いずれかのエキソビボまたはインビボ研究の一般的実験計画を図1【選択を使用するセンサや外科的処置に示されている。全体の腎臓中の分析物のリアルタイム検出を可能にするかどうか調査によって異なりますエクスビボまたはインビボです 。
再現性のある結果、正確な前後のキャリブレーションを得るためにある重要。 図6Aは、校正中にex vivoでのATPセンサーから見た信号の代表的なトレースを示しています。すぐにアピラーゼ（注）は、ATP信号を排除しました。カタラーゼは、ATPの信号に影響を及ぼさなかったし、それが（ 図6B）を生成するH 2 O 2への特異性を示します。較正手順は、ATP（ 図6A、右パネル）の動的な変化を計算するために使用される線形近似を生成す.......
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ディスカッション
現在のプロトコルは、ATPの強化時間・空間分解能を提供するために開発したex vivoでの灌流、単離され、in vivoでの血液灌流腎臓用のH 2 O 2シグナリングが。プロトコルと、ここで使用されるセンサとの違いは、薬理学的薬剤または生理学的研究のいずれかに最適なデータ収集を提供します。プロトコルは、1）センサ較正、2）外科的処置、3）データ収集の設定、及び4）データ分析から成ります。彼らは、多くの実験条件のための検体のリアルタイム測定を可能にします。これは、より大きな腎疾患への洞察と、より効果的な薬理学的治療法の開発につながります。ここでは、ATP と H 2 O 2 を分析するためのセンサを使用していました。しかし、他の物質のためのセンサも使用可能であり、使用することができます。ここで説明するプロトコルは、ラットの腎臓でのATP および H 2 O 2を研究するために適用されるが、同じメトましたdは簡単にマウスでのアプリケーションのために調整することができます。した.......
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開示事項
この原稿のビデオ録画のためのセンサは、必ずSarissaバイオメディカル・リミテッド（コベントリー、UK）により提供されました。
謝辞
私たちは、現在の原稿に使用されるセンサーの開発に自分の仕事のために必ずSarissaバイオメディカルを感謝しています。この研究は、国立心肺血液研究所HL 116264（A.カウリー）およびHL 122662（A. StaruschenkoとA.カウリー）、医科大学によって資金を供給プロジェクト、HL108880（A. Staruschenko）を付与することによってサポートされていましたウィスコンシン調査委員会の＃9306830（O. Palygin）と健康ウィスコンシン研究教育プログラム＃9520217を推進、国立腎臓財団の若手研究グラント（O. Palygin）。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| センサーキット | Sarissa Biomedical | SBK-ATP-05-125 | このキットには、保存ボトル、再水和チャンバー、電極リード線、および参照電極が含まれています。 また、キットには、ユーザーが選択できるセンサーも含まれています。 |
| Sarissaprobe ATP バイオセンサー 125 μm | Sarissa Biomedical | SBS-ATP-05-125 | 2-8 oCで保管 |
| 使用前に Sarissagold ATP Biosensor 50 μm | Sarissa Biomedical | SGS-ATP-10-50 | 2-8 oCで保管 |
| 使用前に Sarissaprobe ヌルセンサー 125 μm | Sarissa Biomedical | SBS-NUL-20-125 | 2-8 oCで保管 |
| 使用前に Sarissagold ヌル センサー 50 μm | Sarissa Biomedical | SGS-NUL-10-50 | 2-8 oC で保管 |
| 使用前に Sarissaprobe ATP Manual | Sarissa Biomedical | http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf | |
| >ファラデーケージ | TMC | ||
| デュアルチャンネルポテンショスタット | Digi-Ivy | DY2021 | Type II ファラデーケージ |
| データ収集プログラム | Digi-Ivy | DY2000 | |
| 灌流ポンプ | Razel Scientific Instruments | Model R99E | |
| 光ファイバーイルミネーター | Schott | ACE1 | |
| マイクロマニピュレーター | 成重 | MM-3 | |
| マイクロマニピュレーター 磁気スタンド | 成重 | GJ-8 | |
| エアテーブル | TMC | 63-500 | |
| イソフルランベンチレーター | LEI Medical | M2000 | |
| 3 ml ペトリ皿 | ッシャーサイエンティフィック | S3358OA | |
| 針 | サンタクルーズ | 26-30 G | |
| ピン | 標準解剖ピン | ||
| ポリエチレンチューブ (PE50) | |||
| カテーテル 組織接着剤 | Vetbond | 1469SB | |
| 縫合糸 | Look | SP117 | |
| 輪ゴム | 任意の 2-4 mm 幅の輪ゴム | ||
| シリコーン | モメンティブ | RTV-615 クリア 1# | |
| clamp | ファイン サイエンス ツール | 18052-03 | |
| 標準解剖キット | にはメスと解剖はさみが含まれている必要があります | ||
| キドニーカップ | 独自の設計 | ||
| の標準化学物質 | Sigma-Aldrich | ||
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559-25UMO | 100 mM ATP溶液 |
| 過酸化水素 | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| グリセロール | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich | A7646 | |
| カタラーゼ | Sigma-Aldrich | C40 | |
| イソフルラン | クリッパー | 10250 | |
| イナクチン | Sigma-Aldrich | T133 | |
| ケタミン | クリッパー | 2010012 | |
| ハンクス バランス塩溶液 | ギブコ | 14025092 |
参考文献
- Palygin, O., Staruschenko, A. Detection of endogenous substances with enzymatic microelectrode biosensors in the kidney. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 305, 89-91 (2013).
- Clark, L. C., Lyons, C. Electrode systems for con....
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再版と許可
