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方法論記事

酵素バイオセンサの使用は、内因性ATPまたはHを定量します

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DOI:

10.3791/53059

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2015年10月12日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Medical College of Wisconsin

この記事について

サマリー

酵素微小電極バイオセンサーは、生物学的に関連性のある濃度での細胞外細胞シグナル伝達のリアルタイム測定を可能にします。 以下のプロトコルは、バイオセンサーのアプリケーションを、腎臓におけるATPおよびH2O2のex vivoおよびin vivo検出に拡張します。

要約

酵素微小バイオセンサーは広くリアルタイムで細胞外シグナルを測定するために使用されてきました。それらの用途のほとんどは、脳切片および神経細胞培養物に限られていました。最近、この技術は、全体の臓器に適用されています。センサ設計の進歩は、血液灌流生体腎臓内での細胞のシグナル伝達の測定を可能にしました。現在のプロトコルは、ラット腎臓の間質におけるATP と H 2 O 2のシグナル伝達を測定するために必要な手順を示します。二つの別々のセンサ設計は、 エキソビボおよびインビボのプロトコールにおいて使用されます 。センサーの両方のタイプは、高速応答、高感度かつ選択的なバイオセンサーを与えるために選択透過性層の上に薄い酵素生物層で被覆されています。選択透過性膜は、生体組織内の干渉から信号を保護し、酵素層は、グリセロールキナーゼとグリセロール-3- PHOSの連続触媒反応を利用しATPの存在下で酸塩オキシダーゼはH 2 O 2を生成します。 ex vivoでの研究のために使用されるセンサのセットは、さらに、白金/イリジウム白金（Pt-IR）は、ワイヤ電極の上にH 2 O 2の酸化による分析物を検出しました。 in vivoでの研究のためのセンサーではなく、血液灌流組織のために設計されたメディエータコーティングされた金電極上のH 2 O 2の還元に基づいています。最終濃度の変化は、分析物の既知濃度のキャリブレーションに続いて、リアルタイムの電流測定により検出されます。また、電流測定信号の特異性は、それに対応し、H 2 O 2及びATPを分解し、そのようなカタラーゼやアピラーゼなどの酵素を添加することによって確認することができます。これらのセンサは、各実験の前と後の正確なキャリブレーションに大きく依存しています。次の2つのプロトコルは、ATPとH 2のリアルタイム検出の研究を確立します腎組織中のO 2は 、さらに他の生物学的製剤または全臓器での使用のために記載した方法を拡張するために改変することができます。

概要

（も、本原稿内のセンサとして参照）酵素微小電極のバイオセンサーは、生細胞や組織におけるダイナミックなシグナル伝達プロセスを研究するための貴重なツールとなっています。センサーは、生物学的に関連する濃度で、細胞シグナル伝達分子の時間的および空間分解能が向上してい。サンプリングと長期間にわたって間隔で採取した細胞外体液を分析する代わりに、これらのセンサは、高速、その酵素は、それによってリアルタイム測定1,2を製造 、分析物に反応するように反応します。高速プリンまたは過酸化水素のようなオートクリンおよびパラクリン因子の間質濃度の検出、及びそれらの放出の動力学は、正常および病的状態3における薬剤の効果のプロファイルを確立するために使用することができます。現在、センサを使用するアプリケーションの大部分は、脳組織切片および細胞培養物4-10にされています。この原稿を目的に詳細なプロトコル正確全体腎臓中の分析物のリアルタイムの濃度を測定する手段を確立します。

以下のプロトコルは、腎臓で間質ATP及びH 2 O 2シグナル伝達を研究するために開発されました。腎臓のネイティブ環境では、細胞外ATPは急速にその誘導体（ADP、AMPおよびアデノシン）に内因性ectonucleotidasesによって異化されます。ここで使用されるセンサは、他のプリンまたはATPの分解生成物11の上に、ATPに高度に選択的です。それはATP放出とそのシグナル伝達機能の定数と動的濃度の正確なモニタリングを可能にするので、これは大きな利点を提供しています。間質ATP濃度は、二つの微小電極、ATPセンサ及びヌルセンサーの組み合わせを使用して測定されます。カタラーゼのアプリケーションとの組み合わせでヌルのセンサは、間質H 2 O 2濃度12を検出することができます 。次のプロトコルは、戦争の二つの異なるデザインを使用しますエキソビボまたはインビボのいずれかのアプリケーションでのための最適な特性を持つRS。

