方法論記事

スクリーニング可能インビボトランスジェニック生物発光を使用したミトコンドリアモジュレーターについてのアッセイ線虫（Caenorhabditis elegans）

DOI：

10.3791/53083

⸱

2015年10月16日

 ,  , 
1Institute of Medical Sciences, University of Aberdeen

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

モデル生物Caenorhabditis elegansにおけるミトコンドリア阻害剤の影響のin vivo検出と、潜在的な増強化合物の同定のためのプロトコルが説明されています。このプロトコールは、ミトコンドリア機能を調節する化合物の薬物ライブラリーのスクリーニングに使用できます。

要約

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多細胞モデル生物Caenorhabditis elegansは、成人期に約1mmの大きさの小さな線虫で、遺伝的にも実験的にも扱いやすいものです。経済的で、液体培地での培養や分注が容易であるため、ミディアムスループットのスクリーニングに適しています。私たちは以前に、線虫のATPレベルの迅速なin vivo評価を提供するために、C.エレガンス株を発現するトランスジェニックルシフェラーゼの使用を検証しました。1-3 ここでは、生物発光性C.エレガンス株PE254またはPE255(またはそれらの派生株)を用いてバイオアッセイを実施するために必要な材料と手順を提示する。このプロトコルは、ミトコンドリア毒性を特定する可能性のある薬物の亜致死的影響のin vivo検出、および潜在的な有益な薬物効果のin vivo検出を可能にします。代表的な結果は、化学物質パラコート、ロテノン、オキサロ酢酸、および4つのホタルルシフェラーゼ阻害化合物について提供されています。この方法論は、ミトコンドリア機能を調節できる化合物の薬物ライブラリーをスクリーニングするためのプラットフォームを提供するためにスケールアップすることができます。薬物毒性の前臨床評価は、主に解糖系からATPを誘導し、ミトコンドリア毒物に耐性があることが多い不死化がん性ヒト細胞株で実施されることがよくあります。4,5 対照的に、C.エレガンスは、成体期までの発達を維持するために酸化的リン酸化に依存しており、ヒトとの類似性を引き出し、生きた多細胞生物全体の生理学的状況における化合物評価のユニークな機会を提供します。

概要

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この手順の全体的な目的は、Cのエネルギー状態の迅速な定量化です化合物スクリーニングにおけるエンドポイントとしてこれを使用するビューとin vivoでのエレガンス 。 根拠は、線虫C.におけるホタルルシフェラーゼのトランスジェニック発現に基づいていますプラスミドpSLGCV（1経由エレガンス 1-3 https://www.addgene.org/49862）。ルシフェラーゼ酵素は、緑色蛍光タンパク質GFPと融合させて、（信号を標的ルシフェラーゼペルオキシソームを除去した）、細胞質中で構成し、遍在的に発現されます。基質ルシフェリンを外因的に設けられているときに発光をもたらします。ワームは透明であり、光は相対光単位（RLU）としてルミノメーターで測定することができます。生物発光反応とその可用性細胞ATP燃料が生成された光のレベルを決定します。その結果、発光法はconvenienを提供していますATP産生がミトコンドリア内で主に発生するのでtは、相対的なATPレベルを評価し、拡張ミトコンドリア機能によって意味します。ミトコンドリア機能と生物発光のレベルとの間のリンクは、ミトコンドリアの電子伝達鎖遺伝子およびそれに伴う減少し、光出力を黙らせる以前に実証されている。1

生成された生物発光株はPE254（feIs4）に指定し、 PE255（feIs5）1（材料のリストを参照）と交換可能に使用することができる。研究の3数は、アジ化ナトリウム1、カドミウム2、下水などの様々な生体異物化学物質への曝露後にインビボで細胞ATPレベルをレポートするには、これらのセンサー株を利用してきました汚泥エキス3、5'-フルオロ-2-デオキシウリジン6、およびタバコ-特異的ニトロソアミン7。株はまた、紫外線C放射線への暴露の影響をモニターするために有用でした 8までとミトコンドリア呼吸鎖の機能を破壊する効果。1,9 GFP融合（PE39）なしでルシフェラーゼ遺伝子を発現する発光センサの初期のバージョンはまた、重金属の影響の調査におよび呼吸器の使用されています。脱共役10株PE254とPE255は、ルシフェラーゼを運ぶ：GFP融合およびGFP蛍光を発光値の正常化のための便利な手段を提供し、線虫の質量に比例して増加することが示されたウェルあたりのワームの微分量の6,9の効果にもすることができます。アッセイ（条件当たり5ウエル以上）で複数の技術的反復を含むによって考慮。3

プロトコルは、エネルギーレベルの in vivoモニタリングの可能性を提供しています（とは対照的に、技術的に、より面倒なインビトロのATPの測定）化合物のスクリーニングを可能にし、全体ムーの生理的な文脈で再配置しますlticellular生物。手順および/またはRNA干渉により遺伝子をサイレンシングすることにより、利用可能な変異株に染色体に組み込まれた導入遺伝子を交配することによって、遺伝的背景の多様に拡張することができます。したがって、Cの最大限に活用することモデル生物としてのエレガンス 。この方法は、ミトコンドリア毒性による薬剤候補の後期不良を低減し、高い動物実験の削減に向けた貢献をすることに役立ちます。

プロトコル

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注：（126°C、11分間オートクレーブ処理することによって）滅菌条件（クリーンベンチ）の下と予め滅菌材料とのすべてのステップを実行します。画線大腸菌を含むLBプレート大腸菌 OP50は4℃に維持し、必要な新鮮なLBプレート上にストリークアウト毎月restreakされます。

