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方法論記事

腸によって脂質輸送を研究するためのCaco-2細胞を用いました

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DOI:

10.3791/53086

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2015年8月20日

 , 
1Department of Pharmaceutical and Biomedical Sciences, College of Pharmacy, California Northstate University, 2Department of Biomedical Sciences, James H. Quillen College of Medicine, East Tennessee State University

この記事について

サマリー

Caco-2細胞は、脂質の腸細胞輸送を研究するためのin vitroモデルとして役立つことができます、そして、脂質可溶性薬物/ビタミン。透過性メンブレンシステムは、基底外側コンパートメントから頂端を分離し、レンチウイルス発現システムは効果的な遺伝子過剰発現法を提供します。リポタンパク質の単離はTEMによって確認されています。

要約

食事性脂肪吸収の研究は、一般的にリンパカニューレを装備した動物モデルを使用して行われます。この動物モデルは、食事性脂肪吸収のin vivoモデルとして広く受け入れられていますが、関連する外科的技術は困難で高価です。動物モデルの遺伝子操作も費用と時間がかかります。代替のin vitroモデルは、間違いなくより手頃な価格で、時間を節約し、難易度が低いです。重要なことに、in vitroモデルにより、研究者は腸細胞を単離されたシステムとして調べることができ、生物モデル全体に固有の複雑さが軽減されます。この論文では、ヒト結腸癌細胞(Caco-2)が、脂質、脂質可溶性薬物、ビタミンの腸細胞輸送を研究するためのin vitroモデルとしてどのように役立つかについて説明します。Caco-2細胞の適切な維持とそれらの脂質混合物の調製について説明します。また、透過性メンブレンシステムを使用する貴重なオプションについてもさらに説明します。分化したCaco-2細胞は分極しているため、透過性メンブレンシステムを使用する主な利点は、基底外側コンパートメントから頂端を分離することです。その結果、脂質混合物を頂端コンパートメントに加えることができ、一方、リポタンパク質は基底外側コンパートメントから収集することができます。さらに、Caco-2細胞における遺伝子発現のアップレギュレーションにおけるレンチウイルス発現システムの有効性について説明します。最後に、この論文では、透過型電子顕微鏡(TEM)による腸管リポタンパク質の単離の成功を確認する方法について説明します。

概要

4 -食事脂肪の腸管吸収に関する研究、および脂溶性薬物とビタミンは、リンパ瘻モデル1を用いて、in vivoで行うことができます。しかし、関連する外科技術は、困難でなく、高価なだけでなく、です。糞便分析に基づいて、in vivoでのアプローチを利用することができるが、それらは、胃腸管2,5パーセントの取り込みを決定するために主に使用されています。この論文に記載のin vitroモデルは、よりコスト効果的であり、関係する技術は、おそらくあまり挑 ​​戦しています。遺伝的修飾研究は、時間がかかり、それらは、このin vitroモデルを使用して行われる場合に、より経済的かつ少ないです。

腸細胞によって取り込まれる脂溶性物質は、リポタンパク質6,7にパッケージ化されているので、リポタンパク質を生成するために、このin vitroモデルの有効性が重要です。二つの主要なintestinaLのリポタンパク質は、カイロミクロン及び超低密度リポタンパク質（VLDL）です。脂質は、胃腸内腔に豊富に存在する場合、直径が80nm以上とリポタンパク質として定義されるキロミクロンは、小腸により厳密に製造されています。彼らは最大のリポタンパク質であるため、カイロミクロンは考えられる最も効率的な脂質トランスポーターです。カイロミクロン8を生成することができる。このインビトロモデルは、食事の脂肪吸収、消化管による脂溶性ビタミンの吸収、および親油性薬物の経口バイオアベイラビリティを研究するために使用することができます。リポタンパク質画分中の脂溶性分子、ビタミン、または薬物の存在は、小腸によるその吸収の指標です。前述のように、このモデルは、経口バイオアベイラビリティ、親油性薬剤6を改善するために使用することができます。

本稿では、Caco-2細胞はどのように脂質マイル、透過膜または通常の組織培養皿で維持されるべきである方法を説明しますリポタンパク質の産生を刺激するための固定装置は、レンチウイルス発現系は、効果的な過剰発現を達成するために使用する方法、調製方法、および単離されたリポタンパク質を分析するべきであるべきです。