両方の設計は、センサ酵素層中に含まれるグリセロールキナーゼとグリセロール-3-リン酸オキシダーゼの逐次触媒反応に基づいており、ATPの存在によって駆動されます。 ex vivoでの研究で使用されるセンサのセットでは、H 2 O 2、最終酵素反応生成物は、白金/イリジウム白金（Pt-IR）は、ワイヤ電極上の酸化によって検出されます。 in vivoでの研究のためのセンサーではなく、血液灌流組織のために設計されたメディエータコーティングされた金電極上に2 O 2還元 Hに基づいています。 図1に示す本原稿に記載され両方のプロトコルのスキームです。それが結合酵素を欠いている以外ヌルセンサーは、対応するATPセンサーと同じです。したがって、カタラーゼ酵素とH 2 O 2の検出に加えて、ヌルセンサMEAsures非特異的な干渉を。 ATP濃度は、ATPセンサ信号からの非特異的な干渉および背景H 2 O 2を検出したヌルを減算することによって計算されます。対応するヌルと対になったときに、いくつかのセンサは、アデノシン、ionosine、ヒポキサンチン、アセチルコリン、コリン、グルタミン酸、グルコース、乳酸、ex vivoでのアプリケーションまたはアデノシン、ionosine、およびin vivoのためのヒポキサンチンのためのD-セリンを含む他の検体を検出するために、市販されていますセンサー。

正確に検体を検出するためのセンサの能力は、適切な前後のキャリブレーション13に依存します。これは、分析は、生物学的組織での使用時に発生するセンサ感度のドリフトを占めていることを保証します。センサは、センサの酵素反応における試薬として使用されるグリセロールのデポを保持しています。センサはグリセロールを含む浴溶液中で使用されていない場合、それは時間をかけて洗います。短いRecording回次に、センサドリフトを最小化するために必要です。さらに、内因性プロテアーゼとタンパク質断片によって汚れセンサーが大きく、センサ14の感度を減少させることができます。

現在の原稿は 、ex vivo およびインビボ腎臓製剤中の酵素微小電極のバイオセンサーの使用を確立します。リアルタイムの分析物の定量化は、腎疾患や薬剤のメカニズムに新たな洞察を明らかにすることができる細胞内シグナル伝達の前例のない詳細を提供します。

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プロトコル

実験動物の管理と使用に関するNI​​Hガイドに付着した以下の動物手順。事前承認は、施設内動物管理使用委員会（IACUC）から入手しました。
注：センサーメーカーの説明書のレビューは、実験の設計時およびそれらの使用前に行われるべきです。センサーを使用している場合、これらの命令に従うことで、最適な結果が得られます。

1.センサーのキャリブレーション

  1. 実験の開始前に、新鮮なストック溶液を準備します。
  2. 10mMのNaPi緩衝液、100mMのNaCl、1mMのMgCl 2、2mMのグリセロールを含む緩衝液Aを作成します。 NaOHを用いてpHを7.4に調整します。 2〜8℃で保存してください。
  3. -20℃で保存株式ATP濃度（100 mm）を使用して、緩衝液Aの90μlに10μlの株式を追加することにより、新鮮な10 mMのATP校正ソリューションを作成
  4. トンにその先端（ 図2）を配置することにより、ATPセンサーを再水和2〜8℃で少なくとも10分間、緩衝液Aを含む彼水分補給室。
    注：再水和の後、センサは、以上20秒間空気に曝されるべきではないか、センサ感度が低下することがあります。空気に長時間露光が予想される場合は、グリセロールの溶液に簡単にセンサーを浸し。センサは、複数の実験のために使用することができるが、これらは、センサ水分補給と同じ日に行われなければなりません。センサは、最大24時間、緩衝液Aでの再水和チャンバ内に格納することができます。
  5. デュアルチャネルポテンショスタット（ 図3）をオンにし、記録システムソフトウェアを起動します。
  6. 校正室に緩衝液Aプレイス3mlの基準電極との校正室を準備します。その後、マニピュレータに取り付け、キャリブレーションチャンバ溶液に挿入し、再水和室から各センサーを取ります。
    注：校正​​室のような標準的なシリコンコーティングされたシャーレを使用します。すべてのキャリブレーションを実施し、ST電流測定の記録（ 図4）の間に信号ノイズを低減するために、高性能ラボ空気テーブルにファラデーケージ内udies。キャリブレーションは、最高の可能な限りのデータ収集の開始に近くで行われています。 インビボ用途のためのキャリブレーションのための最適な時間は、動物の手術後の回復期間の間にあります。
  7. ex vivoでのキャリブレーション
    1. 10サイクルのための100 mVの/秒の速度で500 mVのに-500 mVのからセンサーを循環させることにより、校正室でのサイクリックボルタンメトリーを実行します。これは非常に、センサの感度を向上させます。 10サイクルから見たトレースについては、図5を参照してください 。
    2. 最後のサイクルの後に600 mVのにセンサーを分極。センサ電流は、漸近線に減衰します。安定した読み取りが5分の最小後に達成されます。ゼロ読書を記録します。
  8. インビボセンサ較正で
    1. in vivoでの戦争にサイクリックボルタンメトリーを実行しないでくださいRS。代わりに、500 mVで30秒間の較正室にセンサを偏光。その後、0 mVのにポテンショスタットを設定し、センサ電流が漸近線に上昇することができます。センサ電流は漸近線に少なくとも2分かかります。ゼロ読書を記録します。
  9. 連続して所望の検出範囲を網羅する検量線を生成するためにチャンバー内にATP溶液のセット量を追加します。 ATP溶液は、ATPがチャンバ全体に均等に拡散するにつれて減衰が続く、最初にセンサ信号に鋭いピークを生成します。記録信号の値は、信号レベル一旦各ATPを添加した後、図6A及び図7のトレースを安定化し、それぞれ、 インビボ研究の両方エキソビボおよび内 ATP濃度を示唆しています。
    注：これは、分析物の捕捉剤を使用することにより、電極の選択性を確認することが重要です。現在のプロトコルは 2 O 2信号（ 図6B）。薬物を投与する場合は、センサーとの反応性の測定は、試験の前に決定されるべきです。
  10. ATPセンサー（ゼロレベル（ 図7）に削減する必要があり、ATPのアプリケーションによって生成される電流の特異性をテストするために2 mg / mlの（89 UN / mg）をストックからアピラーゼの3μLを追加します。
  11. ヌルセンサー（H 2 O 2のアプリケーションによって生成される電流がゼロの読み取りに減らす必要があります）の特異性をテストするために2mg / mlの（100 UN / mg）をストックからカタラーゼの3μLを追加します。