1.細菌性食品（ 大腸菌 OP50）準備

  1. 1日目接種大腸菌の単一コロニーを持つ2つのユニバーサルボトルで2×5ミリリットルのLB 8時間、37°C（220 rpm）で振盪インキュベーターで大腸菌 OP50と場所。
  2. 8時間のインキュベーション後、 大腸菌を2mlを使用3×200ミリリットルLBのそれぞれに接種するために大腸菌 OP50 LB培地37℃のインキュベーター（220 rpm）でO / N（17時間）を振っに入れフラスコ。
  3. 20×50 ml遠心管を秤量し、チューブ上に重量を書きます。
  4. O / N Eの血清学的ピペット、アリコート30ミリリットルを使用して2日目。事前に大腸菌 OP50文化が遠心管の重量を量りました。 7741 xでの遠心分離G、10℃、8分
  5. 慎重に、上清をデカントで蓋を反転チューブを維持し、数分間放置します。ピペットを使用して、蓋に収集している可能性のある余分な上清を除去します。チューブを秤量し、ペレットの重量を計算します。
  6. 30グラム/ Lのサスペンションを提供し、チューブにこのボリュームをマークするために必要な量を計算します。 1-3カ月以内にまたはで使用するために-20℃で日付、ラベルと場所チューブ - 80℃で3ヶ月以上のために保存する場合。
  7. 線虫を成長させるための細菌懸濁液を準備します。細菌ペレットを静かに必要な体積を得るために、ペレット、異なるチューブのプールの内容を再懸濁するために出て解凍し、各チューブに11,12完全培地Sの必要なボリュームを追加、ボルテックスすることができます。無菌状態の下で働きます。

96ウェルプレートフォーマットで薬物標準の調製

注：薬剤ライブラリを使用する場合、薬剤プレートは単一に設けられています。DMSO中の化合物の濃度。一次スクリーニングは、単一の濃度で化合物を試験します。手順については、10μMで統計的有意後に選択し、0〜160μMの濃度の範囲で確認化合物試験のための薬剤プレートの調製のために従ってください。以下の手順は、他の濃度をテストするために適合させることができます。

注意！薬を扱うために必要な注意事項を守ってください（一般的に手袋が必要とされる、マスク、安全ゴーグルに直面しています）。

  1. 確認スクリーニングのための作業標準に薬物プレートを準備します（ つまり、100倍を露光のために必要な最大濃度に比べて集中）滅菌1.7ミリリットルマイクロ遠心チューブに化合物の必要量を計量し、DMSOに16mMの化合物を製造。
  2. 8、4、2、1、0.5、および0.25 mMの標準（無菌状態）を取得するためにDMSOに2：シリアル16mMのストック1を希釈。これらは、100倍に濃縮され、0（車両のみ）の最終濃度まで希釈され、薬物曝露の間に（1％DMSO中）2.5、5、10、20、40、80および160μM。
  3. クリーンベンチでは、例えばプレートの位置A1のために、96ウェルプレートの列内の化合物基準のウェル当たり20〜50μLを置く：16 mMの、B1：8 mMの、C1：4 mMの、D1：2 mMの、 E1：1 mMの、F1：0.5 mMの、G1：0.25 mMの薬とH1：DMSO。異なる薬剤の希釈系列の異なるカラムを使用してください。
  4. 薬剤プレートの列12のウェルに分注し車。
    注：これは、車両全体のプレートの位置の代表でテストされて確実に、車両制御下に行Hに沿って検査に加えて、列のテストを容易にします。
    注：確認のスクリーニングのための各薬剤プレートは、試験される11種類の薬剤の最大プラス車両制御のための希釈系列を保持しています。
  5. 必要になるまでラベルとシールプレートは、-20℃で箔と場所でカバーしています。

3.線虫の実験

注：すべてのステップを実行し、Uファインダー無菌状態、無菌的かつ事前に滅菌材料および試薬で。 C.を維持エレガンスは、EとNGMプレート上で日常株異なるプロトコルステップの大腸菌 OP50 12示唆タイミングは、表1に提供されています。

