マウスの心臓変力作用の調​​査のために分離された乳頭筋の収縮の測定

サマリー

マウスの左心室の乳頭筋は 、インビトロで心筋収縮性を調べるために使用することができます。この記事では詳細に心臓収縮特性を研究するためのアイソレーションと実験プロトコルを説明しています。

要約

成体マウスの心臓から単離された乳頭筋は異なる生理学的/病理学的状態の間の心収縮性を研究するために使用することができます。収縮特性は、独立して、血管の緊張または神経液性状態などの外部の影響を評価することができます。これは、単離された心筋細胞を持つ単一セル測定の間及び心エコー検査などのインビボ研究で科学的なアプローチを示しています。従って、乳頭筋調製物は、心臓の生理機能/病態生理学を研究するための優れたモデルとして機能し、薬剤による調節またはトランスジェニック動物モデルの探査などの調査のために使用することができます。ここでは、器官槽の設定における心収縮性を調査するために、マウスの左前方の乳頭筋を単離する方法について説明します。心室壁から単離された筋肉片の調製とは対照的に、乳頭筋は、筋TISSUに損傷を与えることなく、 全体として調製することができます。E深刻。器官槽の設定は、複数の温度制御され、毒ガスと電極を装備した器官槽室で構成されています。孤立した乳頭筋は、器官槽室に固定され、電気的に刺激されます。誘発単収縮力は、圧力変換器と、このような力の大きさをけいれんおよび動態を分析する単収縮のようなパラメータを使用して記録されています。異なる実験プロトコルは、カルシウムおよび周波数依存収縮ならびにカテコールアミンや他の医薬品などの収縮剤の用量反応曲線を調査するために行うことができます。さらに、急性虚血のような病理学的状態をシミュレートすることができます。

概要

心臓の収縮のために自分の役割を参照するイオンチャネルのようなタンパク質の調査は異なる発症機序を発見し、そのような虚血および心不全などの心臓疾患のための新しい治療戦略を確立することが不可欠です。

哺乳動物の心筋細胞の収縮機能は、種々のイオンチャネル、輸送体および他のタンパク質によって調節することが知られています。活動電位は、Ca ²⁺チャネルは、細胞外空間からのCa ^2+流入につながる電圧依存筋細胞膜のL型の活性化を誘発し、その後のCa ²⁺の細胞収縮^{2をトリガ}のCa ^{2+放出（CICR）1を} 、誘発しました。生理学的または病理学的ストレスに対する心臓の収縮と適応に中心的な役割を果たしている-signaling ^の Ca 2+。カテコールアミンは、このようにキャンプを合成するアデニル酸シクラーゼ（AC）を刺激する、心臓βアドレナリン受容体を活性化します。活性化され、protein個のCa ²⁺トランジェントと心収縮の^1,3,4の変更の結果、L型Ca ^{2+チャネル} 、ホスホランバンとリアノジン受容体のような異なる細胞内および細胞膜結合タンパク質をリン酸化する（PKA）のキナーゼ。 cAMPはホスホジエステラーゼ（PDE）によって分解されます。 βアドレナリン受容体以外のGs共役受容体の活性化はまた、cAMPの蓄積をもたらします。

孤立した心室筋ストリップで収縮測定の技術が十分に大きい哺乳動物種^5-8のために確立されています。マウスにおいて、遺伝子ターゲティングの可能性に基づいて、マウス心臓の生理機能を分析するための方法を確立することが重要です。しかし、マウスでは孤立した筋肉製剤の生理学的特性に関する既存のデータは、実験条件^9-12によって異なります。

記載された方法は、左心室の乳頭筋の事前の心収縮性を分析するために使用されin vitroで parations。心収縮の調査は、血圧、神経液刺激および物理的または代謝的ストレスのようなin vivoでの心臓収縮を、修正の影響の非存在下で行われます。収縮筋調製物の叩解速度が厳密に定義され、任意に変更することができます。単収縮力は周波数または温度を破って、そのようなカルシウム濃度のような特定の刺激との関連で分析することができます。また、この方法は、異なるシグナル伝達経路の成分を調査すると、上記の実験条件を制御することにより、遺伝的に改変されたマウスモデルの心臓の性能を比較するために使用することができます。

プロトコル

注：単離手順の基本的なステップは、図1に示されているすべてのステップは、以下のプロトコルに詳細に記載されています。乳頭筋の分離、器官槽チャンバ内に取り付け、取得および分析は、連続し、強制タイムスケールで行われます。

