方法論記事

初代ヒト肝細胞と非実質肝細胞の対応する主な集団の単離のためのプロトコル

DOI：

10.3791/53069

⸱

2016年3月30日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of General-, Visceral- and Transplantation Surgery, Charité University Medicine Berlin, 2Brandenburg Center for Regenerative Therapies, Charité University Medicine Berlin

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

同じドナーからヒト肝細胞と非実質肝細胞を分離する技術が説明されています。さまざまな肝細胞タイプが、機能的な肝臓モデルと組織工学の基礎を構築します。この新しい方法は、肝細胞を高収量で生存率で単離することを目的としています。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

肝実質細胞のほかに、肝臓は非実質細胞（NPC）、すなわちクッパー細胞（KC）、肝臓内皮細胞（LEC）と肝星細胞（HSC）で構成されています。初代ヒト肝細胞（PHH）の二次元（2D）培養物は、依然として薬物代謝および肝毒性のin vitro試験のための「ゴールドスタンダード」とみなされます。それはPHHの2D単作が脱分化と機能の損失に苦しんでいることはよく知られています。最近、肝NPCは、肝臓（病態）生理学およびPHH機能の維持に中心的な役割を果たしていることが示されました。現在の研究は、2Dの単一栽培の限界を克服するための3D-と共培養モデルによるインビボ組織構造の再構築に焦点を当てています。以前に我々は、ヒト肝細胞を単離する方法を公開し、実験生物学および医学1における細胞培養での使用のために、これらの細胞の適合性を調べました。このテにおいて幅広い関心に基づいて、この記事の目的をchniqueすることは、この手法を簡単に再現できるようになります、ビデオ、などの肝細胞の単離プロセスのためのより詳細なプロトコルを提供することでした。

ヒト肝細胞は、二段階EGTA /コラゲナーゼP灌流技術により外科的介入のヒト肝組織サンプルから単離しました。 PHHは、50×gで最初の遠心分離によってNPCから分離しました。密度勾配遠心分離工程は、死細胞の除去のために使用しました。個々の肝細胞集団は、特定の細胞の性質、細胞選別手順を使用して濃縮されたNPCの画分から単離しました。 PHH分離のほかに、私たちはさらなる培養のためのKC、LECとHSCを分離することができました。

まとめると、提示されたプロトコルは、1つのドナー組織サンプルから高品質と量のPHHとNPCの単離を可能にします。精製された肝細胞集団へのアクセスは、人間の李のようなin vivoでの作成 ​​が可能性があります版モデル。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ヒト肝組織は非常に複雑であり、2つの異なる細胞エンティティ、実質細胞と非実質細胞（NPC）から成ります。肝実質細胞は肝細胞と胆管を含みます。肝細胞は、全肝細胞の60〜70％を表し、代謝、肝機能のほとんどを占め、 例えば、胆汁酸および因子合成、生体内変化とエネルギー代謝2,3を補完します。

より小さいNPC画分は、全肝細胞の30〜40％を構成します。 NPCは、異なる細胞集団、すなわち、クッパー細胞（KC）、肝内皮細胞（LEC）と肝星細胞（HSC）が挙げられます。この異種細胞画分は、肝臓の生理学的プロセスにおいて中心的な役割を果たしています。さらに、NPCは、肝硬変4などの慢性肝損傷、急性肝障害を仲介する、 例えば、薬剤誘発性肝障害（DILI）に参加するだけでなく、。