  1. 1日目の作業は：その後の同期のためのバイオセンサー株の液体培養を設定します。
    1. S完全2mlに（食品がちょうどなくなった若い幼虫をたっぷり使って）1 6センチメートルNGMプレートから線虫を取り、30グラム/ L Eでフラスコへの転送S完全な（250ミリリットル容量の円錐形のガラスフラスコ中の総容量30ミリリットル）中の大腸菌 OP50。 20℃、160rpmで3日間インキュベートします。
  2. 4日目の作業（約30〜35分を許可）：漂白文化卵を収穫し、ワームの人口を同期します。 1分間のすべての遠心操作を実行し、600×gで。
    1. 使用直前に漂白剤溶液を調製：0.156 M KOH / NaOHを各16ミリリットルに4ミリリットル漂白剤を追加します。
    2. 2×14ミリリットルを注ぎます15ミリリットルの円錐遠心チューブにワーム文化。ワームは、重力（3分）によって解決することができます。取り外し、液体上の落ち着いた線虫を捨てます。各チューブに漂白剤溶液5mlを加え、タイマーを開始します。 1チューブにボリュームを兼ね備​​えています。
    3. ワームの破壊と懸濁液に卵を放出するステレオスコープの下で確認し、2分間穏やかにチューブを反転。ときほとんどの卵が解放されるか、漂白溶液中で2分間、遠心機の最大時。
    4. 注意深く上清を取り除きます。 14ミリリットルのS完了し、遠心分離してペレット1×を洗ってください。
    5. （この第二の漂白工程は、ワームの死体のほとんどが崩壊し、もはやステレオスコープの下に見ていることを保証します）上清を捨て、10ミリリットル漂白剤溶液を添加し、タイマーを開始します。 2分の漂白液の最大時間後、遠心分離。
    6. 完全なS内の洗浄ペレット3倍、静かに各遠心後のS完全な14ミリリットルで上清と再懸濁したペレットをデカント。最終洗浄後、14ミリリットルのS cで卵のペレットを再懸濁omplete。
    7. 円錐形のガラスフラスコにボリュームを転送します。 20℃、160 rpmで18〜24時間インキュベートします。
      注：収穫卵は、したがって、彼らはすべての成長の同じステージになります、O / Nを孵化し、原因食品の不足のために最初の幼虫齢（L1）で開発を逮捕します。
  3. 5日目の作業：薬物アッセイのための同期ワームの文化を設定します。
    注：飢餓培地に懸濁ワームは、ピペットチップおよびチューブのような疎水性プラスチック表面に付着する傾向があります。 0.01％のTween-20がプラスチック表面をより親水性とカウントでより高い精度（0.01％のTriton-X100を使用することもできる）を可能にするためにここで使用される界面活性剤です。線虫、細菌添加培地である場合、それらは、プラスチックに固執する傾向がありません。
    1. プラットフォーム（160 rpm）を振っにフラスコを維持し、フラスコ中の斜線のL1の数を決定します。
      1. 900μlの液体mの独立した1.7ミリリットルのマイクロチューブに（きれいな先端を毎回使用）フラスコから3倍の100μlのサンプルを取りますedium 0.01％のTween-20。
        注：一度だけきれいな先端への熱望100μlのサンプル。そして、ときに先端に付着した虫を解放するためにトゥイーン添加した培地に、ピペットアップし、数回上下分配します。
      2. 各三連の希釈チューブから4倍の10μlの液滴中の線虫をカウントします。平均値を計算し、円錐形のガラスフラスコ内に存在するワームの数を推定します。
    2. 10μLあたり10線虫で2×20ミリリットル文化をセットアップするために必要な斜線の線虫懸濁液の体積を計算します。遠心分離工程の間に、いくつかの後続の線虫の損失を考慮して10％、算出容量を増やします。
    3. デカントボリュームが2×15 mLの遠心分離管に必要な（予め秤量）。優しく実際の分注量、渦を取得し、5 mlピペット（のみ無菌先端がチューブを入力してください）​​と過剰量を除去することによって、ボリュームをターゲットにする調整するためにチューブを秤量します。
    4. だったの完全な新鮮なSで14ミリリットルにボリュームを構成します時間線虫。遠心分離（1分、600 g）を得ました。線虫のペレットを乱さないように注意して上清を除去し、廃棄します。
    5. 30グラム/ L Eで完全なSの5ミリリットルを追加します。ペレット化した線虫の大腸菌 OP50。各チューブ内の5mlを30グラム/ L、Eとの完全な15ミリリットルSを含む円錐形のガラスフラスコに移し大腸菌 OP50。線虫が最初に食べ物を提供した時間を書き留めます。
    6. （160 rpm）で静かにフラスコを振って、10μLあたりの線虫をカウントし、約10（±2）の平均値を確認する（新鮮なヒントを毎回使用）顕微鏡スライド上に9×10μlの滴を取ります。
    7. 20℃、42〜44時間、160 rpmで振盪インキュベーターで線虫フラスコを置きます。
  4. 7日目の作業：転送は96ウェルプレートに線虫および薬物曝露を開始します。
    1. 、単一のフラスコに線虫の文化を組み合わせ軽くフラスコを旋回維持し、60 mlの滅菌トラフで線虫文化の3×4ミリリットルを配置します。振盪台（160 RPM）で谷を置きます。
    2. 8ちゃんを使用してくださいNELピペットは、平坦な透明底の96ウェル黒色マイクロタイタープレートのウェルあたり25μlの一時停止線虫をアリコートに（両方の発光と蛍光読み取りを行うための、または唯一の発光用白色プレート）。プレート蓋で覆い、脇に置きます。
      1. 後ごとに2枚のプレートの設定、失われたボリュームを交換するトラフ内の別の2×2.5ミリリットル線虫を置く（約7ミリリットルの谷に「デッドボリューム」を保ちます）。
      2. 線虫との13/14のプレートを設定します。 11線虫プレートを2枚の96ウェル薬物プレートを試験するために必要とされます。線虫のプレート番目 12は、制御等の車両を独占的にロードされます。 13 番目のプレートは、8日目にバックグラウンド蛍光を確立するために使用される（下記参照）。間違いがセットアップ中に発生した余分な板を使用するために調製することができます。
    3. 振盪インキュベーターで湿ったチャンバー内の各ウェルと場所のプレートへの完全なSのアリコート74μlの（素材リストを参照してください）​​（20℃、160 rpm）でUNT予め選択された発達時点でのアリコートの試験化合物を準備IL（提供食後例えば、45時間30分）。 【ウェルあたりのボリュームは現在99μlです]。
    4. 試験に薬剤プレート（単数または複数）を解凍します。
    5. ヒントを毎回変え、薬物と線虫のプレートを設定するためにマルチチャンネルピペットを使用してください。薬を小分けするために、96ウェルプレートあたり5分を許可します。
      1. 薬剤プレートの1 列目から1μLを取り、列線虫を含むプレートの1-5に追加します。列線虫を含むプレートの8-12への薬物プレートで2 番目の列から繰り返します。列6と線虫のプレートの7に車両の1μLを加えます。
        注：化合物/車両：100希釈の線虫のプレート中のウェルあたりの総容量は、1の結果を100μlになります。
      2. 第二の線虫のプレートの列1-5 / 8-12に薬剤プレートの第 3 / 第 4列の1μLを添加することにより、プロセスを繰り返し、列6と線虫のプレートの7に車両を追加します。
      3. 残りの薬剤プレートの列をテストし続けます。薬剤プレートのカラム12からサンプリングすることにより、すべてのウェルに車で1線虫プレートの最小値を設定します。バック湿ったチャンバ内で20〜22時間（20℃、160 rpm）を振盪インキュベーターに入れプレート（8日目のための注意を参照）。
    6. 翌日の発光バッファをパート準備：1％DMSOおよび0.15％トリトンX-100を取得するための完全なSの必要量にDMSOおよび10％トリトンX-100を追加します。発光のために読んでプレート当たり5ミリリットルに加え、1mlをルミノメーターインジェクタをプライミングするために許可します。
  5. 8日目の作業：実験的なエンドポイントを読む - 蛍光と生物発光。 （GFP蛍光測定値は、生物発光データを正規化するための手段として推奨されています。）
    注：記載された実験条件の下でかなりの子孫の生産を防止するために、線虫に提供食べ物後66〜67時間までに、エンドポイントを読むことを目指します。
    1. GFPの測定値のバックグラウンドコントロールとして使用するためにプレートを設定します。 C言語15ミリリットルチューブに13 番目のプレートからombineよく内容。線虫は（2-3分）を解決するために許可します。ウェルあたり100μlの細菌懸濁液をマイクロプレート（透明底部と黒）をロードするために上清を使用してください。
      1. 線虫を見ることができる井戸の下に注目顕微鏡下でのバックグラウンドコントロールプレートを観察します。その後のデータ分析に使用されるバックグラウンドの見積もりからこれらを除外します。
    2. バックグラウンドコントロールを含む各96ウェルプレートの蛍光を、お読みください。 （設定：プレートの底から光学; 485/20励起フィルター; 20分の528放射）。
    3. 発光測定値のためにバッファを準備します：ルシフェリン（20 mM）のパート準備するためのバッファを（前日から）を追加し、1％のDMSO（1×）、0.15％トリトンX100（3回）および0.3 mMのルシフェリン（3回発光バッファを取得します）。 150μlの発光バッファーで総理ルミノメーターインジェクタ6倍。
      1. 前のステップでは、薬物暴露中の車両として、1％DMSOを前提としています。車両が水である場合には、共調節3％（ すなわち、3回）に発光バッファー中のDMSOのncentration。
    4. 一度に一つのプレートで動作します。ウェル当たり50μlの発光バッファーを分注します。 （ウェル中の150μlの最終容量;発光バッファの3倍希釈：1％DMSO、0.05％トリトン-X100および0.1mMルシフェリン最終濃度）のプラットフォームを振っに即座に置き、タイマーを開始します。
      1. プラットフォーム（160 rpm）を振っに3分後、発光（測定あたり1秒）をお読みください。