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プロトコル

のCaco-2細胞の1メンテナンス

  1. 正規の組織培養皿を用いて、
    1. 37℃の水浴中にバイアルを配置することによって、凍結バイアルからのCaco-2細胞を解凍し、直ちに予め温めた増殖培地（15％ウシ胎児血清（FBS、10 mlを含む10cmの組織培養皿に追加））ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で。
      1. （15分間）、それらが分離されるまで、37℃で0.05％3mlのトリプシン/ 0.53 mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）で細胞をインキュベートすることにより、6：たCaco-2細胞は、50〜70％コンフルエンスに達したときに、それらを1分割。細胞凝集を回避するために、穏やかなピペッティングにより細胞を数回混ぜます。予熱した増殖培地10 mlを入れた10cmの組織培養皿にトリプシン処理した細胞を0.5mlを加えます。
    2. 静かに左右方向に続く前後方向に皿を数回振ります。料理を旋回しないでくださいように、不等細胞分散をもたらすことができます。
    3. 5％CO 2を供給し、37℃のインキュベーターで平らな面に皿を置きます。傾斜面は、また、不等細胞分散をもたらすことができます。
    4. インキュベーションを開始した後、増殖培地1日を変更します。
    5. 細胞を監視し、それらがコンフルエンスに達する日を記録。細胞は、それらが分割された日から合流点に到達するのは約1週間かかります。
    6. 細胞がコンフルエンスに到達する前に週に二度、増殖培地を変更します。細胞がコンフルエンスに達した後は、一日おきに成長培地を変更します。細胞は、7日後にコンフルエントになったら、毎日の成長培地を変更します。
      注：彼らは13日後コンフルエント（ 図1）である場合、細胞が実験のための準備ができています。細胞は、最終的にリポタンパク質の生産にあまり有効になりますので、8コンフルエント後の13から17日間の間にあるセルを使用。実験を行う方法については、手順3に進みます。
  2. 透過膜システムを使用して
    1. ステップ1.1.1.1で説明したように、透過膜インサートでのCaco-2細胞を播種します。上記。その細胞増殖が（回復期）通常遅いため凍結バイアルから細胞を使用しないでください。簡単に説明すると、予め温めた増殖培地の10ミリリットルが含まれている頂端チャンバー（上部コンパートメント）にトリプシン処理した細胞の0.5ミリリットルを追加します。また、基底外側室（下部コンパートメント）に予熱した増殖培地の10ミリリットルを追加します。
      注：ベストプラクティスについては、側底チャンバーに最初にして頂端チャンバーに増殖培地を追加します。古いメディアを取り外すときは、頂端メディアの前に側底メディアを削除します。それが膜を破裂としてポリカーボネート膜を突っついは避けてください。
    2. によるポリカーボネート膜を介して、悪い細胞の可視性のために、同様の密度との定期的な組織培養皿中のCaco-2細胞を播種すると、細胞コンフルエンスを判断するためにこの料理を使用しています。
    3. のフォローTEPS上記1.1.2-1.1.6。