近年では、時間UMAN肝細胞はますます不可欠な研究開発薬物試験の、薬剤開発および肝疾患における新たな生化学的経路の同定になっています。 インビトロ試験のためにPHHの単一栽培は依然として「ゴールドスタンダード」として考えられている5。現在の同型肝臓モデルの主な制限は、数日4内の脱分化と肝細胞の機能の喪失です。 3次元（3D）培養技術の確立は、これらの制限は、4,6を補償することができることを示しています。しかし、現代の3D培養技術は、アクション7のすべての肝毒性のモードを表示することができません。既存のin vitroモデルで不足しているNPC集団は、in vivoでの状況にこの矛盾の可能性のある理由として議論されています。それにもpathophyにおける異なる肝細胞集団との間の細胞間コミュニケーションは、生理的恒常性において中心的な役割を果たしていることが示されましたsiologicは8を処理します 。したがって、科学的な関心は、NPCとそれらの細胞間相互作用にますます焦点を当てています。共培養および組織工学システムにおけるそれらの意図的な使用はできるだけin vivoでの状況に近いですインビトロ肝モデル8,9の高い需要のためのソリューションである可能性があります。

現在、主な課題は、PHHとNPCの明確に定義された部分が含まれている標準化されたヒト肝共培養モデルの開発です。その結果、非常に異種肝細胞の分離技術が必要とされ、それらは、純粋な細胞集団を得るために最適化されなければなりません。 PHH分離のための標準化されたプロトコルが10を存在するが、人間のNPCの標準化された単離は、まだ開発中です。ほとんどの公開されたNPCの分離プロトコルは、非ヒト細胞11,12を用いた実験に基づいています。ごく少数の出版物は、人間のNPCの分離プロセスを記述し、ほとんどがカバーのみ単一の細胞型11〜16の単離のための方法。細胞分離のために活用されている最も重要な細胞特性が大きさ、密度、付着挙動、および表面タンパク質の発現です。これらの特性に基づいて、我々は実験生物学と医学 1で以前に出版されたPHH、KC、LECとHSCを単離するために簡略化されたプロトコルを開発しました。そのため、この技術において幅広い関心が、この記事の目的は、より簡単な技術を再現することができますビデオを含む、肝細胞の単離プロセスのためのより詳細なプロトコルを提供することでした。プロトコルはまた、収量と生存能力の評価のためだけでなく、特定の免疫染色を用いて同定および純度評価のための品質管理方法を含みます。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

注：すべての細胞を、一次または二次肝腫瘍を有する部分的な肝切除後に残っ切除非腫瘍性ヒト肝臓組織から単離しました。 Universitätsmedizinベルリン - 患者のインフォームドコンセントをシャリテの倫理指針に従って得ました。

材料とソリューションの作製

  1. 分離プロセス中に細菌汚染を避けるために、事前にすべての機器および材料を滅菌します。
  2. 新たに調製された消化液を除いて、 表1及び2に記載の肝臓組織試料、肝細胞および非実質肝細胞の単離方法と初代ヒト肝細胞の培養の灌流のために必要な溶液を調製使用前に。全ての溶液は4℃で保存することができ、調製後4週間以内にそれらを使用することが推奨されます。
  3. 殺菌します0.22μmのボトルトップフィルターを用いて全ての溶液。

灌流機器の作製

  1. 図1Aに示すように、肝臓組織試料の灌流および消化のための機器を設定します。
  2. 灌流および消化中に最適なコラゲナーゼPの活動を確保するために39℃に水浴温度を調整します。