4.データ解析

  1. 蛍光結果からの読み取りの平均GFPの背景を引きます。それぞれのGFP読み取りによって生物発光を割ります。
    1. 高いGFPの値が化合物に暴露された線虫のために検出された場合、任意の化合物の蛍光を考慮するためにそれ自体で化合物の蛍光を測定します。平均より高い場合は、代わりに背景として使用します。
  2. エクスプレス生物発光、GFP正規化された生物発光A各プレートにおける車両制御のための平均値の百分率としてND GFP蛍光データ。
  3. 各濃度の平均値を、エラーバーをプロットします。
  4. 「濃度」、「実験」、およびそれらの相互作用の効果と分散の2方向分析（ANOVA）を使用して統計的有意性についての試験（各データ点は、単一のウェルをいう）、およびポストホック検定（対としてダネット検定を使用して。車両制御）。
    注：「実験」または「相互作用」という用語は、有意である場合には、さらなる実験は、応答を確認するために必要とされ得ます。実験の間にばらつきがデータプロットの観察から明らかでない場合には、一方向ANOVAは、独立した実験からプールされたデータに対して実行することができます。
    1. 唯一の車両とプレート（S）の統計分析のために、列6 -7で全てのウェルと対照群として行Hにおける全てのウェルを選択します（これらは、日常的に化合物試験中の車両に割り当てられた位置です）。

結果

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方法を説明するための代表的な結果は、ロテノン（ 図1）、パラコート（ 図2）、オキサロ酢酸（ 図3）、および薬剤ライブラリ13（ 図4）のスクリーニングの間のようなホタルルシフェラーゼ阻害剤をピックアップし4の化合物について得られました。薬物暴露は、すべての場合において、L4段階で開始したが、食品は最初、他の化合物のために45〜46時間と比較して、線虫に提供した後、パラコート暴露実験は41時間で開始しました。プロトコルは、薬物暴露の開始と露出長のための時間の選択の自由度を可能にします。しかしながら、スクリーニング目的のために、時間は実験間の再現性のために、一度選択するために付着されるべきセット。エンドポイントは、ウェル内の子孫の大規模な産卵と孵化を防止するために、66〜67時間の発生時により測定されるべきです。タイミングのためのガイドラインは 、Tに提供されています1できます。

ロテノン、I阻害剤ミトコンドリア複合体は、ある範囲の濃度の両方の比較的短い（2時間）となりましたエクスポージャー（24時間）（ 図1）の後に生物発光を減少させました。この例では、何のGFPの測定が行われなかったが、技術的反復の数は、使用される（N = 6）をウェル3との間にワーム数の違いを均等に十分です。 24時間の曝露は、生物発光の減少に寄与することが期待された複合体Iの阻害の結果として、線虫が成長する時間の窓、と遅い開発です。これは、特に上記の20μM以上の濃度で、見遅延開発とステレオスコープの下で目視により確認しました。加えて、いくつかの致死率は40μM（定量化ではない定性的な観察）から注目されました。いいえ致死は、2時間の曝露後に観察されなかったが、ワームの動きへの影響が見られました。コントロールoccuに生物発光の相対の急激な減少ロテノンの最低濃度でRRED効果は簡単に2時間暴露で簡単に目視で検出されなかったために2.5μMを、テストしました。生物発光におけるこの減少は、減少した細胞のATPと一致しています。最大の阻害は、特にロテノンをターゲットに任意のその後の実験は、0〜5μM[濃度範囲0〜160μMの間で行われるべきであることを示す使用ロテノンの最低濃度（2.5μM）で達成されたが、他の薬剤との比較の一部として選択されまし​​た当初は10μMで有意な効果を有すると同定]（別の場所で公開されます）。

