商工会議所のコンポーネントとマルチスケール光イメージングの3次元印刷を組み込むColliculo、視床皮質マウス脳スライスの変更、

Summary

マウスの仔の脳をカットするために、複数の角度を使用して、我々は主要な聴覚中脳と前脳構造のほとんどの間の接続をキャプチャ前述の急性脳スライスを改善。

Abstract

感覚情報を処理する脳の能力は、上昇する投影と下降する投影の両方に依存しています。最近まで、これら2つのシステムとその相互作用を研究する唯一の方法は、in vivo調製物を使用することでした。体性感覚系、視覚系、聴覚系の視床皮質および皮質-視床経路を含む急性脳スライスにより、大きな進歩が見られました。最近、聴覚視床皮質スライス¹を改良したことで、主要な聴覚中脳と前脳の構造である下丘(IC)、内側膝状体(MGB)、視床網状核(TRN)、聴覚皮質(AC)の間の突起をより確実に捉えることができるようになりました。これらすべての接続の一部を保持することで、in vivo調製物で答えることができる質問を補完する詳細な質問に答えることができます。フラビンタンパク質自家蛍光イメージングを使用することで、任意のスライスの結合性を迅速に評価し、その後の実験を導くことができます。このスライスを記録およびイメージング技術と組み合わせて使用することで、情報が皮質に上昇するときに聴覚前脳の各ポイントで情報処理がどのように行われるか、および下行皮質変調の影響を理解するための準備が整いました。スライスチャンバーコンポーネントを構築するための3Dプリンティングは、両面灌流とスライス内のネットワークへの広範なアクセスを可能にし、この調製を十分に活用するための鍵となる広範な接続を維持します。

Introduction

感覚周と下丘間の情報の実質的な処理があるが、それは聴覚皮質に到達する前に聴覚系では、かなりの追加処理があります。私たちは、その処理が行われ、したがって、その変換は、脳が入ってくる感覚情報を解釈することを可能にする方法についてはほとんどされている方法についてはほとんど知りません。嗅覚を除いて、感覚のそれぞれは、周辺の信号と非常によく似た組織は、最初に信号が皮質に上昇として低下忠実に中継されています。皮質は、その後さらに、着信情報を変調するために下側の構造体への投影を送信します。この複雑なシステムは 、インビボならびにインビトロでの製剤の数の様々な方法で研究されています。前者では、すべての接続は、感覚入力を制御し、測定しながら、接続の任意のセットを調べるために研究者を可能にする、完全です任意の与えられた領域で出力されます。このアプローチでは、強烈に複雑な出力を生じさせる他の感覚入力、覚醒、と注意を含む他の入力、多種多様なの制御なしにほとんどありません。in vitroでは、脳切片は、単一のセットのいずれかをキャプチャするためにカットされています突出部、または研究者が様々な求心性神経や脳の領域を刺激し、評価することができ、接続された2つの脳領域の。これらは、多くの場合、皮質への視床や視床に入力し、その出力のいずれかが^2-5を保存している視床皮質またはtectothalamicスライスのいずれかです。これらの製剤は、薬理学的、電気的、およびoptogenetic操作の多種多様なことができます。しかし、2つだけの脳領域で、それらは主に情報の伝達を評価し、それが視床通過などの情報の変換を評価する能力を欠いています。また、注目変調^6-9に役割を果たしている可能性細網視床投射は、広報でありますこのスライスでESENT。ここでは、どのように視床ゲートとフィルタ情報のユニークな視点を与えるために視床へのさまざまな入力の研究者の制御を可能にする私達の前の準備^1、時の改善を示しています。私たち夫婦単一細胞レベルでのさまざまな入力の影響を測定するために、スライスの接続や大規模化分析、ニューロン集団の分析のための視床におけるカルシウムイメージング、および単一細胞記録を評価するためのフラビンタンパク質の自己蛍光イメージングとこの新規スライス標本。

これらの広範囲の接続を維持するのを助けるために、我々はまた、強化された灌流のためのスライスを上昇させるために所定の位置に脳切片とブリッジを保持するための通常のスライスアンカー（別名「ハープ」）の変更の数を開発しました。ハープはスライスを囲むとハープの文字列のカスタマイズ可能なアタッチメントポイントを可能にするように修正された馬蹄形状に設計されています。 3つの文字列があります添付i）1種がii）1つは、ACの尾側縁に、ICの尾端から延びており、III）一つの領域にスライスの内側縁から斜め拡張し、スライスの内側エッジに沿って水平に位置するようにAC（ 図1Aを参照）吻側。ハープ文字列の（シアノアクリレート接着剤で）接着のためのフレームの小さなくぼみ（図1B参照 ）、スライスの整合性を維持するためにスライスに圧力の低下量を可能にします。 3次元印刷を使用することにより、我々はデザインが独自の仕様、ならびに組織の上下の人工脳脊髄液（aCSFの）の理想的な流れを可能にするブリッジにハープカスタムすることができます。これはまた、パッチクランプ電気生理学のための組織を貫通する光のために広い面積を維持します。