肝臓組織試料の3灌流および消化（1.5時間）

  1. 切除した肝臓組織から無傷のグリソン鞘と組織サンプルを選択します。組織サンプルを切断すると、良好な可視隻と小型の切断面を得ることを試みます。輸送および灌流まで氷上で肝臓組織試料を処理することにより、暖かい虚血時間を避けてください。
  2. 無菌条件下で組織重量を取り、層流中でペトリ皿に肝臓組織試料を配置します。再から滅菌圧縮して組織試料の表面を清掃してください血液をmainingと私はすべてのカニューレが浸透したことを確認するために、1×灌流-Solutionを使用してカニューレセットをフラッシュします。
  3. いくつかのより大きな血管にカニューレのオリーブを修正するために組織接着剤を使用してください。肝臓組織試料の大きさ及び表面の血管の数に応じて、3~8カニューレで設定カニューレを使用します。灌流をテストし、漏れをチェックします。組織接着剤で、明確な1×灌流溶液Iを漏らすすべての血管を、閉じます。
  4. その穴のあいたフィルターディスク（ 図1A）上のブフナー漏斗にカニューレ肝臓組織試料を置きます。
  5. 7.5ミリリットル/分であり、使用されるカニューレの数と肝組織の抵抗に応じて14.6ミリリットル/分の蠕動ポンプの流量を設定します。現在しかし遅い灌流があることを確認するために流量を毎回調整します。全血を流し出さないが、少なくとも20分されるまで、組織を灌流。良いperfusi地域で明るくなって組織を観察に。
    注：いくつかのケースでは、プラスチッククランプを有するカニューレの一方をクランプするために必要であり得るか、または灌流を最適化するために、肝臓カプセルに対してスパチュラで静かに押して領域内の圧力を増加させます。光茶色がかった色に黄色の光への完全な色の変化は、良好な灌流を示しています。
  6. コラゲナーゼP（ 表1）を含む消化液に灌流液を変更します。
  7. 消化段階のセットアップ（ 図1A）を並べ替えます。そのため、最大15分間、 図1Bによれば消化-ソリューションの円形の流れを行います。
    注：肝臓組織サンプルが十分に消化されるとき、すぐに灌流を停止することが重要です。良好な消化は、それがスパチュラで押されると、カプセルの変形を維持することによって評価されるような組織は、弾力性の兆候を示していない場合、観察することができます。

肝細胞の単離4（1時間）

  1. Tオフ蠕動ポンプをURNとガラ​​ス皿に肝臓組織試料を配置します。氷冷ストップソリューション（ 表1）を用いて組織試料の外側を洗浄します。肝臓組織試料からカニューレを外します。カニューレが取り付けられていたエリアの中央に切開することにより、肝臓組織のサンプルを開くにはメスを使用してください。 Glisson'sカプセルが無傷のままで注意しておいてください。
  2. 組織試料の内部を洗浄した後、氷冷停止溶液で全体の組織サンプルをカバーしています。組織から細胞を解放するために穏やかに組織を振ります。
  3. 細胞懸濁液を収集し、50mlのプラスチックチューブに視線漏斗（ガーゼ湿布を敷いたプラスチック製の漏斗）を介して、それをフィルタリングします。 500 mlの最終容量が消費されるまで、肝臓組織試料に対して、より停止溶液を加えます。
  4. 遠心分離機50×gで、5分間、4℃で細胞懸濁液。後で非実質細胞の単離のために上清を収集します。 （ 図2のPBSで細胞ペレットを洗浄A）。
  5. 遠心分離機50×gで、5分間、4℃で再び細胞懸濁液。上清を収集し、肝細胞インキュベーション培地中で再懸濁ペレット（ 表2、 図2B）。
  6. トリパンブルー染色を用いて得られた細胞懸濁液中の細胞数及び生存率を決定します。ノイバウアーカウントチャンバー内の生活と死細胞を数えます。以下の式を用いて細胞数、生存率およびPHHの収量を計算します。