除草剤のパラコートは、活性酸素種の増加によってミトコンドリアの機能に影響を与えます。ここでは、Cの生物発光にその効果を実証24時間（ 図2）のための濃度範囲に暴露した後エレガンス株 PE254。株はLUC :: GFP融合を運ぶように、GFP蛍光は、ALSましたO正規化の手段として測定した。6,9パラコート大幅生物発光、GFP蛍光および正規化された生物発光を減少させました。ダンネットの事後テストは、車両制御に関連して有意な差とパラコートの濃度は生物発光と正規化された生物発光のための4と8 mMであっただけでなく、正規化された生物発光のための2 mMのことが示されました。大幅にGFP蛍光を減少させる唯一の濃度は8 mMの、成長の影響と時折死者ワームが見られたする濃度（定性観察）でした。生物発光（および正規化された生物発光）の減少は、ミトコンドリアの機能及びATP産生への影響を減少させたと一致した蛍光のそれよりも大きかったです。

C.上でテストされ、クエン酸サイクル中間オキサロ酢酸8mmの単一濃度でエレガンス株 PE254は、生物発光の増加（ 図3）につながりました。いいえ、GFP蛍光を発するありませんNCE測定が得られるか、または追加の目視観察を行いました。しかし、単一の濃度にそのような応答は、さらに濃度の範囲に確認露出、効果のより詳細な観察に値するだろう。それはATPの最終的に大きい生産で、クエン酸サイクルのより高い活性につながると仮定することができるように、この化合物による生物発光の増強は、（それにもかかわらず、それは、GFP蛍光を評価することにより、ルシフェラーゼのレベル上の任意の効果を制御することをお勧めし驚くべきことではありませんその後の実験で）。オキサロ酢酸のデータセットは、ルシフェラーゼベースの実験で見られる応答のばらつきの程度を明らかに示します。我々の経験では、このばらつきが特に少ない有害な露光条件のためのテスト・システムの機能です。

ホタルルシフェラーゼ阻害化合物DDD00001434、DDD0001477、DDD00000635とDDD00023047はPUへの影響を見て、 インビトロの両方を試験しましたrified酵素およびin vivoでのCを使用してエレガンスLUC：GFP発現株。試験した化合物のいずれかの露光条件の下で線虫の死亡を引き起こしたという証拠はなかったです。すべての4の化合物は、25および100μM（ 図4A）をテストした2濃度で、in vitroでのルシフェラーゼ活性に影響を与えました。 DDD00001434は、in vivoでの生物発光（ 図4B）の大幅な減少のための信頼できる正当性を提供する、ほ ​​ぼ完全に精製されたルシフェラーゼの活性を殺しました。直接比較できないが、 インビトロおよびインビボのアッセイ 、DDD00023047への応答は、両方のアッセイで同様でした。 DDD0001477とDDD00000635 は 、in vitroでより生体内で大きな減少を引き起こしました。これらの化合物は、22時間前にルシフェリン基質へのライブワームに提供し、その結果をルシフェリンになったときに、容易に、ルシフェラーゼ活性部位から置換されていないことを反映してもよいのAvaIlable。あるいは、DDD0001477とDDD00000635は、細胞ATPレベル上の付加的な効果を有することができます。これは、ホタルルシフェラーゼを含まない手段によって評価されなければなりません。注目すべきはDDD00000635を化合物に曝露ライブ虫におけるGFPシグナルの強い増強しました。これは、後述します。

figure-results-1
ミトコンドリア複合体1図Iは、ロテノンは、Cのエネルギー状態を減少させた阻害剤エレガンス株PE254の生物発光により測定される。同期のL4段階のワームを0、2.5、5、10、20、40、80と2の1％DMSO中の160μMロテノンにさらされる（45〜46時間のL1幼虫に与え食べ物後）時間（短い）、またはそれぞれ48で24時間（長時間露光）生物発光の前の測定値とウォーム開発の69時間食物を提供した後。生物発光（単位相対光単位、RLU）は、車両（1％DMSのパーセンテージとして表しました。O）の値。エラーバーは、各ロテノンの濃度で技術的反復のSEMを示している（N = 6）。試験した全ての濃度は、ビヒクル対照（p <0.001）との関係で非常に統計的に有意な差を生じました。

figure-results-2
酸化的ストレッサーパラコート2図は 、Cのエネルギー状態を減少させましたエレガンスは、（生物発光により測定）の濃度依存的にPE254株。同期L4段階のワームを（この例では便宜上41時間でL1幼虫に与え食品後）0、0.25、0.5、1、2、4又は8に暴露されました24時間ミリモルのパラコート。 GFP蛍光（単位相対蛍光単位、RFU）は、生物発光データ（RLU単位）、65時間の開発で得られた両方のエンドポイントを正規化するために使用しました。データを対照のパーセンテージ（1％DMSO）のように表現されます。エラーバーは、技術的反復のSEMを示しています（N =異なる濃度について5であり、n = 18コントロール用）。一方向ANOVA：車両制御に*** P <0.001相対。

figure-results-3
図3.クエン酸サイクル中間オキサロ酢酸（8 mM）をCの生物発光を強化しましたエレガンス株 PE254。同期のL4段階のワーム（L1幼虫に与えられる食物後45-46時間）がたて30分±18時間8ミリモルのオキサロ酢酸を準備するために曝露しました。生物発光（RLU単位）は63.5時間±1時間の発生時に読み込まれた車両制御（のddH 2 O）のパーセンテージとして表しました。別の列は、同じ実験内の別の96ウェルプレートに割り当てられた8技術的反復の異なるデータセットを表します。エラーバーは、技術的複製物のSEMを示している（N = 8）。 2ウェイANOVA要因としての「設定」と「集中」を持ちます：̵6;セット「P> 0.05、「濃度」はp <0.001との相互作用項p> 0.05。