全ての動物実験は、動物の保護に関するドイツの法律に従って行われ、ハイデルベルク大学の倫理審査委員会によって承認されました。

計装の調製

1. 収縮の測定ではmultichambered器官槽の設定を使用します。 エキソビボ収縮器官浴のセットアップの構成要素は、 図2に示されています。
   注：乳頭筋の準備と実験プロトコルの開始との間の時間、セットアップ機器を最小限に抑え、実験tissue.Thisを集めるの提供しにバッファを前に準備するために組織は、実験を行うために生存し続ける時間の最大量をエス。
2. コンピュータとデータ収集機器を起動します。臓器風呂熱（32°Cまでのプリセット）をオンにし、設定温度にユニットを可能にします。
3. 収集装置を準備します。ソフトウェアのマニュアルに記載されたように、データの記録を開始。
4. チェックして、各チャンネルに（必要な場合）、キャリブレーションを実施し、認定重量により供給された2-Gの力に（そのチャネルに関連付けられている）は、それぞれの力変換器から供給される電気信号を標準化するために、すべてのチャネルをゼロに。
5. 器官槽室へのガス供給（95％O _{2/5％CO 2）}をオンにします。連続プロトコル全体の測定中に全てのチャンバをガス。

緩衝液および生理的溶液の調製

1. 119 mMの塩化ナトリウムの最終濃度を達成するクレブス - ヘンゼライト緩衝液を調製します。 25mMの_炭酸水素ナトリウム; 4.6のKCl; 11mmのグルコース; 1 mMののNa-Pyruvate; 1.5 mMの_CaCl 2を、 1.64 mMのは_、4硫酸マグネシウム; 1.18 mMのKH ₂ PO _4、（ 表1生理溶液を参照）pHを7.4に調整します。
2. 追加の30mMの2,3-ブタンジオンモノオキシム（BDM）と50 IEヘパリン/ mlのステップ2.1で説明したように、分離中に使用する独立したクレブス - ヘンゼライト緩衝液を準備します。 4℃（表1調製液を参照）クールソリューション。表1に記載したように、虚血のシミュレーションでは、虚血溶液を調製。
3. Ca 2+のプロトコルの場合^-依存収縮、要求された最終濃度にクレブス-ヘンゼライト緩衝液に^の Ca 2+ ^{を追加します。}
   注：直接、その使用前に、これらの溶液を調製し、炭酸カルシウムの沈殿を避けるために、カルボゲンでGASS。使用する前に、32℃に予熱するソリューションを提供します。

乳頭切除手順の間に使用されるガス発生チューブと解剖皿の調製

1. ソフトガスを接続します専門家の作業とガス接続（あるいは100％の酸素、カルボゲン）にチューブ（外径2〜4ミリメートル）を歌います。
2. 解剖皿の内側継手ガス発生管の閉じたリングを作成します。ガス発生管に連続発泡が保証されている数回穿刺。このガス放出管は、複数回使用することができます。
3. ピンがそれに貼り付けることができるように、底部（0.5センチメートル厚）のシリコンエラストマーと解剖皿を準備します。この皿を数回使用することができます。

マウスの左前方乳頭筋の4.絶縁

注：乳頭筋の分離を開始する前に、ガスラインが閉塞の明確であることを確認してください。

1. 乳頭筋の準備を開始する前に、プロトコルセクション1-3で述べたように、臓器浴の設定を準備します。実験の日にすべてのソリューションを準備します。
2. 頸椎脱臼のaccordiによって（約8〜12週齢）のマウスを生け贄に捧げます専門家の作業と施設のガイドラインにNG。
3. 前足を固定して仰臥位で動物を修正し、解剖ボードに足を後肢、鋭い骨はさみで肋骨を切断することにより、両側の胸部の横を開いて、横方向のカットとダイアフラムを切りました。心膜を削除します。今心臓と大動脈をアクセス可能です。
4. 心臓に近い血管体幹の鈍ピンセットで心臓を修正して、肺と周囲の組織からハサミですぐに心を分離。
5. 酸素（ステップ2.2）にガスを供給した冷却調製液で満たされたペトリ皿に拍動している心臓を転送します。ハートビートとピンセットで心臓頂点に触れる介して、そっと心の収縮を刺激することを許可します。
6. すぐに心臓が完全にexsanguinousで、冷却された調製液（ステップ2.2）を充填し、O ₂ガスを供給解剖皿に移します。使用上のこのステップ実体顕微鏡から。
7. ょんを修正心が背側から見られるように右心室を通って小さなピンとRT（右心室は、オペレータのビューから右側に位置しています）。
8. 顕微はさみを使用すると、房室レベルで両方の心房を分離心室から組織を接続切断して捨てます。任意の機械的な圧力を避ける心尖にAV-バルブレベルから心室壁を通してカットを実行します。
9. 心室を開き、鉗子で左側の自由壁を固定し、このように両方の左心室乳頭筋を見てみました。
10. 少し乳頭筋の準備の弁膜帆の一部を保存左前乳頭筋の両側の心室組織の横を離れてカットし、触れないように注意してくださいまたは、できるだけ多くの乳頭筋をストレッチ。乳頭筋からの残りの心室壁組織を解剖。
11. 乳頭筋の準備の両側に取り付け絹糸（7/0、メートル法0.5）aration、弁膜帆上の1つの筋肉の部分に1つ。温度32°Cが提案されているように、臓器浴溶液を充填し、カルボゲンでガスを供給した器官槽室で準備を修正。