    収量（計数した細胞）を細胞懸濁液（ml）を計数した細胞のX希釈因子X量が10,000 X =

    収量（肝細胞/（g肝臓組織試料））=（細胞懸濁液（ミリリットル）の収率（肝細胞/（mlの培地））×体積）/（肝臓組織試料の重量（g））

    生存率（％）= 100％X（生細胞数）/（総細胞数）

肝細胞の5精製（1時間）

注：この精製工程が推奨され、生存能力場合70％未満です。

  1. 氷の上のすべての手順を実行します。密度勾配遠心5mlの密度勾配溶液を、15 mlのPBSを混合することにより25％の密度勾配を準備します。
  2. 両層の明確な分離が（ 図2C）が達成されることを保証するために、25％の密度勾配層の上に慎重にゆっくりと肝細胞が豊富な細胞懸濁液のうち、合計で50澪セルの最大を入れてください。 1,250×gで、20分間、ブレーキなしで4°C（ 図2D）で遠心分離し、遠心分離に慎重にチューブを入れてください。
  3. 残りの細胞懸濁液と間期における死細胞を吸引します。脂肪含有量に応じて、1つはまた、密度勾配液を吸引する可能性があります。
    注：PHH低脂質含量を持つが密集し、ペレットと密度勾配を完全に吸引することができますを形成します。高脂質含量のPHHはより拡散してペレットを形成し、生存細胞の多くは、ペレット、上記密度勾配溶液中に残ることがあります。
  4. 50 XG、5分、4℃で再びPBSと遠心分離と肝細胞ペレットを再懸濁します。ペレットをプール、再びPBSで洗浄し、肝細胞インキュベーション培地中に精製されたPHH再懸濁します。ステップ4.6で説明したように細胞計数を行います。

肝細胞の6.栽培

  1. 例えば、ラット尾コラーゲン（コラーゲンタイプI）は、細胞外マトリックスでそれらをコーティングすることによってPHHの播種のための細胞培養皿を準備します。ラジャンらによって確立されたプロトコルに従って、ラット尾コラーゲンを準備します。17
  2. PBSで200：ラット尾コラーゲン原液1を希釈します。表面全体が覆われている培養皿への転送を100μl/ cm 2のラット尾コラーゲン溶液、世話。室温で20分間、細胞培養プラスチックをインキュベートします。残りのラット尾部コラーゲン溶液を吸引します。
  3. 培養dishe上の肝細胞インキュベーション培地中の種子15×10 4肝細胞/ cm 2のラット尾コラーゲンでコーティングされたのです。少なくとも4時間、37℃、5％CO 2の加湿インキュベーター中で細胞を培養。 4時間後、肝細胞は、付着した培地を変更することができます。
  4. 実験に応じて調査を行います。 48時間の培養時間は、細胞が単離プロセスから回復することを可能にすることをお勧めします。

非実質肝細胞の7単離（1.5〜2時間）

  1. 遠心分離機残りの赤血球および肝細胞を排除するために72×gで、5分間、4℃で回収した上清（ステップ4.5および4.6）。プール上清および回2細胞ペレット得るためにそれらを遠心：残りKCの沈降のためにHSC、LEC、一部はKCと650×gでの沈降のための300×gで、5分、4°C、7分、4°Cを。
  2. プールペレットおよびHBSS中で再懸濁それらの両方。密度勾配centrifための密度勾配溶液とPBSを混合することにより25％と50％の濃度勾配を作製ugation（25％の密度勾配溶液5 mlの密度勾配溶液を、15 mlのPBS、50％の密度勾配溶液の調製：10mL密度勾配溶液と10mlのPBS、 図2を参照）。 50％の密度勾配溶液層の上に慎重に25％の密度勾配溶液を置き。
  3. 両層の明確な分離が達成されるようにして25％の密度勾配溶液層の上に慎重にゆっくりとNPCのサスペンションを置きます。
  4. 遠心ブレーキなしで1,800×gで、20分間、4℃での密度勾配上での細胞懸濁液（ 図2.2）。
  5. 最上層から吸引し、死細胞と細胞の破片。 NPCは、25％と50％の密度勾配層（ 図2）との間の相間に配置されています。 NPCを収集し、HBSSと遠心機で上記の二重遠心分離工程（ステップ7.2。）を適用し、細胞懸濁液を、それらを洗ってください。

クッパー細胞の8分離（アドヒアランス分離工程）（1時間）

  1. ステップ4.6で説明したようにNPC画分中のKCのための細胞数を実行します。 （懸濁液中のKCの外観について図3Bを参照してください）。遠心分離培地（ 表2）を播種クッパー細胞における上記の二重遠心分離工程（ステップ7.2）と再懸濁NPCとNPC画分。
  2. 5×10 5 KC / cm 2の密度で、プラスチック製細胞培養容器のKCを含有する画分をシードします。 37℃、5％CO 2の加湿インキュベーター中で20分間KC培養物をインキュベートします。プライマリKCは時間の短い期間（ 図2.3）内の細胞培養プラスチックに付着します。
  3. 主にLECとHSCからなる、ない付着NPCを含む上清を収集します。プールLEC（セクション9を参照）、HSCの後の分離のための上清（セクション10を参照）。 HBSSで接着KCを洗浄し、37℃、5％CO 2でクッパー細胞培養培地（ 表2）でそれらを養います加湿インキュベーターで2。