A
figure-results-4
B
figure-results-5
ホタルルシフェラーゼ発光の既知の阻害活性を有する（DDD00023047：DDD00001434、C2：DDD0001477、C3：DDD00000635とC4 C1）ダンディー創薬化合物ライブラリー13から4化合物に対する応答の図4.テスト。 （A）（光単位、RLUとして測定）で精製ホタルルシフェラーゼの活性に対する化合物の効果を、ビヒクル対照のパーセンテージとして表しました。 ATP生物発光CLSIIキット（Roche、マンハイム、ドイツ）をウェルに分注しルシフェラーゼ酵素の同量（白色96ワットでの指示に従って使用しましたエルマイクロタイタープレート）。 ATP、10μMおよび化合物の1μlの最終濃度で提供された（最終濃度を示す）またはDMSO（1％）を添加しました。発光シグナルは10秒間統合されました。エラーバーは、技術的複製物のSEMを示している（N = 4）。分析：一元配置ANOVA; * P <0.05または*** P <車両制御に0.001相対。 、およびC2、C3のための重要な（それぞれDDD0001477とDDD00000635; P <0.05）。GFP蛍光に（B）生物発光のインビボ測定、正規化された生物発光と、C1た（p <0.001 DDD00001434）のために非常に重要な25および100μMの違いCの GFP蛍光22時間のための試験化合物への曝露後67時間発育時エレガンス株 PE254。エラーバーは、技術的複製物のSEMを示している（N = 8）。統計解析（片道-ANOVA）は、3つのデータセット（3 XN = 8）からのプールされたデータに対して実施。 * P <0.05または*** P <それぞれの車両制御に0.001相対。 DifferenC4（DDD00023047）への曝露後に正規化された生物発光のための25および100μMのみ統計学的に有意な（p <0.05）の間のCES。

時刻 1日目 2日目 3日目 4日目 5日目 6日目 7日目 8日目
9-10 ステップ5
10月11日ステップ5
11-12 ステップ4 ステップ5
12-13 ステップ4
13-14
14-15
15-16
16-17 ステップ1 ステップ3
17-18
18-19 ステップ2

プロトコルステップの表1の概要は、線虫の実験のそれぞれの日に（セクション3）を実施し、タイミングを示唆したことができます。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

モデル生物C.エレガンスは、強力な実験系を提供します。それは、文化に簡単で、（L4まで幼若幼虫L1を介して）大人の再生に卵から3.5日のライフサイクルと豊富な遺伝的に同一の子孫を生成します。 、その小さなサイズのために、それは、好都合には、化合物のスクリーニングを容易にする、96ウェルプレート中で増殖させることができます。我々は、Cの株に基づいて表現型スクリーニングプロトコルを提示96ウェルプレートルミノメーターおよび滅菌キャビネットが必要であるが、エネルギーレベルのインビボセンサーとして作用エレガンス 。14プロトコルは、任意の実験室に適用可能です。良好な研究室の技術を使用して、アッセイ内の汚染を防止することが重要です。手動で作業する場合は、達成可能な線虫板の最大数は、2×96ウェル薬物プレートの試験を可能にする二つの車両プレートを含む実験当たり13です。代表的な結果を私はrotenon阻害ミトコンドリア複合体のために提示されていますE、スーパーオキシド発生パラコート、クエン酸回路の中間オキサロ酢酸と知らホタルルシフェラーゼ阻害活性を有する4つの化合物。予測されるようにオキサロ酢酸は、ATPの大発生に起因する可能性が高い、強化につながったのに対し、最初の2つの化合物が生物発光の減少につながりました。オキサロ酢酸のデータセットは、レポーターとしてホタルルシフェラーゼに基づいて、実験における固有のばらつきを示します。 3つの独立した実験の最小値は、未知の化合物への応答の頑健性を確認することが賢明です。

ホタルルシフェラーゼ活性の阻害は、市販のキットを用いたin vitroアッセイと識別可能であった。3つの化合物の一つは、ホタルルシフェラーゼ酵素の活性に結合することによって、ルシフェラーゼ、GFPタグ付きのレベルを増加させる阻害剤と一致するGFP蛍光の大幅な増加をもたらしましたサイト、それはより安定したレンダリング。いくつかの例では15阻害剤が過剰基板によって変位したとき（この特定のケースではない）、これは生物発光のレベルの増加につながる可能性があります。15それは、減少または増加ATPレベルとしてホタルの酵素と相互作用する化合物から、誤って結果を解釈するのではなく、したがって、重要です/ミトコンドリア機能。発光信号の変化は、かなり頻繁にこのような動き、発展と成長のような健康の追加の測定と相関します。例として、生物発光信号の劇的な低下が検出された場合、化合物は、疑わしいルシフェラーゼ阻害剤であるが、ワームは、顕微鏡観察によりコントロールと区別できません。成長または化合物の自己蛍光では説明しないGFP蛍光の増加は、また、阻害剤を指してもよいです。ルシフェラーゼ阻害剤15の数が知られており、PubChemに入力されています。したがって、まず第一に、それはPubChemによって保持されたルシフェラーゼ阻害剤に関する情報を参照してくださいすることをお勧めします。トンが続きます精製酵素3および/ ​​または付加的な手段によってミトコンドリア機能に及ぼす影響の確認を用いたin vitroアッセイにおける化合物の効果のesting。16,17