Protocol

すべての手順は、イリノイ大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。全ての動物は、実験動物管理の認定のためのアメリカ協会によって承認された動物管理施設に収容しました。すべての試みが使用される動物の数を最小限にするために、研究のすべての段階での苦しみを軽減させました。

1.準備やスライスのためのマウスからの脳の除去

1. 灌流およびスライスのインキュベーションのために準備します。
   1. 約30分スライスする前に、記録またはイメージングする前に、スライスのインキュベーションのために高スクロース切削液と低カルシウムaCSFのを準備します。
   2. すべての必要なツール（大平滑末端はさみ、小さな春のはさみ、解剖鉗子、大きなハサミやギロチン、アイリスはさみ、宝石商の鉗子、27Gのx 1/2インチの針で10mlシリンジ、1センチメートル×2センチフィルタの小片をレイアウト紙、SLのための壊れひっくり返したパスツールピペットアイス灌流およびスライス用の転送）、および灌流トレイを準備します。
   3. ^32°Cの水浴とソリューションを切断で満たされた培養皿に酸素化aCSFのでチャンバーをインキュベート設定します。
2. スライスのための段階を切断準備します。
   1. 脳のためのバックストップとして使用する3％寒天約1cm ³の小片をカットし、1.5センチメートルX 1.5ミリメートルのICを下支えするために使用されるバンプ用×3 mmです。
   2. シアノアクリレート系接着剤と同様に、彼らは80 ^Oの角度を形成するように、バックストップの右側上のバンプと、ステージ上にバックストップを接着。
3. 脳を削除します。
   1. 深くP12-P20ケタミンを100mg / kgおよびxylaxineに3mg / kgの（または同等の倫理委員会承認手続き）と（理想的にp14-18）は、マウスを麻酔。
      注：つま先のピンチに応答の欠如を経由して、適切な麻酔レベルを確認してください。動物が麻酔簡単に下にあるように、眼軟膏は不要です。
   2. 鈍使用はさみを終了し、剣状突起から首に胸郭を公開します。
      1. 剣状突起を検索し、約1.5 cmで水平カットを行います。
      2. 肩に前の水平カットの端から2つの垂直カットを行い、約1.5センチメートルそれぞれ。
   3. 心臓を露出するダイアフラムとcostochondral接合を通してカット。
   4. 小さな春のはさみで、心の側を背ために腹側から、右心房にある小さな2〜5ミリのカットを行います。
   5. 27Gのx 1/2インチ針を10ミリリットル注射器を使用して、左心室を注入し、迅速に高スクロース切断溶液で動物を灌流。
   6. 血液が明確で実行されると、頭部を削除するには、大きなハサミを使用しています。
      注：私たちは、体系的灌流の有用性を評価されていません。しかし、我々の経験では、この若いマウスで経心臓灌流は、ほぼ100％の成功で行うことができ、赤BLを排除するという利点を持っています蛍光を発するとイメージングを妨害することがOOD細胞。
   7. 頭蓋骨を露出するために正中線を皮膚を削減。
   8. 曲がったアイリスのはさみを使用して、その後、慎重に下に脳に損傷を与えないように注意して正中縫合糸に沿って後方の前方からカット目の間のカットから出発し、目の間の頭蓋骨を切りました。
      注意：硬膜は通常、頭蓋骨と外れます。必要に応じて、慎重に脳を削除する前に硬膜を削除します。
   9. 宝石の鉗子を使用して、プライ頭蓋骨を開き、慎重に脳を削除し、次いでこの溶液を切断中に脳を置きます。皮質の損傷を防ぐために注意してください。

2.スライスのための脳の準備

1. ビブラトームステージに取り付けるための脳を準備。
   1. 90 ^Oの2つのラインが付いているスライドと左上から右下へ¹⁷ Oで対角線を使用して、2つの線が交わる使用して、アップ脳の背側を配置し、交差かみそりの刃は、平坦な表面を作成吻端脳2-4ミリ削除します。
   2. 新しく作成された平らな面に脳尾側を上に置き、水平および垂直線と脳の正中線と脳の背側表面の位置を合わせます。
   3. （水平面と冠状から60 ^oから 17 ^o）の 、17 ^Oラインにカミソリの刃を合わせ30 ^Oの角度でカミソリを傾け、ダブル斜めカットで右皮質の約3mmを削除します。
2. ビブラトームステージ上で脳をマウント。
   1. 長い寸法が正中線に垂直になるようにろ紙脳の腹側に約1cm×2センチの小片を置きます。
   2. 慎重にバックストップ（バンプの左側）の前の領域にシアノアクリレート接着剤の少量を適用します。
   3. 脳と後脳の尾の部分があるようにPR接着剤上に二重斜めにカット脳の顔を配置バンプ時にoppedと脳の右側はバックストップに反しています。
   4. 繊細全面をスライスチャンバーに接触していることを確認して、脳を押し下げます。