内皮細胞の9分離（1.5時間）

  1. 遠心分離機300×gで、5分間、4℃で回収した上清（ステップ8.5）。 PBSでペレットを洗浄。 300×gで、5分で遠心分離した後、4℃の星細胞/内皮細胞の分離媒体中で細胞を再懸濁し、ステップ4.6で説明したように、残りのすべてのセルに対して細胞計数を行います。
  2. 免疫標識のためのMACS-KITからブロッキング溶液を20μlおよびCD31マイクロビーズの20μlを添加、1ミリリットル星状細胞/内皮細胞の分離媒体中1×10 7澪細胞を再懸濁し、4℃で15分間、得られた懸濁液をインキュベート℃の温度（ 図2.4）。
  3. 磁気活性化細胞選別システムMACS（ 図2.5）のためmanufacturer'sプロトコルに記載されているように、HSCは別にLEC。磁気保持CD31陽性LECを溶出し、星状Cでそれらを一時停止エル/内皮細胞培養培地（ 表2）。
  4. ステップ4.6で説明したようにLECのための細胞計数を行います。ラット尾コラーゲンでコーティングした細胞培養容器で1.25×10 5細胞/ cm 2の密度でシードLEC（ステップ6.1参照）。加湿インキュベーター中、37℃で、5％CO 2で細胞を養います。

星細胞の10分離（0.5時間）

  1. 非標識のHSCは、MACS手順の間に分離カラムを通過します。 （ステップ9.5、 図2.5を参照）HSC画分を収集します。ステップ4.6で説明したように細胞計数を行います。
  2. 星細胞/内皮細胞培地（ 表2）（ステップ6.1参照）ラット尾コラーゲンでコーティングした細胞培養容器中で5×10 4細胞/ cm 2の密度でHSCを播種し、37℃、5％でそれらを養います加湿インキュベーター中のCO 2。

"表1" 表1： 灌流および分離ソリューション。

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表2： 文化との分離媒体。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

接着特性およびMACSの使用と組み合わせクリーンアップ手順として密度勾配遠心分離を用いて実質および非実質画分への分離は、成功したPHHとNPCの分離につながります。 PHHとNPCは、高品質と量で単離することができる。 図1は、肝灌流および消化のための機器の代表的なセットアップを示しています。プロテアーゼのタンパク質分解活性を減少させるために、リターンにコラゲナーゼP活性を安定化させるために溶液II - 10％FCSを灌流を含むコラゲナーゼPを添加しました。結果としてNPCの分離のために必要なより長い消化時間がPHHの生存率に負の影響なしに適用することができます。

figure-results-1
図1： 灌流消化セットアップ

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

公開されたプロトコルは、同時にヒト肝組織の同じサンプルから高品質と純度で、純粋なPHHやNPC、すなわちKC、HSCおよびLECを分離する技術が記載されています。 （ダムらによってレビュー。）ヒト組織を用いて行ったものの細胞集団18-20と単離手順のいずれか一方のみをカバーする肝細胞の単離を扱う出版物の大半はまれである21。ヒトの肝臓への動物組織（ 例えば、ラット肝臓）で確立された方法の適応は、動物およびヒトの細胞集団との間のセル特性のいくつかの違いが明らかになりました。別の肝細胞集団を覆う肝細胞単離法の確立が実質および非実質細胞の分離を組み合わせることにより最適化された結果を得るために必要な消化時間の差に重要なステップであることを明らかにしました。この課題に直面して、我々は異なる技術を組み合わせた肝細胞単離プロトコルを開発し、適応しました私たちのPHH単離プロトコール10 SE。