乳頭筋の5平衡と刺激

1. 直ちに臓器浴中で固定した後、1ヘルツの刺激周波数の矩形パルス（2ミリ秒の持続時間および100 mAの電流）と乳頭筋調製物を刺激します。
2. 使用オーガンバスタイプの設定に応じて連続的に変化したり、頻繁に手動で変更（5分ごと）のいずれかによって、臓器浴溶液の頻繁な変更を確認してください。
3. 徐々に達しにおける最大単収縮力まで、プレテンションを上げます。プリテンションの増加は単収縮力のさらなる増強が続いていないときに最大単収縮力に達します。
4. 平衡の45〜60分後、実験プロトコルを開始します。

6。収縮の測定のための実験プロトコールを推奨

注：以下のとおり実験プロトコルは、生理学的および病態生理学的条件の下で心臓の収縮を特徴づけるために、標準的な操縦を含みます。代表的なセクションでは、詳細には、これらのプロトコルを記述し、また（表2参照）代表的な結果を示します。

1. 実験プロトコルの記録と分析
   1. 記録のために、十分な時間分解能（取得率≥1kHzの）で、適切なソフトウェアを使用しています。
   2. 単収縮力の大きさ（高さ）、ソフトウェアプログラムで述べたようにテンション（TTP）と最大値の半分緩和時間（それぞれ、R ₅₀ / TFallを）ピークまでの時間（ 例として図4を参照してください 、ADInstrumentsの5.5チャート）などのパラメータを分析します。

結果

単離されたマウス乳頭筋調製物の収縮の測定のために、この原稿のプロトコルは、生理学的条件下で再現性のある実験の結果を達成するために最適な条件に調整されます。最適な実験条件を定義するために、我々は、器官浴温度および細胞外カルシウム濃度^（12も^参照）に変化するパイロット実験を行いました。ここで説明するプロトコルは、1.5mMの細胞外カルシウム濃度及び32℃の温度で行いました。

基礎収縮特性

時間をピークに、速度をけいれん、筋力振幅のための基礎収縮特性、パラメータを特徴付けるために、リラクゼーション50時間（半最大緩和時間（5％の基底から始まる最大収縮力に達するのに必要な時間として定義される）に必要な時間として定義されます）緩和力の半分に達し、このプロトコルで使用されています。 TWの代表的なトレース痒いこれらのパラメータの分析は、 図3A-Bに示されています。

カルシウム依存性収縮

ディスカッション

本稿では、我々は、マウスの心臓生理学と病理学に関連するいくつかの科学的な質問に答えるだけでなく、トランスジェニック系統の分析と新たな医薬品のアプローチの発見をサポートするために使用することができ、in vitroでマウス乳頭筋の収縮性を調査する方法を説明心臓の機能不全を治療することができます。我々は、心臓の筋肉の収縮の、生理的な病理学的および薬理学的特性を評価するためのこの方法の使用を説明する（ 図3参照）。ここでは図示していない追加のアプリケーションは、別の薬剤を使用して、細胞内経路の評価を（も¹²参照）が挙げられます。

そのような虚血性心疾患や心不全などの心臓疾患が著名な臨床上の問題が表示され、世界中の²²死亡率および罹患率のための主要な原因です。心臓で発現する多くのタンパク質は、心臓の収縮のための彼らの役割は、STILですlはよくわかっていないか、今まで勉強していません。孤立した乳頭筋の収縮の測定は、マウスモデルにおいてin vitroでの心臓収縮を研究する有意義...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
塩化ナトリウム	Sigma-Aldrich	S7653
重炭酸ナトリウム	Sigma-Aldrich	S5761
塩化カリウム	Sigma-Aldrich	P9333
コース	Sigma-Aldrich	D9434
ピルビン酸ナトリウム	Sigma-Aldrich	P5280
塩化カルシウム二水和物	Sigma-Aldrich	223506
硫酸マグネシウム七水和物	Sigma-Aldrich	230391
リン酸カリウム一塩基性	Sigma-Aldrich	P 5655
2,3-ブタンジオン一酸素	Sigma-Aldrich	B0753
3-イソブチル-1-メチルキサンチン	Sigma-Aldrich	I5879	危険有害性情報 H 302、DMSO
ジメチルスルホキシド (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
塩酸イソプレナリン	Sigma-Aldrich	I5627	危険有害性表現 H 315-H319-H335
ヘパリンナトリウム 250.000 IE/10 ml	ratiopharm	PZN 3874685
ヒスタミン二塩酸塩	Sigma-Aldrich	H7250	危険有害性情報 H 315-H 317-H319-H334-H335-H335

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