3. Colliculo-視床皮質スライスの取得

1. すぐに、ビブラトームで切断段階と場所を取るソリューションを切断して、ステージを埋めます。
2. 脳の上部（腹側）とブレードの位置を合わせます。
3. 、脳の上から1〜1.5ミリメートルを削除300-500ミクロンのスライスを削除し、除去した後の深さを評価します。
   注：IC、MGB、および外側膝状核（LGN）がすべて表示され、および歯状回は、「C」形状は、2つの600ミクロンのスライスに1を取る形成する場合。 図3Aを参照してください。
4. チャンバーを保持する加熱中（32 ^O C）のスライスを配置します。

スライスの4イメージング

1. フラビンタンパク質の自己蛍光イメージングのための準備。
   1. 、標準の電気生理学的記録チャンバーにスライスの灌流のために_{95％O 2/5％CO} 2でバブルaCSFのをaCSFのを準備します。
   2. 刺激のためのガラス電極を引き出します。複数の異なる刺激電極と構成（ガラス、タングステン、炭素繊維、単極、双極）すべてはフラビンタンパク質の自家蛍光イメージングと一緒に非常にうまく機能していることに注意してください。
   3. コンピュータ、カメラ、マイクロマニピュレーター、光源、刺激ソフトウェア、画像キャプチャソフトウェアをオンにします。
   4. チャンバ内のスライスを上昇させるために、カスタム・ブリッジ（補足資料で利用可能なデザイン）を置き、酸素化aCSFので記録チャンバーを灌流。
      注意：灌流速度が設定したすべての個人と異なります。 5-15ミリリットル/分、ここで使用されます。
   5. 間の経路上でハープの文字列を配置しないように注意しながら、スライスの上に特別に構築されたハープを配置しながら橋をリフトオフからスライスを防止するために、チャンバ内の液体レベルを下げ、チャンバ内のスライスを配置EST（ 図1A）。スライスの上下にaCSFの流れを維持するために、スライス上の約1〜2 mmの液体レベルを上げます。
      注：再配置が必要な場合は、切断端パスツールピペットを使用するか、またはaCSFのレベルが上昇し、細心の注意を払って鉗子を使用することができます。
   6. （ 図1A参照 ）、aCSFので満たされたガラス電極に塩化銀電極を挿入マイクロマニピュレーターにガラス電極を挿入し、アイソレータを刺激し、慎重に視床につながるIC /白質にガラス電極を配置するために接続します。
2. 自家蛍光画像取得をフラビンタンパク質。
   1. 電気的に刺激しながら照射しつつ（各刺激は0.05 Hzで40 Hzの2ミリ秒パルス組織の1秒の5回からなる）105秒間4ヘルツ（無限遠補正2Xマクロ対物レンズ（NA 0.13）を使用して）、カメラで画像を収集青色光470〜490 nmおよび515 nmの上に捕獲で組織。画像であることを確認してくださいどちらにO暗く、また吹き出さ参照図3は、参考のために列を残しました。
      注：収集時間、収集頻度、および刺激周波数は、実験に合わせて変更することができ、副資材に含まれるカスタムプログラムは、次のような変形が可能です。
   2. 輸出のMatlabの画像、0.05 Hzで画像のスペクトルパワーを分析するための補足資料に使用可能なカスタム書かれたプログラムを使用して。結果として得られる画像は、接続された経路が表示されます。
      注：カスタムプログラムは、高速フーリエ変換画像を生成するために、時系列の画素値の変換を使用します。
3. カルシウムイメージングのための準備。
   1. C. ^O 32 aCSFのスライスの上部と下部の両方に到達させるために3センチ培養皿と隆起培養膜を用いた小型インキュベーションチャンバーを準備し、そして加熱パッド上の場所は、ほぼ温度を維持します
   2. 95％Oで暖かいaCSFの、ゆっくりと泡と小さなインキュベーションチャンバーを埋めます_{2/5％CO 2。}
   3. 2プルロニックF-127酸μlのDMSOを48μlの溶解のFura-2AMの50μgのミックス。
   4. 隆起した膜と慎重にマイクロピペットを用いて上に小さなインキュベーションチャンバーに入れスライスは染色直接MGB上記混合物（または関心のある他の構造）を追加します。
   5. 撮像前に退色を防止するために、スライスをカバーし、スライスを45分間インキュベートすることを可能にする - 1時間。
   6. 余分な材料を洗浄するために10〜15分間加熱保持室にスライスを削除します。
   7. 刺激するための準備や画像colliculo-視床皮質スライスのために4.1.6にステップ4.1.1に従ってください。
4. カルシウム画像取得。
   1. 365nmの光で組織を照射し、510 nmの上に蛍光を捕捉しながら、電気的に0.2 Hzで（各刺激が1 2ミリ秒パルスからなる）5回組織を刺激しながら25秒間（20X水浸対物レンズを使用して）10Hzで画像を収集します。
   2. MATLABおよび補足資料で使用可能なカスタム書かれたプログラムを使用するエクスポート画像が0.2 Hzで画像のスペクトルパワーを分析します。結果として得られる画像は、アクティブセルが表示されます。