溶液IIを含むコラゲナーゼPの10％FCSを添加することによって、我々は、プロテア...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、競合する利益はないと宣言する。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

0315741：私たちは、この研究は、教育研究のドイツ連邦省（BMBF）プロジェクト仮想肝臓でサポートされていた、図1の作成を支援するための嘉李劉に感謝したいと思います。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
General Equipment
PIPETBOYエッペンドルフ
ピペットッペンドルフ
顕微鏡カールツァイ
顕微鏡オリンパス
CO2インキュベーターバインダー
ラミンエアヘレウス
遠心分離機 バリフュージ 3.0Rヘレウス
尿ビーカーサルスタット2041101
パフューザー シリンジ 50 mlB.Braun12F0482022
ボトル トップ フィルターナルゲン1058787
ファルコン 50 ml ポリプロピレン コニカル チューブBD バイオサイエンス352070
ファルコン 15 ml ポリプロピレン コニカル チューブBD Biosciences352096
組織培養プレートBD Biosciences 53304724 ウェル
血清学的ピペットBD Biosciences357525, 357551, 35754325 ml, 10 ml, 5 ml
ピペットチップSARSTEDT0220/2278014, 0005/2242011, 0817/2222011100 & マイクロ;L、200 µl、1,000 µl
名前会社カタログ番号コメント
Isolation Equipment
water bathLauda
蠕動ポンプロス
循環サーモスタットラウダ
pHメーターショット
細かいスケールザルトリウス
スタンド
Büchner漏斗Haldenwanger
プラスチック漏斗
付き
シリコーンチューブ
皿
鉗子
ザー 12068760
ノイバウアー計数チャンバーOptic Labor Cell Lifter
Costar
Surgical DrapeCharitéUniversitätsmedizin ベルリンA2013027
Fuhrmann40013331
滅菌手術用手袋Gammex PF1203441104
組織接着剤B. Braun1050052
ガラス瓶VWR
コラゲナーゼ Pロシュ13349524
Percoll 分離溶液バイオクロムL6145密度1.124 g / ml
ハンク'BSSPAAH00911-3938
ダルベッコ 's PBSPAAH15 - 002Mg/Ca
アンプワプラスティプールなし 13CKP151 
アルブミンSigma-AldrichA7906
NaClメルク1,064,041,000
KClメルク49,361,000
ヘペス・パフラン Roth133196836
EDTASigmaE-5134
名前企業カタログ番号コメント
>メディア機器 
DMEMPAAE15-005低グルコース (1 g/L) (L-グルタミン不使用)
HEPES 緩衝液 1 MGIBCO1135546
L-グルタミンGIBCO25030-024200 mM
MEM NEAAGIBCO11140-035
ペニシリン/ストレプトマイシンGIBCO15140-122
RPMI 1640PAAE15 - 039L-グルタミンなし
ピルビン酸ナトリウムGIBCO1137663100 mM
トリパンブルーソリューションSigma-AldrichT81540.4%
William's E  GIBCO32551-020
と GlutaMAX™
EGTASigma-Aldrich03780-50G
FortecortinMerck493678 mg/2 ml
ヒト-インスリンLillyHI0210100 I.E./ml
N-アセチル システインSigma-AldrichA9165-5G
子牛胎児血清 (FCS)PAAA15-101
Name企業名カタログ番号コメント
免疫染色用機器
CD 68R&D Systems, USAモノクローナル
CK 19Santa CruzD2309polyclonal
CK18Santa CruzK2105モノクローナル
VimentinSanta Cruzモノクローナル
GFAPSigma Aldrichモノクローナル
Triton X-100Sigma Aldrich23.472-9
ヤギ アンチマウス IgG1-PESanta CruzC0712
ヤギ抗ウサギ IgG-FITCSanta CruzL0412
メタノールJ.T.Baker1104509006
ホルムアルデヒド 4%Herbeta Arzneimittel200-001-8
ウシ血清アルブミン (BSA)Sigma AldrichA7906-100G
エスカールオリーブチップカニューレガラスメスフェ

参考文献

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