センサーの研究2.動物の手術

  1. ex vivoでの手術
    1. イソフルラン（5％誘導、1.5〜2.5％のメンテナンス）/医療グレードのO 2または他の承認された方法で実験動物を麻酔。15 '12動物は、継続的に、麻酔の適切なレベルを確保するために監視されなければなりません。セントできる呼吸数及びつま先ピンチ反応は、適切な麻酔を確認するために使用されます。
      注：承認済みIACUCプロトコルに従って動物を安楽死させます。すべての非生存手続きの完了時に動物12の人道的な終焉を確実にするために開胸誘導気胸により深く麻酔をかけた動物を安楽死させます。
    2. 仰臥位で温度制御手術台の上にラットを置きます。適切な麻酔深度を維持しながら、左腎臓に沿って約5cmの正中切開を行い、遠位腹部大動脈を露出させます。
    3. 腹腔と上腸間膜動脈、およびこれらの動脈上の腹部大動脈の周りの合字をラップするが連結しないでください。腎動脈下の腹部大動脈約2合字を包みます。
    4. 合字以上の腹部大動脈をクランプします。下の合字を接続します。ポリエチレン管（PE50）と腹部大動脈をカテーテルを挿入。二大動脈結紮でカテーテルを固定します。
    5. クランプを外し、腸間膜や腹腔動脈を結紮。腎臓が完全にブランチングされるまで2〜3分間室温でハンクス平衡塩溶液で6 ml /分で腎臓を灌流。
    6. 大動脈の一部を接続腎臓およびカテーテルを、切り出します。浴溶液を充填した3ミリリットルのペトリ皿に腎臓を置きます。
      注：実験プロトコルは、室温で行うことができます。 145のNaCl、4.5のKCl、2のMgCl 2、1のCaCl 2、10 HEPES、NaOHでpH調整7.35：浴溶液はmm含まれています。
  2. in vivoでの手術
    1. 承認されたIACUCプロトコルを用いてラットを麻酔。 in vivoでの分析のためにケタミン（20 mgの/ kgのIM）とinactin（50ミリグラム/ kg、腹腔内）でラットを麻酔。動物は、継続的に、麻酔の適切なレベルを確保するために監視されなければなりません。安定した呼吸数及びつま先ピンチ反応は、適切な麻酔を確認するために使用されます。
    2. 適切な麻酔深度が得られた後edは、エアテーブルの上に配置された温度制御された接地面上に仰臥位にラットを配置します。表面は、予熱し36℃に維持されるべきです。
    3. 適切な麻酔深度を維持しながら、正中切開腎臓に沿って約5cmを作ります。
    4. 腎臓全体が表示されるように、皮膚や皮下組織を偏向し、固定するために縫合糸を使用してください。あらゆる動きアーチファクトを最小限にするために腎臓カップに腎臓を置きます。
    5. 血液量を維持するために、頚静脈を介して1ミリリットル/ 100グラム/時で0.9％のNaCl：2％BSAのIV注入を使用します。尿採取のための両方の尿管にカニューレを挿入。上腸間膜や腹腔動脈と腎灌流圧（ 図10A）を操作するための遠位大動脈の周りに置きネクタイ。
    6. 薬剤の適用は、in vivo実験中に必要とされる場合、間質カテーテルの挿入は、（ 図10Bに推奨されます）。