2.遺伝子の過剰発現

  1. 定期的なトランスフェクション法を用いて、
    1. 1.1.1.1.-1.1.4上記で説明したように組織培養皿上でのCaco-2細胞をシード。
      注：細胞が約40〜50％コンフルエントである場合、それらは、トランスフェクトされる準備ができています。
    2. マイクロチューブ中の還元血清培地の472μlにトランスフェクション試薬の67μlを添加します。管壁と希釈されていないトランスフェクション試薬との接触を避けてください。
    3. pLL3.7の23μgのトランスフェクション試薬/低血清培地混合物に緑色蛍光タンパク質（EGFP）9を強化加えます。
    4. RTで20分間混合物をインキュベートします。
    5. DMEM、10％FBSの8ミリリットルでのCaco-2細胞の増殖培地を交換してください。
    6. 滴下皿にDNA /トランスフェクション試薬/縮小血清培地の混合物を追加します。
    7. 軽く前方およびBaで料理を数回振ります左右方向に続くckward方向。
    8. 37℃のインキュベーターで皿を置きます。
    9. 成長培地10mlのインキュベーションを開始した後の日と皿の中でメディアを交換してください。
    10. 遺伝子発現を監視します。
      1. 4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）染色することなく、遺伝子発現をモニターします。蛍光顕微鏡を使用して、緑である細胞の割合を決定します。パーセンテージは、トランスフェクション効率を表します。
      2. DAPI染色と遺伝子発現を監視します。
        1. リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で3回細胞を洗浄します。
        2. PBS中の4％ホルムアルデヒド（室温で10分間のインキュベーション）を10mlを加えることにより細胞を固定します。
        3. PBSで細胞を3回洗浄します。
        4. 500 DAPI、1％BSA、0.01％ジギトニン：1を含む8mlのPBSで室温で15分間、暗所で細胞をインキュベートします。
        5. PBSで細胞を3回洗浄します。
        6. U蛍光顕微鏡を歌う、青色であるものに緑/青の相対的な（ 図2上部パネル）である細胞の数を決定します。計算された割合は、トランスフェクション効率を表します。
  2. レンチウイルス過剰発現システム10を使用して
    1. 15cmの組織培養皿（それらの増殖培地としてDMEM中10％FBS）中に種子ヒト胚腎臓（HEK）293T細胞。
      注：細胞が60〜70％コンフルエントである場合、それらは、トランスフェクトされる準備ができています。
    2. マイクロチューブ11に減少血清培地の1,133μlにトランスフェクション試薬の162μlを添加します。管壁と希釈されていないトランスフェクション試薬との接触を避けてください。
    3. トランスフェクション試薬/ RにpLL3.7のeGFP（または他の構造物）、のRev応答エレメント（RRE）の15.6μgの、REVの6.0μgの、および水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（VSVG）の8.4μgの24μgのを追加します。析出血清培地混合物。
    4. RTで20分間混合物をインキュベートします。
    5. DMEM、10％FBSを16 mlの増殖培地を交換してください。
    6. 滴下皿にDNA /トランスフェクション試薬/縮小血清培地の混合物を追加します。
    7. 静かに左右方向に続く前後方向に皿を数回振ります。それは、この時点で剥離しHEK293T細胞のいくつかを見るために、通常です。
    8. インキュベーターで皿を置きます。
    9. インキュベーションの24時間後、増殖培地を25 mlの皿の中でメディアを交換してください。
    10. 翌日、レンチウイルス（最初のコレクション）を含む増殖培地を収集します。
    11. より多くのレンチウイルス（第2集）を収集するための手順を繰り返し2.2.10。
    12. （5分間、2,500×gで）第一および第二の収集をプールし、遠心分離により細胞破片を除去。
    13. 使い捨てボトルトップフィルター（0.45μmの孔）を持つコレクションをフィルタリングし、RT（JA-20ローター）で2時間31,400×gでコレクションを遠心分離することにより、ウイルスを濃縮します。ペレットが配置されている遠心分離管の底部をマーク。上清を除去し、約15分間室温で反転チューブを残します。
    14. 1×PBS100μlのウイルス含有ペレットを再懸濁します。泡を避けます。
    15. -80℃で濃縮したウイルスを保管してください。凍結融解の繰り返しは避けてください。
    16. 滴定によってのCaco-2細胞を形質導入するために必要なウイルスの最適量を決定します。コストを節約するために、代わりに滴定のための10cmの組織培養皿の（増殖培地/ウェルの0.3ミリリットル）を24ウェルプレートを使用しています。
      1. 濃縮したウイルスの増加量を加える（0、1、2、5、10、25、50μL/ウェル）を40％〜70％コンフルエントのCaco-2細胞へのポリブレン（最終濃度=5μg/ mlの）を補充しました。 1.1.2で説明したように静かに24ウェルプレートを振ります。
      2. それらの遺伝子発現（ステップ2.1.10。）（ 図2下のを監視4パネル）。
    17. 導入遺伝子の発現は、一般的に維持されるので、将来の実験のために形質導入​​された細胞を維持し、継続的な遺伝子発現（ステップ2.1.10。）を監視します。