（上述のように、一部のルシフェラーゼ酵素阻害剤の潜在的な検出）GFP蛍光測定が可能な場合、生物発光と一緒にこのエンドポイントを測定するための強力なケースを作るホタルルシフェラーゼレベルの検出を可能にします。 GFPと生物発光の測定値の正規化は、（これは、複数の技術的な複製を含めることによって達成することができますが）ウェル間ワーム数の変動の会計処理の手段です。より高い感度のためには、測定値からバックグラウンド蛍光を引くことが重要です。プロトコルは、しかし、線虫の自家蛍光は、任意の老化STUに特に重要で、（の現在のアッセイの限界を占めていない、バックグラウンドの蛍光に細菌懸濁液の寄与を評価します線虫の自家蛍光）は年齢とともに増加することを考えると死にます。試験化合物の自家蛍光も並行して評価されるべきです。研究者は、生物発光の導入遺伝子の発現のレベルの任意の歪みの差を制御するために、異なる遺伝的変異体、又は異なる遺伝子のサイレンシング後の細胞ATPプールを比較するためのプロトコルを適合させることを望む場合にGFPの正規​​化が必要不可欠と思われます。

プロトコル内の重要なパラメータは、露光が開始される発達段階、露出の長さを含み、別のウェル中で線虫の同様の番号を取得します。露出しかし、線虫の発生の任意の段階でのL3段階を開始することができ、または古いであることが好ましいです。ミトコンドリアDNA含有量、酸素消費量とATPレベルでは非常に顕著な増加によって証明されるように、この段階から、線虫は、大人になって開発のための酸化的リン酸化に依存している。18,19,20存在プロトコルは、博覧会を開始L4段階でURE。 （むしろ、最初L1段階で食品を提供した場合に比べて）が、この段階で、96ウェルプレートに線虫を小分けする理由は、プレートは、蒸発を最小限にするために、湿ったチャンバー内に配置されているが、蒸発の程度は未だで発生することです蓋の上に形成する微小な液滴として見られる私たちの振盪インキュベーター、（これは他の揺れインキュベータの問題ではないかもしれません）。ちょうど薬物標準を添加する前にプレートに線虫を分取することにより、実際の薬物濃度は、蒸発によるボリューム内の任意の小さな変化に影響されません。車で線虫のプレートをロードするだけで線虫が均等に井戸の間に分布していることが確認するのに便利です。車両のみ板に発見された有意差をウェルに線虫を分配するの貧しい技術の指標となるであろう。

露出の長さは考慮すべき重要な要因です。独立して成長のエネルギー状態への影響は、関心のある、プロであればトコールは、（例えば、ほぼ即時の応答から、2時間）より短い曝露に適応するように修正することができます。 C.への化合物の一方、エントリエレガンス組織は、いくつかの時間がかかることがあります。例えば、12-24時間は、レスベラトロールおよび5-フルオロ-2'-デオキシウリジン（FUDR）の最大内部濃度を達成するために必要とされる。 図21は、したがって、より長い曝露（18時間〜24）は、曝露レベルを最大にするために正当であり得ます。露光時間は、再生の有意なレベルが十分に場所を取ることはできません回に制限する必要があります。我々は、線虫の全発育時間は66〜67時間の下に保たれていることをお勧めします。便利なものの、線虫は、それまでに妊娠しているとegglayingを開始しています。それにもかかわらず、我々は、卵調製物からの生物発光測定値（図示せず）を無視できることがわかりました。 シュール5プロモーター駆動導入遺伝子発現は、100セルステージ 22とCで受精後2つだけ〜2時間半を最初に検出されましたhitinous卵殻は、ルシフェリンの進入を制限する可能性があります。その他は、孵化卵は妊娠成人の代謝に有意に寄与しなかったことを見出した。23が、かなりの子孫の生産を可能にする条件は避けるべきです。好適な場合には、実験的なタイムスケールが戻って移動させることができる：私たちは、以前に遅く、L3幼虫期（36時間）での環境毒素への暴露を開始し、55時間後に生物発光とGFPの測定を行った2代わりに、条件付きで滅菌されている遺伝的背景FER-15（B16）II例えばように、子孫の生成を防止するために使用することができます。 FEM-1 15℃に維持したが、25℃で無菌であることができる（hc17）IV二重変異体。24これは、それ自体では線虫の代謝に影響を与えることができるように無菌性を誘導するFUDRの使用は推奨されません。25アッセイ可能性また、このような部分喪失FUNCTとしてより透過性のキューティクルを有する株で実行すること多感応性薬物の浸透性を増加させる原因であるイオンバス8の変異体。26これは、より短い暴露および下部化合物濃度を容易にします。これらの線虫にルシフェリンを添加するための条件も発光緩衝液中の1％DMSOおよび0.05％のTriton-X100は、ルシフェリンの可用性を向上させるために必要とされないかもしれない、すなわち調整する必要があるかもしれません。

プロトコルは、化合物の送達のための媒体として、1％のDMSOを使用しています。致命的ではないが、DMSOのこの濃度は、我々が以前の出版物で説明したように、いくつかの生物学的効果を有する。3利用可能な薬物ライブラリの多くは、車両の希釈後に、細胞ベースのアッセイのために適切である濃度で、100％DMSO中で調製され0.1％です。より高い化合物濃度は、Cの応答を誘発するために必要とされていますそれ未満、1％DMSOでアッセイを実施することがしばしば不可能であるようなヒト細胞と比べてエレガンス 。ここでも、株を用いましたより透過性キューティクルは、車両のより低い濃度でテストにつながる可能性があります。 1％より高いDMSOの濃度が推奨されていません。

測定値の前にルシフェリンとセットインキュベーション時間はに付着する必要があります。以前に示したように、発光は次の30分1以上の発光のゆっくりと漸減が続く、最初の5分間は比較的安定した残り、ルシフェリンを追加した後、第2分以内に最大レベルに達しました。特定の化学物質への動的応答は、ルシフェリンの最初の分注後に30分間のこの初期の段階で行うことができます。