3.データ集録のセットアップ

  1. データ収集プログラムを開き、両方のex vivoおよび陽極ポジティブにin vivo実験のためにその極性を設定します。 ASCIIコードなどのデータを保存するためのプログラムを設定します。
  2. 腎臓へのセンサーの迅速な挿入のためのマイクロマニピュレーターを置きます。
    注：別の方法として、センサーの所望の配置を達成するためにマイクロマニピュレータに取り付けられたダミープローブを使用しています。
  3. エクスビボデータ収集
    1. 650μL/ minの一定速度でカニューレを挿入し、大動脈を介して（2.1.6）から浴溶液で腎臓を灌流。手術用ハサミを使用して、慎重にセンサ挿入するために必要な腎臓カプセルを、削除してください。
    2. ゴムバンド腎臓の上に縛り付けとピンとシリコーンコートディッシュに付着して腎臓を固定します。
    3. に沈め、その先端とペトリ皿の中で腎臓に近い基準電極を配置緩衝溶液。
  4. インビボでのデータ取得で
    1. 腎臓カップに腎臓を置きます。動物の歪みや年齢に応じて緩やかに腎臓を保持しているカップのサイズを使用します。8に示す腎臓カップの2つのサイズを図 。同様のカップは、微小穿刺等16と腎臓機能の分析に焦点を当てた異なる生理学的なアプローチのために使用されます。
      注意：腎臓カップの位置は、動物の呼吸によって生成された機械的ノイズを除去することが重要ですが、妨害または腎臓灌流または尿の流れを遮断しないようにしてください。
    2. データ収集を行う前に、回復時間の45分を許可します。
    3. 26-30G針を使用して、腎臓におけるセンサーの所望の位置と深さでパンク穴を作ります。滲出血液を除去するために表面の穴を吸い取ります。腎臓の表面にグリセロール溶液を加えます。これは、実験中に乾燥から腎臓表面を防ぐことができます。
    4. 再水和室から第一のセンサを取り外し、マイクロマニピュレータに取り付けます。すぐに、20秒以内に、腎臓における新規に作成した穴に電極を挿入します。繰り返しヌルセンサーの3.5から3.9を繰り返します。
    5. センサからから約1cm、腎臓に参照電極を挿入します。
  5. ポテンショスタットをオンにして、コンピューター上の記録プログラムを活性化させる。 図9は、ex vivoで腎臓データ収集の最終セットアップを示します。 図10は、挿入されたカテーテルを用いたインビボ腎臓データ収集の最終セットアップを示します。

4.データ解析

  1. 起源または他の同様のソフトウェアへのASCIIデータファイルをインポートします。
  2. 集中現在の関係
    1. 現在まで直線濃度（x軸 ）を構築するために、ATPまたはH 2（Y -軸）の関係を線形フィット/外挿機能を使用 O 2の較正点（ 図6および図7）。
      線形適合ライン：Y = MX + B
  3. 濃度への電流を同一視
  4. 細胞内ATPによって生成される実際の電流を得るためにATPセンサのものからヌルセンサの測定されたトレースを引きます。
  5. 4.2.1で詳述した較正式を用いてnmの電流測定により得られたpAの中のATP値に変換します。 「X」の値にそれぞれ調整電流をインポートするとy（分析物の濃度）を解くことにより、ATPセンサの減算データトレースの濃度を決定します。
  6. 必要に応じて同様に、その検量線からH 2 O 2濃度を算出。

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結果

酵素微小電極のバイオセンサーの設計は、いずれかのエキソビボまたはインビボ研究の一般的実験計画を図1【選択を使用するセンサや外科的処置に示されている。全体の腎臓中の分析物のリアルタイム検出を可能にするかどうか調査によって異なりますエクスビボまたはインビボです 。

再現性のある結果、正確な前後のキャリブレーションを得るためにある重要。 図6Aは、校正中にex vivoでのATPセンサーから見た信号の代表的なトレースを示しています。すぐにアピラーゼ（注）は、ATP信号を排除しました。カタラーゼは、ATPの信号に影響を及ぼさなかったし、それが（ 図6B）を生成するH 2 O 2への特異性を示します。較正手順は、ATP（ 図6A、右パネル）の動的な変化を計算するために使用される線形近似を生成す...