3.リポタンパク質分泌を刺激

  1. 定期的な組織培養ディッシュを使用して
    1. オレイン酸、レシチン40 mg及びタウロコール酸ナトリウム48mgの50mgを混合することにより、100Xの脂質混合物を準備します。 （8皿のための十分な）PBSで900μlにボリュームをもたらします。勢いよく脂質混合物をボルテックスし。
    2. 増殖培地の89.1ミリリットルに100Xの脂質混合物の900μlを添加します。混合し、脂質含有培地をフィルタリングします。オレイン酸、レシチン、およびタウロコール酸ナトリウムの最終濃度（1×）は、それぞれ2.0ミリメートル、1.36ミリメートル、および1.0 mMです。
    3. 細胞への脂質含有培地10mlのを追加します。
    4. 37で4時間脂質含有培地で細胞を培養しますCのインキュベーターを°。
    5. PBSで細胞を3回洗浄します。
    6. リポタンパク質の分泌を収集するために、細胞を増殖培地を10mlを加えます。
    7. 37℃のインキュベーターで2時間インキュベートします。
    8. リポ蛋白質含有培地を収集します。
  2. 透過膜システムを使用して
    1. 手順に従ってください3.1.1-3.1.2脂質混合物を調製しました。
    2. 頂端チャンバへの脂質含有培地10ml及び側底チャンバへの成長培地10mlのを追加します。
    3. 37℃のインキュベーター内で4時間インキュベートします。基底外側チャンバ内にリポ蛋白質含有培地を収集します。

4.リポタンパク質の分離（図3）

  1. 遠心分離（5分間2,000×gで）によってリポタンパク質含有培地から細胞破片を除去。
  2. 50mlのチューブにメディアをデカントします。
  3. メディアへの塩化ナトリウムの5.95グラムを追加します。
  4. SAの場合mpleはリポタンパク質の完全性を維持するために1プロテアーゼインヒビターカクテル錠を追加、TEMによって分析されます。
  5. 水で23ミリリットル（1.2グラム/ mlの濃度のNaCl溶液）にボリュームをもたらします。
  6. 完全に溶質を溶解させます。
  7. ポリカーボネート超遠心管にソリューションのすべてをデカント。
  8. ゆっくり水0.5ml（1.0グラム/ mlの濃度）と1.2グラム/ mlの濃度の溶液を重ねます。
  9. 体積重量ではなく、チューブのバランスをとります。
  10. ゆっくりT865ローターにチューブをロードします。
  11. 4℃で24時間、429460×gで超遠心機でサンプルをスピン。
  12. すぐに穏やかにピペッティングすることによって、トップ0.5ミリリットルの溶液を分離します。できるだけまだチューブを保管してください。

5. TEM分析

  1. 2％リンタングステン酸の5ミリリットル（V / W）を準備し、pHを6.0に調整します。
  2. シリンジフィルター（0.2μmの孔サイズ）で2％リンタングステン酸をフィルタリングします。
  3. 無菌皿にリポタンパク質サンプルの20μlのを削除します。
  4. 同じ皿に次のサンプルを濾過し、2％リンタングステン酸20μlのを削除します。
  5. ゆっくり鈍い側が試料上に載っているとEMグリッドをドロップします。
  6. 1分間室温でインキュベートします。
  7. ゆっくりグリッドからサンプルを除去するために、濾紙上のEMグリッドの側をタップします。
  8. ゆっくり鈍い側は2％リンタングステン酸で休んでEMグリッドをドロップします。
  9. 1分間室温でインキュベートします。
  10. ゆっくりグリッドからリン酸を除去し、濾紙上のEMグリッドの側をタップします。
  11. TEMを使用して、リポタンパク質（ 図4）の画像を取り込みます。

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結果

図 13日間コンフルエント後のCaco-2細胞1が表示され、正常な。ドーム状構造体の外観および細胞内脂質小滴は、分化したCaco-2細胞の特徴です。のCaco-2細胞を播種時に均等に分散されていないときは、皿の特定の領域に凝集し、過増殖う。任意の細胞を含まない皿の中のいくつかの領域が存在することになります。旋回および傾斜面に皿を置くことは避けるべきです。これは、新たな増殖培地は、あまりにおおよそ細胞に添加されたときに後コンフルエントのCaco-2細胞は、剥離を受けやすいことに注意することも重要です。そのため、新しいメディアは細胞の剥離を防止するために、穏やかに追加する必要があります。