Results

P15マウスで得られたcolliculo -視床皮質マウス脳スライスの例を図2に示されている。理想的なスライスは、ICが刺激されたときに、すべてのアクティブ化されている4つの主要な中脳と前脳の聴覚構造IC、MGB、TRN、およびACを、含まれています（ 図2A）。フーリエ解析を使用して、スペクトルパワーを周期的刺激周波数¹⁰に同伴されるアクティビティを示す接続された脳領域と、電気刺激周波数で測定されます。このプロトコルは、特に中脳および皮質間のネクサスとして視床における情報の上昇流の研究を可能にします。含まれるこのプロトコルの接続colliculo-視床皮質スライスの生産を助けるだけでなく、3Dプリントの取り込みとハードウェアのより簡単にカスタマイズセットを提供するには、皮質への視床（ 図2Bから接続されていないスライスの一例であるが、 ）、視床はフラビンタンパク質の自家蛍光イメージング（ 図2C）での活動を示していない接続パターンとしてもです。...

Discussion

このプロトコルは、聴^{覚系における}情報の流れを研究するために、p12-20マウスにおける前述の丘状視床皮質脳スライスの改良を記述する1。この方法には、1 つのスライス内のより多くの脳領域間の接続を保持することで、他の同様の脳スライス調製に比べて多くの利点があり、研究者は前脳の聴覚核間の相互作用と相互作用を理解するための新しいツールを提供します。このプロトコルには、以前の作業¹ と比較して、接続されたスライスの歩留まりを増加させるいくつかの重要な変更があります。これらの変更には、水平面 17^o の切断角度が 20^o と比較してわずかに異なること、冠状面での角度の追加、冠状から 60^° 、IC の下のバンプが 2 mm から 1.5 mm 小さくなることが含まれます。小さいですが、これらの変更により、メソッドの収量と信頼性が大幅に向上し、練習ではスライスを80〜100%の確率で取得する必要があります。丘 - 視床皮質スライスの取得に加えて、プロトコルは、さらなる実験が行われる前にスライスが接続されていることを確認するスライスの接続性の...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
高ショ糖切削液			:206スクロース、10.0 MgCl2、11.0グルコース、1.25 NaH2PO4、26 NaHCO3、0.5 CaCl2、2.5 KCl、 pH 7.4
mM の低カルシウム aCSF			: 126 NaCl、3.0 MgCl2、10.0 グルコース、1.25 NaH2PO4、26 NaHCO3、1.0 CaCl2、2.5 KCl、 pH 7.4
aCSF			(mM): 126 NaCl, 2.0 MgCl2, 10.0 グルコース, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 2.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4
刺激アイソレーター	World Precision Instruments	A360
DMSO	Life Technologies	D12345	ロット: 1572C502
ふら-2AM	ライフテクノロジー	F1201	ロット:
144912プルロニック F-127	ライフテクノロジー	P3000MP	ロット:1499369
大型培養皿	フィッシャーブランド	08-757-13	100×15 mm 培養皿
小型培養皿	ファルコン	353001	35×10 mm 培養皿
隆起した培養膜	ミリセル	PICMORG50	スライスの両側で酸素化された液体の灌流を維持するために使用されます。
フラビンタンパク質イメージング蛍光キューブ	Olympus	UMNIB	470–励起波長490 nm、ダイクロイック波長505 nm、波長長波長515 nm。ここでは、ほぼすべての緑色蛍光タンパク質フィルターキューブが機能することがわかりました。
カルシウムイメージング蛍光キューブ	オメガオプティ	BX-18	XF1005 365 nm exitation, XF2001 400 nm 二色性, XF3080 510 nm 発光
寒天 脳			3 重量% 水中
Viper si ステレオリソグラフィー装置	3D Systems