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ディスカッション

現在のプロトコルは、ATPの強化時間・空間分解能を提供するために開発したex vivoでの灌流、単離され、in vivoでの血液灌流腎臓用のH 2 O 2シグナリングが。プロトコルと、ここで使用されるセンサとの違いは、薬理学的薬剤または生理学的研究のいずれかに最適なデータ収集を提供します。プロトコルは、1）センサ較正、2）外科的処置、3）データ収集の設定、及び4）データ分析から成ります。彼らは、多くの実験条件のための検体のリアルタイム測定を可能にします。これは、より大きな腎疾患への洞察と、より効果的な薬理学的治療法の開発につながります。ここでは、ATP と H 2 O 2 を分析するためのセンサを使用していました。しかし、他の物質のためのセンサも使用可能であり、使用することができます。ここで説明するプロトコルは、ラットの腎臓でのATP および H 2 O 2を研究するために適用されるが、同じメトましたdは簡単にマウスでのアプリケーションのために調整することができます。した...

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開示事項

この原稿のビデオ録画のためのセンサは、必ずSarissaバイオメディカル・リミテッド（コベントリー、UK）により提供されました。

謝辞

私たちは、現在の原稿に使用されるセンサーの開発に自分の仕事のために必ずSarissaバイオメディカルを感謝しています。この研究は、国立心肺血液研究所HL 116264（A.カウリー）およびHL 122662（A. StaruschenkoとA.カウリー）、医科大学によって資金を供給プロジェクト、HL108880（A. Staruschenko）を付与することによってサポートされていましたウィスコンシン調査委員会の＃9306830（O. Palygin）と健康ウィスコンシン研究教育プログラム＃9520217を推進、国立腎臓財団の若手研究グラント（O. Palygin）。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
センサーキットSarissa BiomedicalSBK-ATP-05-125このキットには、保存ボトル、再水和チャンバー、電極リード線、および参照電極が含まれています。 また、キットには、ユーザーが選択できるセンサーも含まれています。
Sarissaprobe ATP バイオセンサー 125 μmSarissa BiomedicalSBS-ATP-05-1252-8 oCで保管
使用前に Sarissagold ATP Biosensor 50 μmSarissa BiomedicalSGS-ATP-10-502-8 oCで保管
使用前に Sarissaprobe ヌルセンサー 125 μmSarissa BiomedicalSBS-NUL-20-1252-8 oCで保管
使用前に Sarissagold ヌル センサー 50 μmSarissa BiomedicalSGS-NUL-10-502-8 oC で保管
使用前に Sarissaprobe ATP ManualSarissa Biomedicalhttp://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf
>ファラデーケージ TMC
デュアルチャンネルポテンショスタットDigi-IvyDY2021Type II ファラデーケージ
データ収集プログラムDigi-IvyDY2000
灌流ポンプRazel Scientific InstrumentsModel R99E
光ファイバーイルミネーターSchottACE1
マイクロマニピュレーター成重MM-3
マイクロマニピュレーター 磁気スタンド成重GJ-8
エアテーブルTMC63-500
イソフルランベンチレーターLEI MedicalM2000
3 ml ペトリ皿ッシャーサイエンティフィックS3358OA
針サンタクルーズ26-30 G
ピン標準解剖ピン
ポリエチレンチューブ (PE50)
カテーテル 組織接着剤Vetbond1469SB
縫合糸LookSP117
輪ゴム任意の 2-4 mm 幅の輪ゴム
シリコーンモメンティブRTV-615 クリア 1#
clampファイン サイエンス ツール18052-03
標準解剖キットにはメスと解剖はさみが含まれている必要があります 
キドニーカップ独自の設計
の標準化学物質Sigma-Aldrich
ATPSigma-AldrichA6559-25UMO100 mM ATP溶液
過酸化水素Sigma-Aldrich216763
グリセロールSigma-AldrichG9012
ApyraseSigma-AldrichA7646
カタラーゼSigma-AldrichC40
イソフルランクリッパー10250
イナクチンSigma-AldrichT133
ケタミンクリッパー2010012
ハンクス バランス塩溶液 ギブコ14025092
フィカテーテル キット

参考文献

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