これらの研究に基づいて、のCaco-2細胞のトランスフェクション効率は、30％〜60％（ 図2上パネル）の間でした。対照的に、レンチウイルス発現系を用いたCaco-2の形質導入効率は約100％であった（ 図2 下のパネル）。また

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ディスカッション

この論文では、使用できる2つのシステムは、Caco-2細胞は、すな​​わち、正規の組織培養皿や透過膜に記載されている維持します。透過膜システムを使用する利点は、頂端の分離および基底外側コンパートメント、および脂質混合物をインキュベートし、同時にリポタンパク質分泌を収集する能力を含みます。しかし、透過膜インサートは高価であり、それらのポリカーボネート膜は、良好な細胞の可視性を可能にしません。このin vitroモデルの利点の1つは、遺伝子操作の研究は、より経済的かつ時間のかかる少なくなるということです。より良い効果のために、レンチウイルス発現系を使用する必要があります。形質導入したCaco-2細胞は、一般に、それらの導入遺伝子の発現を維持します。

カイロミクロンを生成するためのCaco-2細胞の能力が最も重要です。この能力がなければ、のCaco-2細胞はefficieすることができませんntly親油性薬物、ビタミンA、D、E、およびK、ならびに任意の脂溶性栄養素を含むがこれらに限定されない、親油性材料を運びます。適切な方法は、VLDL粒子とカイロミクロンの両方が記載...

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開示事項

著者は開示するものは何もありません。

謝辞

この作業は、California Northstate University College of Pharmacy（AMNのSeed Grant Awardによって支援されました。著者は、この記事の出版費用を負担してくれたカリフォルニアノースステート大学薬学部と、この原稿の編集に協力してくれたGeorge Talbottに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
DMEMVWR16750-112細胞を追加する前に、個々の組織培養皿で増殖培地を温めます
FBSフィッシャー3600511私たちは熱不活化しません 私たちの血清
トリプシンVWR45000-660細胞はトリプシン治療の前にPBSで洗浄することができます 
透過膜システムフィッシャー720017310cmディッシュ、孔径3mm、ポリカーボネートメンブレン
10cmディッシュフィッシャー08-772-E組織培養ディッシュ
15cmディッシュフィッシャー08-772-24組織培養ディッシュ
24ウェルプレートフィッシャー12565163組織培養プレート
脂質ベースのトランスフェクション試薬フィッシャーPRE2691他のトランスフェクション試薬で代用可能
還元血清培地Invitrogen11058021トランスフェクション用
pLL3.7 eGFPAddgene11795https://www.addgene.org/11795/
Bottle-top filterFisher97611200.45 mm pore
PolybreneFisherNC984045410 mg/ml
オレイン酸Sigma01383-5G凍結融解サイクルを防ぐ
レシチン フィッシャーIC10214625エッグレシチン 
タウロコール酸ナトリウムフィッシャーNC9620276製品販売終了;代替カタログ番号:50-121-7956
プロテアーゼ阻害剤カクテル錠(EDTAフリー)フィッシャー5892791001主にTEM分析が必要なサンプルに使用
ポリカーボネート超遠心チューブフィッシャーNC9696153複数回再利用するとチューブが潰れます
超遠心チューブ用蓋フィッシャーNC9796914ローターからチューブ/蓋を取り外すにはツールが必要です
シリンジフィッシャー50-949-261使い捨て
シリンジフィルターフィッシャー09-719C細孔サイズ = 0.2 mm; ナイロン
リンタングステン酸フィッシャーAC2083102502% リンタングステン酸、pH 6.0
ピンセットフィッシャー50-238-62エクストラファイン強力なヒント
Formvar/カーボングリッドフィッシャー50-260-34Formvar/カーボンフィルム スクエアグリッド 400 銅

参考文献

  1. Drover, V. A., et al. CD36 deficiency impairs intestinal lipid secretion and clearance of chylomicrons from the blood. J Clin Invest. 115 (5), 1290-1297 (2005).
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