プロトコルは、線虫の集団の同期化を達成するために、卵の収集を以下の飢餓工程を含みます。異なる発達段階は、細胞のATPレベルが異なり、試験化合物に対して異なる応答することができるので、我々は、線虫試験集団の同期をお勧めします。 Sの完全に飢餓を行うことによりM9とは対照媒体として、ハッチング線虫は、その幼虫が発生しないので、炭素源（エタノール）が設けられているが、完全に飢えていません。27,28また、L1を逮捕したのは、食品への迅速な対応のためにプライミングされており、そのことが示されています食品が利用可能になった後、通常のL1の成長速度は、3時間以内に達成される。29しかし、飢餓工程は、Cの代謝を変化させてしまう可能性エレガンスを除外することはできません。飢餓の長さが24時間を超えてはならない。このため30（18時間は、同期のために十分です）。特定の研究室は、完全飢餓工程を迂回年齢同期のためCOPAS Biosorterを使用する可能性を有していてもよいです。他の研究室は、漂白前に固形培地（OP50とNGMプレート）上の線虫集団を拡大するための好み（ステップ3.1）を有することができ、これも問題なく動作します。我々は、線虫の培養のための標準培地、などの化合物の曝露の間に媒体Sを使用howeveRその他のメディアは、例えばK媒体またはEPA適度に硬水のために選択することができるが、多くの場合、環境毒性の研究のために使用される。31,32

プロトコルは、スクリーニングするおよびミトコンドリア機能に及ぼす影響の点で更なる試験のための候補を同定するための手段を提供します。一次スクリーニングの段階で、いくつかの化合物は、したがって、薬物の画面が完全なものではありません、のみによる1つの濃度が試験されることに見逃されている可能性が高いです。ヒットはC.、例えば酸素消費のためにミトコンドリア機能のさまざまな側面を評価するための技術の使用によって検証することができますエレガンスは、GFPを発現するミトコンドリアを有する菌株、ミトコンドリア膜電位、および/ ​​またはROSの測定のための汚れ。16,33,34の方法の最大の意義は、多細胞生物のレベルの化合物および/ ​​または条件の多数をスクリーニングするための手段を有することであり、そして重要なのは目の利点を活用できる​​ようにするために、Cの電子遺伝的扱い易作用機序を調査するエレガンス 。技術が加速し、興味深い化合物と標的の発見に新しい経路を見つけるのに役立つことがあります。これは、疾患関連の文脈における化合物ライブラリーのスクリーニングのためのヒトの疾患に関連する遺伝的背景とセンサーの組み合わせが提供する多くを持っていることが想定されます。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、開示することは何もありません

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は、ホタルのルシフェラーゼ阻害化合物DDD00001434、DDD0001477、DDD00000635、DDD00023047を寄付してくださったダンディー創薬ユニットのDavid Grayに感謝します。Tibor Harkani(ウィーン医科大学)は、試験化合物としてのオキサロ酢酸の提案に対して。チャーリー・ディア(アバディーン大学)イラスト。この研究は、BBSRC Pathfinder賞(BB/FOF/PF/4/11)とアバディーン大学によって資金提供されました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
オリオンIIマイクロプレートルミノメーターバートホールド検出システムインジェクターおよびSimplicity 4.2ソフトウェア付き、プレート測定
FLx800蛍光計Biotekwith Gen5 Software; プレート測定終了時にExcelにデータを転送
Ks 130 basic shakeking platformIka#0002980000
Innova 4349New Brunswick ScientificRefrigerated incubator shaker
Eppendorf centrifuge 5804REppendorfwith eppendorf rotor A-4-44 (50/15 Stripette
, CostarCorning#4489Serological pipette
Cellstar 50 ml tubesGreiner bio-one#227661
Cellstar 15 ml tubesGreiner bio-one#188261
Cellstar 60 mm tissue culture plates Greiner bio-one#628160
Superfrost Microscope slidesVWR#631-0909
滅菌ヘラCorning#3007; #3004for weighing out
chemicals 0.22 mM Millex GP filtersMillipore#SLGP033RS
Axygen eppendorf tubes 1.5 mlFisher Scientific#MCT-150-R
Corning 96 well assay plateVWR#3603蓋付きブラックプレート 透明底
Nunc 96 ウェルアッセイプレートFisher Scientific#236105蓋付きホワイトプレート
リザーバー試薬 60 mlThermo Scientific Finnpipette#9510027プロトコルセクション 4.4.1
Storage Box/damp chamberRoche Diagnostics#10 800 058 001174 x 101 x 56.6 mm、濡れたペーパータオルで湿ったチャンバーとして使用。蓋付きの2x 96ウェルプレートは、マイクロプレートの蓋の上に座っている下部を1つに収めることができます
漂白剤:次亜塩素酸ナトリウム溶液4-4.99%塩素含有量シグマアルドリッチ#2393054 でアリコートに保管します。°C, 塩素の損失を防ぐためのパラフィルムとのシール、ホイル
D-Luciferin、カリウム塩Biotium株式会社#10101-2の分子プローブで覆うまた供給者として使用することができる; ddH2Oの20 mMの在庫を準備して、-20 >アリコートのC <
Tween 20Sigma Aldrich# P9416
DMSOCalBiochem#317275純度 99.99%
Triton X100Alfa Aesar#A16046ddH2O
NystatinCalBiochem#475914
C. elegans 生物発光株で 10% に希釈筆者自身の研究室PE254、PE255は、染色体VおよびX上にそれぞれfeIs4およびfeIs5 [Psur-5::luc+::gfp; rol-6(su1006)]を統合配列しています。蛍光顕微鏡法(例えば15匹の線虫を選択)によりluc::GFPの均一で強い発現を選択します。
大腸菌OP50CGC
ジェネラルケミカルズ シグマ・アルドリッチ/フィッシャー・サイエンティフィック
、の最後にExcelにデータを転送 td colspan="4">[header]

参考文献

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